基于PCR－RFLP技術(shù)的苯硫脲嘗味的群體遺傳學(xué)分析*

王曉博，楊 麗

(內(nèi)蒙古大學(xué))

0 引言

苯硫脲(phenylthiocarbamide，PTC)是一種白色結(jié)晶狀化合物，由于含有N－C=S基團(tuán)，呈苦澀味［1］.人類對(duì)苯硫脲的嘗味能力具有顯著的遺傳學(xué)特征［1］，人 PTC苦味的嘗味能力由7號(hào)染色體上(7q35－7q36)的一種苦味味覺(jué)感受器基因TAS2R38決定，該等位基因符合孟德?tīng)栠z傳性狀，屬于常染色體不完全顯性遺傳，可以采用閾值法測(cè)定苯硫脲的嘗味敏感性［2－4］.絕大多數(shù)嘗味者與味盲者的區(qū)別在于三處單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs).味盲者的PTC編碼區(qū)有五個(gè)限制性內(nèi)切酶Fnu4H1的識(shí)別位點(diǎn)(識(shí)別序列5＇－ GC↓NGC–3＇)，如果是嘗味者，則其第785位SNP恰好形成了一個(gè)額外的Fnu4H1識(shí)別位點(diǎn)(GCTGC).因此可以利用這個(gè)SNP造成的限制性位點(diǎn)多態(tài)性，設(shè)計(jì)引物，克隆該基因，酶切電泳確定并驗(yàn)證基因型［5］.

1 調(diào)查對(duì)象與實(shí)驗(yàn)材料

1.1 調(diào)查對(duì)象

受試者為在校大學(xué)生，年齡為20～23歲，共120人，其中男生40人，女生80人.

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 基因型檢測(cè)材料

受試者用滅菌牙簽刮取口腔上皮細(xì)胞，用于提取目的基因;PCR引物委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物303bp;

上游引物:hPTC Forward5’－aactggcagaataaagatctcaatttat－3’

下游引物:hPTC Reverse5’－aacacaaaccatcacccctatttt－3’

1.2.2 試劑和工具酶

苯硫脲 (PTC)結(jié)晶，dNTPs，Tris堿，Na2EDTA·2H2O，蛋白酶K，溴化乙錠，瓊脂糖，100 bp DNA ladder Marker，滅菌超純水等，Taq DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶Fnu4H1等.

1.3 方法

1.3.1 試劑的配制

稱取苯硫脲結(jié)晶與超純水制成濃度梯度依次為 1/1500、1/3000、1/6000、1/12000、1/24000、1/48000、 1/96000、 1/192000、 1/384000、1/768000、1/1536000、1/3072000、1/6144000 的14種PTC溶液，標(biāo)號(hào)1～14，過(guò)濾滅菌;另取蒸餾水作為第15號(hào)液.

1.3.2 PTC 嘗味能力的測(cè)定

用滴管滴3～4滴14號(hào)液于受試者舌根部，讓其嘗味，之后用蒸餾水做同樣試驗(yàn);受試者若不能準(zhǔn)確鑒別兩種溶液的味道，則用13號(hào)溶液重復(fù)試驗(yàn)，(按濃度遞增以此類推)直至能明確鑒別出PTC的苦味為止;當(dāng)受試者鑒別出某一號(hào)溶液時(shí)，用此號(hào)溶液重復(fù)嘗味3次，若結(jié)果相同時(shí)，則記錄此時(shí)的濃度等級(jí)號(hào)，若受試者直到1號(hào)液仍嘗不出苦味，則其嘗味濃度等級(jí)定為＜1號(hào).

1.3.3 人口腔上皮細(xì)胞總DNA的提取

在1.5 mL滅菌離心管中加入200 μL緩沖液Chelex;受試者用無(wú)菌牙簽輕刮口腔腮內(nèi)側(cè)，刮下來(lái)的細(xì)胞在緩沖液中漂洗;加2 μL蛋白酶K，蓋蓋顛倒混勻，56℃水浴30 min;冷卻室溫，渦旋振蕩器渦旋振蕩混勻10 s;離心機(jī)13200 rmp瞬時(shí)離心10 s;沸水浴中煮沸8 min;渦旋振蕩器渦旋振蕩混勻20 s，離心機(jī)13200 rpm離心3 min;基因組DNA于4℃保存?zhèn)溆?

1.3.4 PCR擴(kuò)增PTC基因片段及檢測(cè)

PCR產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆?將PTC基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照.1.3.5 PTC基因PCR產(chǎn)物酶切及電泳檢測(cè)

將PTC基因PCR產(chǎn)物37℃恒溫Fnu4H1酶切3h或過(guò)夜，酶切產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆?分別依次加入 100 bp DNA ladder Marker對(duì)照，10 μL PCR產(chǎn)物對(duì)照，電泳50 min;凝膠EB染色后，放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照.

表1 120名學(xué)生PTC嘗味能力測(cè)試結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 PTC嘗味能力分布

120名學(xué)生PTC嘗味閾值統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1，圖1、圖2為PTC嘗味能力分布圖.從圖中可以看出，PTC嘗味能力呈雙峰分布，且雙峰性十分明顯，雙峰間的谷底是6號(hào)溶液處，故確定第6號(hào)液為味盲界限.不能嘗出6號(hào)溶液及以上(＜6)者為味盲，共檢出 14人，味盲率為11.67%，其中不能嘗出1號(hào)溶液的6人，占全部味盲總數(shù)的42.86%，峰值在 ＜1位置;能嘗出6～14號(hào)濃度的為嘗味者，共106人，占88.33%，閾值集中在7～9號(hào)濃度范圍內(nèi)，峰值在9號(hào)處.嘗味者中以7號(hào)至10號(hào)為嘗味者雜合體，檢出101人;11～14號(hào)為純合體，檢出5人.嘗味者平均嘗味閾值(±SD)為7.900±1.6886.

圖1 PTC嘗味能力測(cè)試結(jié)果(按性別劃分)

圖2 PTC嘗味能力測(cè)試結(jié)果(按地域劃分)

2.2 性別與PTC嘗味能力的關(guān)系

苯硫脲味盲基因存在于7號(hào)常染色體上，因此從理論上講，男、女味盲率應(yīng)該沒(méi)有顯著差異，但文獻(xiàn)報(bào)道，女性味盲率高于男性［6－7］.在收集的資料中，從表1可以看出，40名男生中，嘗味者34人，平均閾值為7.5500±1.0720;味盲者6人，占15%;80位女生中，嘗味者72人，平均閾值為8.075±2.2460;味盲者 8 人，占 10%.女生味盲率(10%)較男生味盲率(15%)偏低，此現(xiàn)象的原因可能與男女兩性舌部的解剖學(xué)差異相關(guān)，平均而言，女性比男性具有更多的蕈狀味蕾、有更多的味孔，所以女性與男性相比對(duì)PTC苦味更加敏感［8－9］.此外，男女嘗味者平均閾值的差異，經(jīng)t檢驗(yàn)，t=1.28 ＜2.5，無(wú)顯著性差異.男女味盲率的差異經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P＞0.05，也無(wú)顯著意義.這說(shuō)明，PTC味盲與性別的關(guān)系不大.

2.3 不同民族PTC嘗味能力的測(cè)定

研究發(fā)現(xiàn)人類苯硫腺嘗味多態(tài)性有種族及民族差異，國(guó)內(nèi)曾報(bào)告過(guò)一些少數(shù)民族的群體資料［10］，不同民族人群甚至同一民族在不同地區(qū)對(duì)PTC的嘗味能力不同［11］.筆者檢測(cè)的120人中有蒙古族15人，女生14人，男生僅1人，PTC嘗味能力分布域?yàn)?～10號(hào)液，分別為1，2，10，2人，平均閾值為8.8667 ±0.7180;味盲率為 0.漢族有105人，男生39人，女生66人.PTC嘗味能力分布在1，2，5，6，7，8，9，10，11，13，分別為 6，1，3，4，30，10，39，7，4，1 人，平均閾值為7.7619 ±2.2362.味盲率為13.33%，經(jīng)t檢驗(yàn)，t=3.52 ＞2.5，平均閾值有顯著性差異.味盲率差異極顯著.由此初步可知，蒙古族和漢族PTC嘗味能力有差別.筆者認(rèn)為蒙古族起源的非均一性和歷史上蒙、漢族長(zhǎng)期的基因交流，可能是導(dǎo)致這種情況的重要原因［12］.但由于蒙古族樣本容量太小，因此統(tǒng)計(jì)結(jié)果的可靠性有待進(jìn)一步確認(rèn).

2.4 地理位置與PTC味盲的關(guān)系

據(jù)肖春杰［13］等報(bào)道，味盲基因在我國(guó)分布有明顯規(guī)律，即華南地區(qū)味盲基因頻率最低，而西北地區(qū)，尤其新疆北部地區(qū)的味盲基因頻率最高，其差異幅度相當(dāng)大.PTC嘗味能力在不同地理位置分布見(jiàn)表1.120名大學(xué)生中，內(nèi)蒙古籍學(xué)生(區(qū)內(nèi))有 72人，味盲者 13人，味盲率18.06%;省外的學(xué)生有48人，檢出味盲者1人，味盲率2.08%;區(qū)內(nèi)和區(qū)外的味盲率有顯著的差異性，由于區(qū)外的同學(xué)均為東部，而內(nèi)蒙古地處西部，因此，基本說(shuō)明PTC味盲與地理位置有一定的關(guān)系，由于所取的樣本容量太小，不能夠有力的說(shuō)明東部地區(qū)味盲率要遠(yuǎn)比西部地區(qū)低.

2.5 群體的甚因頻率和基因型頻率

由表型判斷，群體共120人，基因型為TT的5人，Tt的為101人，tt的為14人.則群體的基因型頻率為:

TT的頻率為:P2=5/120×100%=4.17%

Tt的頻率為:2pq=101/120×100%=84.17%

tt的頻率為:q2=14/120 ×100%=11.66%

由此，T基因的基因頻率為:P=f(T)=f(TT)+1/2f(Tt)=4.17%+84.17%/2=46.255%，t基因的基因頻率為:q=1－P=1－46.255%=53.745%.

根據(jù)Hardy－Weinberg公式計(jì)算出隱性基因t的頻率為

T基因的基因頻率為p=1－q=1－34.15%=65.85%.

χ2值為 =0.17，自由度df=1，當(dāng)p=0.05，查表得 χ2=3.84 ＞0.17，統(tǒng)計(jì)學(xué)認(rèn)為在 5%顯著水平上差異不顯著，觀察數(shù)與理論數(shù)無(wú)明顯差異，即證明本群體處于遺傳平衡，且味盲基因頻率為34.15%，與鄭連斌［14］等測(cè)定的內(nèi)蒙古蒙、漢兩族的PTC味盲基因頻率接近，但略微偏高，但低于莊振西［15］等測(cè)定的蒙古族、漢族和朝鮮族青少年的味盲基因頻率，更低于白人的基因頻率.

2.6 PTC酶切電泳檢測(cè)圖譜分析

對(duì)照DNA ladder Marker的指示條帶位置，查看PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的泳道中各有幾條帶.PCR產(chǎn)物預(yù)期只有一條約300 bp的帶.酶切產(chǎn)物中如果只有一條與PCR產(chǎn)物同樣位置的帶，說(shuō)明是tt純合體(303 bp);如果只有兩條帶，一條暗淡，在前方較遠(yuǎn)處(64 bp)，另一條明亮比PCR產(chǎn)物帶稍靠前(238 bp)，說(shuō)明是TT純合體;如果有三條帶，一條明亮、與PCR產(chǎn)物位置相同，另一條比PCR產(chǎn)物帶稍靠前，還有一條暗淡、在前方較遠(yuǎn)處，則說(shuō)明是Tt雜合體.下面僅展示部分PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果(如圖3所示)，來(lái)驗(yàn)證前文PTC嘗味的結(jié)果.所有對(duì)象的基因型都得到PCR－RFLP的驗(yàn)證，與由表型得到的結(jié)果基本一致.

圖3 PCR產(chǎn)物(左)和酶切產(chǎn)物(右)的電泳結(jié)果

3 小結(jié)

該調(diào)查群體中，味盲基因(t)頻率為0.3415，味盲率為11.67%，比我國(guó)平均味盲率8.28%高［16－17］，男女生味盲率分別為 15% 和 10%，二者比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明，PTC味盲與性別的關(guān)系不大.但由于實(shí)驗(yàn)對(duì)象來(lái)自不同的地區(qū)，又屬于不同的民族，通過(guò)計(jì)算得出PTC味盲與民族和地理位置有關(guān).所有對(duì)象的基因型都得到PCR－RFLP的驗(yàn)證，與由表型得到的結(jié)果基本一致，這就排除了由嘗味錯(cuò)誤所產(chǎn)生的偶然誤差，使結(jié)果更可靠.

［1］沈海娥，陳晶，趙杰，等.河北省漢族大學(xué)生苯硫脲嘗味能力測(cè)定與分析［J］.河北聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2013，03:303－304.

［2］Bernd Bufe，Paul A.S.Breslinet al.The Molecular Basis of Individual Differences in Phenylthiocarbamide and Propylthiouracil Bitterness Perception［J］.Current Biology，2005:154.

［3］Guo SW，Shen FM et al.Threshold distributions of phenylthiocarbamide(PTC)in the Chinese population.［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，1999:855.

［4］Akcasu A，Ozalp E.Distribution of taste thresholds for phenylthiocarbamide among different age groups in Turkey ［J］.Pahlavi medical journal，1977:83.

［5］Borum Sagong，Jae Woong Baeet al.Multiplex minisequencing screening for PTC genotype associated with bitter taste perception［J］.Molecular Biology Reports，2014:413.

［6］Filiptsova I A，Timoshyna，et al.The population structure of Ukraine in relation to the phenylthiocarbamide sensitivity［J］.Egyptian Journal of Medical Human Genetics，2014.

［7］Grunwarl P，Herman C.Distribution of taste sensitivity for phenylthiocarbamide in Yugoslavia.［J］.Nature，1962:194.

［8］陳建國(guó)，張亮，沈福民，等.味覺(jué)生理與味覺(jué)行為［J］.中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，1998(3):76－78.

［9］Guo Sunwei，Danielle R.Reed.The genetics of phenylthiocarbamide perception［J］.Annals of Human Biology，2001:282.

［10］徐玖瑾，毛鐘榮，李紹武，等.中國(guó)不同民族中苯硫脲味盲基因頻率的研究［J］.遺傳學(xué)報(bào)，1982(4):308－314.

［11］趙淑娟，龐有志，楊又兵，等.苯硫脲(PTC)味盲基因頻率的測(cè)定與分析［J］.河南科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2005(2):97－98.

［12］馬慰國(guó)，李靜宜，周德華，等.1476例回族苯硫脲味盲頻率的比較分析［J］.遺傳，1987(5):34－35.

［13］肖春杰，Cavalli－Sforza L L，EMinch，等.中國(guó)人群的等位基因地理分布圖［J］.遺傳學(xué)報(bào)，2000(1):1－6.

［14］鄭連斌，陸舜華，王雙喜，等.內(nèi)蒙古蒙、漢民族PTC味盲基因頻率［J］.遺傳，1991(4):34.

［15］王惠孚，王貴琛，莊振西，等.500例漢族青少年P(guān)TC嘗味能力測(cè)定［J］.錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1980(3):20－23.

［16］劉繼云，楊春玫，孫建永，等.1016名學(xué)生PTC嘗味能力基因頻率的調(diào)查［J］.張家口醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001(1):55－56.

［17］Prodi D A，Drayna Det al.Bitter taste study in a sardinian genetic isolate supports the association of phenylthiocarbamide sensitivity to the TAS2R38 bitter receptor gene.［J］.Chemical Senses，2004:298.