反相超效液相色譜—質譜聯(lián)用分離分析食用油中的甘油三酯

何榕　山曉琳　董方圓　許旭

摘 要 采用反相超效液相色譜-質譜聯(lián)用的方法分離分析食用油中的甘油三酯。使用總長40 cm的串聯(lián)超效C18色譜柱（10 cm+ 15 cm+ 15 cm），以乙腈-異丙醇（50∶50， V/V）為流動相，流速0.2 mL/min， 柱溫25℃，在大約74 MPa的高柱壓下分離，APCI離子化-質譜檢測。食用油以異丙醇溶解后直接進樣。實現(xiàn)了對食用油中甘油三酯組分的更精細區(qū)分，獲得了玉米油、大豆油、花生油、葵花籽油、稻米油、橄欖油和芝麻油等市售食用油中甘油三酯組成的譜圖。結果顯示，甘油三酯在相同食用油中的組成相似，而在不同食用油中的組成存在差異。采用本方法，通過差異的色譜峰可直接識別出大豆油中摻入的5%豬油。本方法為識別摻假食用油提供了有價值的途徑。

關鍵詞 反相超效液相色譜-質譜聯(lián)用； 甘油三酯； 食用油

1 引 言

三脂肪酸甘油酯（甘油三酯）由1個甘油分子與3個脂肪酸分子結合成酯而成，是食用油的主要成分。根據(jù)碳鏈的長度以及不飽和度，脂肪酸的種類可高達800余種。動物及植物油脂主要集中在含有0～3個雙鍵的C8～C26的直鏈脂肪酸，同時由于結合位置的不固定，導致了甘油三酯的種類相較脂肪酸更趨向于復雜多樣[1]。但常見動物油和植物油中主要存在的僅是含有C16和C18的甘油三酯，如脂肪酸為棕櫚酸（C16∶0，P）、硬脂酸（C18∶0，S）、油酸（C18∶1，O）、亞油酸（C18∶2，L）、亞麻酸（C18∶3，Ln）的甘油三酯。其它脂肪酸的甘油三酯含量普遍較低。

目前，在世界范圍內廣泛存在著食用油摻雜的問題，在中國尤以地溝油摻雜問題備受關注[2～4]，甘油三酯作為食用油的主要成分，對其進行分離分析是一個值得關注的研究方向。高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術（LC-MS）在分離分析甘油三酯方面具有獨特的優(yōu)勢，不同的液相色譜柱可以對甘油三酯形成不同程度的分離，高靈敏質譜檢測器為分離后的定性識別與定量分析提供了重要條件。目前，用于分析甘油三酯的質譜離子源有ESI與APCI兩種離子源。ESI源適用于檢測中等極性以及強極性的化合物，在使用ESI源時可利用多級質譜通過將甘油三酯分子打碎后得到的子離子峰，獲得對甘油三酯更好的定性分析結果[5，6]。通常使用ESI源時需要在流動相中加入鹽類才會有好的離子化效果[7～9]。APCI源適用于弱極性化合物的檢測，甘油三酯在APCI源中主要形成3種類型的碎片離子： ?；x子（RCO）+、單?；视碗x子（M+H-RCOOH-RCO）+和二?；视碗x子（M+H-RCOOH）+，根據(jù)這些碎片離子峰的特征，可以確定甘油三酯的結構[10～13]。

本實驗使用串聯(lián)長柱建立了超高效液相色譜-質譜聯(lián)用（UPLC-MS）分析食用油中甘油三酯組成的方法。與普通的HPLC分離相比，本方法可以簡便地對食用油中的甘油三酯實現(xiàn)更精細的分離分析，從而可根據(jù)不同食用油之間甘油三酯的精細差異，區(qū)分常見食用油，并可檢測摻入少量豬油的大豆油。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LCMS 2020型超高效液相色譜儀（日本 島津公司）， 包括脫氣機、兩個LC-30AD泵、 CTO-30A 柱溫箱、SIL-30AC自動進樣器、SPD-M20A二極管陣列檢測器及使用APCI源的質譜檢測器。數(shù)據(jù)分析軟件采用LabSolution software （version 5.53）。

三油酸甘油三酯、乙腈（HPLC級）、異丙醇（HPLC級）均購自國藥集團化學試劑有限公司。食用油樣品除豬油為自制外，其它均購自本地超市。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品及其準備

（1）液體樣品 移取10 μL樣品溶于1000 μL異丙醇中，濃度為1%（V/V），直接進樣。（2）固體樣品 稱取0.5 g溶解于50 mL正己烷中，濃度為1%（w/V），直接進樣。

2.2.2 色譜與質譜條件

液相色譜條件：Thermo Syncronis C18色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）與兩根月旭Ultimate UHPLC XB-C18（150 mm×2.1 mm， 1.8 μm）色譜柱串聯(lián)。流速為0.2 mL/min，流動相為乙腈-異丙醇（50∶50， V/V）等度洗脫。進樣量為1 μL。

質譜條件： APCI電離源， 正離子電離模式， 質荷比（m/z）范圍300～1050， 霧化氣流速2.5 L/min， 干燥氣流速5 L/min， APCI溫度250℃， DL溫度250℃， Heat 溫度200℃， 檢測器電壓1.05 kV。

3 結果與討論

3.1 實驗條件優(yōu)化

使用單根C18超效柱（Thermo Syncronis C18（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm））玉米油的LC-MS分離總離子流譜圖見圖1A。其中有6個甘油三酯的峰，根據(jù)所得到的質譜圖，推測出其主要的甘油三酯類型為峰1為LLLn；峰2可能包括LnSLn/LOLn/LLL；峰3包括PLL/POL/OLL，峰4包括POL/SLnO/OOL/SLL；峰5為POO/PLS/OOO/SLO/SLnS；峰6為SOO/SSL/POS。不同碳當量數(shù)（為碳數(shù)減去兩倍雙鍵數(shù)）的甘油三酯得到了很好的分離，但根據(jù)峰2，3，4，5，6可以推測，多種擁有相同碳當量數(shù)而雙鍵數(shù)不同的甘油三酯依然無法分離。改用3根C18超效色譜柱串聯(lián)分離玉米油得到的色譜圖見圖1B，原先未完全分離的峰2，3，4，5，6又分離出多個甘油三酯的峰。

由圖1B可見，在玉米油中共分離出了13個峰，其中9個較大的峰可以根據(jù)其質譜圖推測出其甘油三酯的結構，分別為：LLL，OLL，PLL，OOL，POL，PPL，OOO，POO，PPO。

考察流動相、溫度以及流速對玉米油分離和柱壓的影響（表1）。增加流動相中異丙醇的量可以減小保留時間，但分離（Rs為OOL與POL兩峰之間的分離度）變差，系統(tǒng)的壓力也較大；當流動相為40%異丙醇時，分離度很好且壓力也較低，但出峰時間太長。溫度增高， 保留變小，但分離度下降，顯示降低溫度有益于甘油三酯的分離。由于常溫條件 （25℃） 下可以實現(xiàn)很好的分離，故本實驗選擇25℃。增大流速有利分離，但流速在0.25 mL/min時壓力已達95 MPa，因而流速選擇0.2 mL/min。endprint

綜上所述，本實驗選用UPLC的實驗條件為：流動相為50%異丙醇、流速0.2 mL/min、柱溫25℃，此時分離度約為3.82，系統(tǒng)壓力約為74 MPa。

實驗中，質譜條件APCI溫度、DL溫度及Heat 溫度的改變對結果有較大影響，升高APCI源溫度時， 信噪比很差； 溫度降低則會不出峰。本實驗直接選取儀器自動調諧后的APCI溫度、DL溫度以及Heat 溫度進行實驗。

3.2 重復性、線性關系與檢出限

使用1%（V/V）三油酸甘油酯樣品，按2.2節(jié)進行操作，并分別重復5次，計算得到1%（V/V）三油酸甘油酯組分峰面積的相對標準偏差（RSD）為4.9%。

使用2.2節(jié)方法分別配制濃度為0.05%～1%（V/V）的三油酸甘油酯樣品進行分析，得到峰面積-濃度的線性方程為y=1.07×107+2.06×108x，相關系數(shù)0.9987。以0.01%（V/V）三油酸甘油酯為樣品分析得到的信噪比（S/N）為5.48，顯示本方法對三油酸甘油酯的檢測限低于0.01%（V/V）。

3.3 食用油樣品的分析

3.3.1 不同廠家玉米油的分析

圖2顯示了不同廠家玉米油的分析結果。從圖2可見，相同的玉米油擁有相似的甘油三酯類型和含量，僅在某些峰的面積上存在細微差別。

3.3.2 不同種類食用油的分析 不同種類的食用油之間顯示出一些明顯的差異，如圖2的玉米油與圖3中的花生油、葵花籽油、稻米油、橄欖油和芝麻油，以及圖4中大豆油的譜圖。不同種類食用油之間

在甘油三酯得到精細分離后存在明顯區(qū)別，其中橄欖油與其它食用油之間的區(qū)別最為明顯，而大豆油與玉米油之間的區(qū)別最小。

放大玉米油和大豆油的總離子流譜圖進行比較（圖4）?？梢钥闯?，大豆油在保留時間22和29 min左右有兩個峰明顯大于玉米油相應位置的峰，其峰強度相差超過10倍。在27 min附近（圖中虛線），玉米油有兩個峰，而大豆油有5個峰；在35 min左右，玉米油和大豆油有相似的4個峰；在42～50 min，玉米油和大豆油都有明顯的4個峰，但45 min的峰具有不同的面積（圖中大豆油該峰的保留時間有少量延遲）。因此， 可以通過保留時間在22和29 min的峰識別兩種相似的食用油。其它差異較大的食用油可以更容易地在圖2、圖3和圖4中識別出特征。這為不同食用油的區(qū)分和識別提供了條件。

因此，可以認為，在對甘油三酯組分UPLC-MS精細分離的情況下，相同食用油之間甘油三酯組分的分布和含量差異不大，而不同食用油之間則存在可供識別的差異，其中動物油與植物油之間的差異很大。推測這種甘油三酯之間的差異可能與食用油來源的種屬差異及其存在的酯酶差異有關。

3.4 玉米油/大豆油中摻雜豬油的檢測

考慮到潲水油和劣質動物油兩類地溝油中均會存在摻入動物油的情況，本研究利用動物油與植物油之間的明顯差異，以常用的玉米油以及大豆油中加入不同比例的豬油為樣品，采用2.2 節(jié)的方法對其進行分離分析，結果見圖5。峰B和E在豬油中具有特征性，在玉米油和大豆油中通過比較峰A和B之間的高度比，選擇峰高比A/B=1.0為指標，可以識別摻雜10%豬油。而通過比較玉米油中峰C和E的高度以及大豆油中D和E的高度，選擇峰高比C/E=1.0和峰高比D/E=1.0為指標，在摻雜5%豬油時仍可看出與不含豬油的大豆油存在差異。選取100%玉米油中峰A和峰B的峰高的比值A/B、以及峰C和峰E的峰高比值C/E， 大豆油中同樣選擇A/B、以及峰D和峰E的峰高比值C/E， 計算的數(shù)據(jù)見表2。在玉米油中摻雜了豬油以后，無論是A/B還是C/E都會相應增加，且C/E增加的更多。豆油在摻雜了豬油后，同樣的A/B和D/E也是有相應的增加，D/E增加的幅度也更大。因此，通過選擇“峰高比為1.0”這個指標，可實現(xiàn)10%豬油摻雜玉米油的識別以及5%豬油摻雜大豆油的識別。因此，根據(jù)對不同食用油品種差異的研究，可通過建立特定食用油中摻入其它食用油的鑒別方法，實現(xiàn)對摻假食用油的準確識別。

4 結 論

采用3根超高效色譜柱串聯(lián)的方法，使用UPLC-MS， 在高柱壓下對食用油中的甘油三酯進行了分析。有文獻提出增大柱壓有利于脂類化合物分離[14]，本研究將3根色譜柱串聯(lián)，也在高柱壓的條件下獲得了較好分離，由原來單根色譜柱的6個峰改進到串聯(lián)后的13個峰，使擁有同分異構的部分甘油三酯也得到了分離。通過對不同廠家及不同種類食用油的分析，顯示同種食用油之間的差別很小，而不同種類的食用油之間差異明顯。對摻雜豬油的分析結果顯示， 5%豬油摻雜大豆油可以被識別。

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