不同甜酒曲中可培養(yǎng)真菌的多樣性分析

姚淑敏，閆華文，陳　璐（曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

不同甜酒曲中可培養(yǎng)真菌的多樣性分析

姚淑敏，閆華文，陳璐
（曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

用可培養(yǎng)的方法對(duì)6種甜酒曲中的真菌進(jìn)行分離篩選，共分離得到25株酵母菌和13株霉菌，利用26S rDNA序列分析對(duì)酵母菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，其分屬于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibu1igera）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orienta1is）和克魯維畢赤酵母（Pichia k1uyveri）。利用ITS rDNA序列分析對(duì)霉菌菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，13株霉菌分別為米根霉（Rhizopus oryzae）、小孢根霉（Rhizopus microsporus）、小孢根霉華變種（Rhizopus microsporusvar.chinesis）、小孢根霉須狀變種（Rhizopus microsporusvar.rhizopodiformis）、印度毛霉（Mucor indicus）和卷枝毛霉（Mucor circine11oides）。

可培養(yǎng)真菌；26S rDNA；ITS rDNA；甜酒曲

甜酒曲（甜酒藥）是發(fā)酵甜酒釀的發(fā)酵劑。我國(guó)用曲制酒工藝由來已久，并且影響深遠(yuǎn)，日本學(xué)者坂口謹(jǐn)一郎先生將用曲制酒這一工藝與我國(guó)古代的四大發(fā)明相媲美［1］。最原始的甜酒曲一般以蒸煮的谷物以及各種輔料為主，添加辣蓼草，接種環(huán)境中的霉菌和酵母菌等多種微生物自然發(fā)酵而成［2-3］。隨著科技的進(jìn)步，制曲工藝也進(jìn)一步提升，可以人為的控制接種的菌種類別進(jìn)而制得不同風(fēng)味的甜酒釀。由于純種根霉曲和現(xiàn)代工業(yè)制曲菌種比較單一，因此性質(zhì)穩(wěn)定，制得酒釀質(zhì)量穩(wěn)定、口感單一；民間曲微生物種類繁多且不穩(wěn)定，發(fā)酵的甜酒釀口感醇厚，風(fēng)味獨(dú)特，酒味較為濃厚，但是由于性質(zhì)不穩(wěn)定，發(fā)酵工藝不便于控制，大批量發(fā)酵生產(chǎn)因此受到限制［4］。正是由于酒曲的種類不同進(jìn)而導(dǎo)致了不同甜酒釀風(fēng)味的差異，因此酒曲又被譽(yù)為“酒之骨”［5］。

在亞洲許多地區(qū)，用發(fā)酵劑來發(fā)酵酒精類飲料和相關(guān)食物已經(jīng)具有多年歷史［6-7］，只是發(fā)酵劑的名稱因地而異，如印度的“Hamei”就是一種天然的起始發(fā)酵物，以糯米為原料，拌入“Hamei”發(fā)酵制得的酒精飲料酒類似于中國(guó)的米酒。除此之外，印度尼西亞的“Ragi”、錫金的“Macha”、韓國(guó)的“Nuruk”、菲律賓的“Budob”、坦桑尼亞的“Togwa”都與中國(guó)的甜酒曲類似［8］。

甜酒釀發(fā)酵不是一種微生物單獨(dú)起作用，實(shí)際上是多種菌群的混合發(fā)酵，發(fā)酵過程中存在菌相的變化。大量研究表明，酒曲中主要有三大類微生物：酵母菌，霉菌和細(xì)菌。其中霉菌主要包括根霉和毛霉兩個(gè)屬，霉菌主要產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶。甜酒曲中酵母菌包括釀酒酵母和非釀酒酵母，其中釀酒酵母是甜酒釀發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌［9］，主要是利用糖進(jìn)行酒精發(fā)酵［10］，此外扣囊復(fù)膜酵母、畢赤酵母、異常漢遜酵母以及其他的產(chǎn)酯酵母也起到了相當(dāng)重要的作用。

寧浩等［11］對(duì)華中地區(qū)的發(fā)酵米酒進(jìn)行研究，從中分離得到2株水解淀粉能力較強(qiáng)的霉菌和3株產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)的酵母菌，并對(duì)其發(fā)酵能力及產(chǎn)酒精方面進(jìn)行了初步研究。王艷萍等［12］對(duì)湖北荊州的甜酒曲中的微生物進(jìn)行分離純化，得到1株霉菌，1株酵母菌和2株細(xì)菌，其中霉菌屬于毛霉科，毛霉屬。越南學(xué)者［13］從酒中分離鑒定出5株酵母菌和魯氏毛霉（Amy1omyces rouxii）、少孢根霉（Rhizopus o1igosporus）、米根霉（Rhizopus oryzae）等霉菌，而根霉在淀粉糖化過程中還可以產(chǎn)生淀粉葡萄糖苷酶。YANG S等［14］從韓國(guó)的39種Nuruk樣品進(jìn)行研究，從中分離得到174株絲狀真菌。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同產(chǎn)地的酒曲中可培養(yǎng)真菌多樣性的研究來了解不同地區(qū)甜酒釀風(fēng)味迥異的原因，對(duì)甜酒釀品質(zhì)的進(jìn)一步提高以及甜酒釀的深加工提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品采集

6種中國(guó)不同地區(qū)（湖南韶山、湖南湘潭、湖南祁東、福建、浙江麗水和浙江蘭溪）的甜酒曲樣品，分別標(biāo)記為1#、2#、3#、4#、5#、6#。

1.1.2培養(yǎng)基［15］

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，酵母粉0.5 g，蛋白胨1 g，瓊脂粉2 g，加蒸餾水定容至100 mL，自然pH；

YPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，酵母粉0.5 g，蛋白胨1 g，加蒸餾水定容至100 mL，自然pH；

沙氏固體培養(yǎng)基：葡萄糖（或麥芽糖）4 g，蛋白胨1 g，瓊脂粉2 g，加蒸餾水，定容至100 mL，自然pH；

沙氏液體培養(yǎng)基：葡萄糖（或麥芽糖）4 g，蛋白胨1 g，加蒸餾水，定容至100 mL，自然pH。

1.2儀器與設(shè)備

HNY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；A300型ArtGeneTM基因擴(kuò)增儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；DYY-6C瓊脂糖水平電泳板：北京六一儀器廠；Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司。

1.3方法

1.3.1酒曲中可培養(yǎng)真菌的分離純化方法

梯度稀釋：取1g酒曲樣品，放入裝有99 mL無菌蒸餾水的錐形瓶中，振蕩20～30 min，即得菌懸液，利用10倍稀釋法，獲得不同梯度濃度的稀釋菌懸液，用移液槍分別移取0.1 mL菌懸液于不同的YPD固體培養(yǎng)基和沙氏固體培養(yǎng)基上，用無菌涂布棒將其涂布均勻，分別做好標(biāo)記，30℃培養(yǎng)，3～4 d后觀察并記錄結(jié)果。

1.3.2酵母菌和霉菌基因組DNA的提取方法

參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法提取基因組DNA［16］。

1.3.3酵母菌26S rDNA片段擴(kuò)增

以26S rRNA基因通用引物NL1和NL4為上下游引物，以提取的酵母菌基因組DNA為模板，進(jìn)行26S rDNA片段聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（po1ymerase chain reaction，PCR）。引物序列如下所示：

NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′

1.3.4霉菌ITS1-5.8S rDNA-ITS2擴(kuò)增

以真菌rDNA-ITS的通用引物ITS1和ITS4作為序列擴(kuò)增的上下游引物，以上述提取的霉菌基因組DNA為擴(kuò)增模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通用引物序列如下所示：

ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

1.3.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及測(cè)序

取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。瓊脂糖凝膠濃度1%；電泳緩沖液：1×TAE；電泳條件：100V、40 min。通過凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，選取條帶較亮的樣品送至上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（nationa1centerof biotechno1ogy information，NCBI）數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行比對(duì)分析，然后利用Mega5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2　結(jié)果與分析

2.1可培養(yǎng)真菌的分離純化結(jié)果

經(jīng)過稀釋涂布平板法對(duì)甜酒曲中的樣品進(jìn)行分離純化，根據(jù)菌落特征不同和顯微鏡觀察結(jié)果，總共從6種樣品中分離得到25株酵母菌菌株和13株霉菌菌株。結(jié)果見表1、表2。光學(xué)顯微鏡觀察其生長(zhǎng)形態(tài)，結(jié)果見圖1、圖2。

表1　酵母菌分離菌株來源及名稱Table 1 Source and name of yeast isolates

表2　霉菌分離菌株來源及名稱Table 2 Source and name of mould isolates

圖1　酵母菌細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology of yeasts

圖2　霉菌菌絲體形態(tài)Fig.2 Mycelium morphology of moulds

由圖1可知，所分離的25株酵母菌中A細(xì)胞球形，單細(xì)胞，個(gè)體較大；C細(xì)胞卵球形，單細(xì)胞，個(gè)體較大；P、FJ-J-2細(xì)胞卵球形，單細(xì)胞，個(gè)體較小；I、ZJL-6、ZJL-11細(xì)胞球形，個(gè)體較大，分散；L、ZJL-4細(xì)胞球形，個(gè)體較大，幾個(gè)聚在一起；M、ZJL-3細(xì)胞球形，個(gè)體較小，幾個(gè)聚在一起。N、O、ZJL-2、ZJL-9、ZJL-12、ZJL-13細(xì)胞球形，個(gè)體較小，分散；R細(xì)胞絲狀，個(gè)體較細(xì)，分散；FJ-J-1、ZJL-10細(xì)胞卵球形，個(gè)體較大，幾個(gè)聚在一起；FJ-J-3細(xì)胞短桿狀，個(gè)體較大，幾個(gè)聚在一起；FJ-J-4、ZJL-8卵球形，個(gè)體較大，分散；FJ-J-5、ZJL-5細(xì)胞卵球形，個(gè)體較小，分散。

由圖2可知，A-2菌絲灰褐色，粗壯，有假根，有孢囊，產(chǎn)孢囊孢子，孢子橢圓形；HX-1菌絲灰褐色，纖細(xì)，有孢囊，有假根和匍匐菌絲，孢囊孢子繁殖，孢子近球形；HX-2菌絲灰色，纖細(xì)，有假根和匍匐菌絲，孢囊孢子繁殖，孢子近球形；HX-3菌絲褐色，較粗壯，有孢囊、假根和匍匐菌絲，孢子橢圓形，??；HX-5菌絲灰褐色，菌絲粗壯，有假根和匍匐菌絲，孢囊孢子繁殖，孢子小，橢圓形；HX-6菌絲粗壯，灰褐色，有假根和匍匐菌絲，孢囊孢子繁殖，孢子大，近球形；FJ-M-1菌絲白色，纖細(xì)，無假根和匍匐菌絲，有孢囊，孢子小，球形；FJ-M-2菌絲灰褐色，纖細(xì)，有假根和匍匐菌絲，有孢囊，孢囊孢子橢球形；FJ-M-3菌絲灰白色，纖細(xì)，無假根和匍匐菌絲，有孢囊，孢囊孢子橢球形；FJ-M-4菌絲灰褐色，菌絲纖細(xì)，有假根，有孢囊，孢囊孢子近球形；FJ-M-5菌絲白色，較粗壯，無假根和匍匐菌絲，有孢囊，孢囊孢子小，橢球形；ZJR-1菌絲灰褐色，粗壯，有假根和匍匐菌絲，有孢囊，孢囊孢子球形；ZJR-2菌絲褐色，纖細(xì)，有假根和匍匐菌絲，有孢囊，孢囊孢子橢球形。

2.2酵母菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.2.1酵母菌26S rDNA片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取的酵母菌DNA為模板，以NL1和NL4為上、下游引物擴(kuò)增26S rDNA片段，片段長(zhǎng)度為600 bp左右，電泳圖如圖3～圖5。

圖3　1#、2#、3#甜酒曲酵母菌26S rDNA片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of the 26S rDNA segment of yeast strains isolated from samples 1#，2#，3#

由圖3可知，1#、2#、3#甜酒曲中分離得到的9株酵母菌，通過26SrDNA通用引物擴(kuò)增，在600bp左右各有一條亮帶，證明PCR擴(kuò)增成功。由圖4可知，4#甜酒曲酵母菌26SrDNA片段PCR擴(kuò)增結(jié)果，在600 bp左右各有一條亮帶，證明PCR擴(kuò)增成功。由圖5可知，5#甜酒曲酵母菌26S rDNA片段PCR擴(kuò)增結(jié)果，在600bp左右各有一條亮帶，證明PCR擴(kuò)增成功。

圖4　4#甜酒曲酵母菌26S rDNA片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of the 26S rDNA segment of yeast strains isolated from sample 4#

圖5　5#甜酒曲酵母菌26S rDNA片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR amplification results of the 26S rDNA segment of yeast strains isolated from sample 5#

2.2.2目的片段測(cè)序、結(jié)果比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增片段送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行B1ast比對(duì)分析，獲得的序列提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號(hào)。比對(duì)結(jié)果及獲得的登錄號(hào)見表3。

由表3可知，1#甜酒曲中分離得到的菌株A與克魯維畢赤酵母LY9：AB499014.1相似度高達(dá)99%。從2#甜酒曲中分離得到的6株酵母菌中，菌株R和M分別與克魯維畢赤酵母CEC RCS-0-9：JX103190.1和LY9：AB499014.1達(dá)到高相似度＞98%，而菌株I、L、N、O分別與釀酒酵母屬的不同菌株相似度＞97%。3#甜酒曲中的菌株C和P分別與釀酒酵母JN7N-19：KC715802.1和克魯維畢赤酵母菌株LY9：AB499014.1相似度達(dá)99%和97%，利用軟件Mega5對(duì)這9株酵母菌構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6）。通過以上分析可知，從1#、2#、3#甜酒曲中分離得到的9株酵母菌分屬于釀酒酵母和克魯維畢赤酵母兩個(gè)類群，其中菌株A、P、R、M鑒定為克魯維畢赤酵母（Pichia k1uyveri），而菌株C、I、L、N、O鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisisiae）。

表3　酵母菌序列比對(duì)結(jié)果Table 3 Sequence alignment results of yeast

圖6　1#、2#、3#甜酒曲中9株酵母菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of nine yeasts isolated from samples 1#，2#，3#

4#甜酒曲中總共分離得到5株酵母菌，其中菌株FJ-J-1 和FJ-J-2分別與扣囊復(fù)膜酵母s-5b-2：HM107787.1和3-1Y： KF717372.1相似度達(dá)到99%，菌株FJ-J-3與東方伊薩酵母QDA2：EU585765.1相似度達(dá)99%，而菌株FJ-J-4和FJ-J-5與不同的釀酒酵母菌株達(dá)到高相似度。利用軟件Mega5對(duì)4#甜酒曲的酵母菌構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖7）。因此可以看出通過可培養(yǎng)的方法進(jìn)行菌株篩選，從4#甜酒曲中分離到的5株酵母菌分屬于扣囊復(fù)膜酵母、東方伊薩酵母和釀酒酵母三個(gè)類群。

圖7　4#甜酒曲中5株酵母菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of five yeasts isolated from sample 4#

5#甜酒曲中分離得到的11株酵母菌通過B1ast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，11株酵母分離菌株與不同的釀酒酵母菌株的相似度達(dá)到97%以上，其中菌株ZJL-11與菌株JM2：JX867131.1相似度達(dá)100%，利用軟件Mega5對(duì)5#甜酒曲的酵母菌構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖8），結(jié)果表明，5#甜酒曲中的優(yōu)勢(shì)菌群為釀酒酵母。

圖8　5#甜酒曲11株酵母菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree of 11 yeasts isolated from sample 5#

2.3霉菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.3.1霉菌ITS片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

以霉菌DNA基因組DNA為模板，ITS1和ITS4為上、下游引物擴(kuò)增霉菌ITS基因片段，片段長(zhǎng)度為650 bp左右，電泳圖如圖9所示。

圖9　霉菌ITS PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.9 Amplification electrophoresis figure of mould ITS rDNA

由圖9可知，所分離的霉菌的ITS PCR擴(kuò)增結(jié)果，在650 bp左右各有一條亮帶，證明PCR擴(kuò)增成功。

2.3.2目的片段測(cè)序、結(jié)果比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增片段送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行B1ast比對(duì)分析，挑選與之相似度≥97%的菌株，獲得的序列提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號(hào)。序列比對(duì)結(jié)果及獲得的登錄號(hào)如表4。

表4　霉菌ITS序列比對(duì)結(jié)果Table 4 Comparison results of mould ITS rDNA sequence

通過序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離得到的13株霉菌為根霉屬和毛霉屬，屬于6個(gè)不同的種，分別為：卷枝毛霉（Mucor circine11oides）、小孢根霉（Rhizopus microsporus）、小孢根霉華變種（Rhizopus microsporusvar.chinensis）、小孢根霉須狀變種（Rhizopus microsporusvar.rhizopodiformis）、米根霉（Rhizopus oryzae）和印度毛霉（Mucor indicus），其中1#甜酒曲中分離得到的A-2與米根霉菌株VPCI66/P/10相似度達(dá)到99%。3#甜酒曲分離得到的5株霉菌經(jīng)過序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)均與小孢根霉須狀變種的不同菌株相似度高達(dá)99%。從4#甜酒曲樣品中分離得到的霉菌種類最多，F(xiàn)J-M-1與卷枝毛霉菌株Bam1相似度達(dá)99%，F(xiàn)J-M-2與小孢根霉菌株BS-A9相似度較高，F(xiàn)J-M-3和FJ-M-5分別與印度毛霉的不同菌株相似度達(dá)到99%，F(xiàn)J-M-4則與米根霉菌株VPCI66/p/11相似度達(dá)到99%。5#甜酒曲中分離得到的兩株霉菌均為根霉屬，ZJR-1和ZJR-2分別與小孢根霉菌株US-A2和小孢根霉華變種相似度達(dá)到99%。挑選相似度較高的已知菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖10。

圖10　霉菌ITS片段構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.10 Phylogenetic tree of mould isolates based on ITS fragment

通過以上分析結(jié)果可以得出，得到的13株霉菌中，菌株A-2和FJ-M-4為米根霉，菌株HX-1、HX-2、HX-3、HX-5、HX-6為小孢根霉須狀變種，菌株ZJR-2為小孢根霉華變種，ZJR-1和FJ-M-2為小孢根霉，菌株FJ-M-3和FJ-M-5為印度毛霉，而菌株FJ-M-1鑒定為卷枝毛霉。

3　結(jié)論

實(shí)驗(yàn)利用傳統(tǒng)的稀釋涂布法成功完成了甜酒曲中可培養(yǎng)真菌的分離純化，并利用26S rDNA序列分析對(duì)酵母菌分離株進(jìn)行鑒定，利用ITS序列對(duì)分離霉菌進(jìn)行了鑒定，從結(jié)果可以看出，在不同的甜酒曲中含有的酵母菌和霉菌有相同的菌株也有不同的菌株，這些不同的菌株在不同種類的甜酒曲樣品中，用于發(fā)酵產(chǎn)乙醇和有機(jī)酸及芳香物質(zhì)等其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同，從而導(dǎo)致了甜酒釀的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分存在差異，這也是不同地區(qū)甜酒釀的風(fēng)味迥異的根本原因所在。對(duì)甜酒曲中的分離菌株進(jìn)行條件優(yōu)化，從而得到性能良好的菌株是提高甜酒釀品質(zhì)的一條有效途徑。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，將對(duì)不同酒釀中的以營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

［1］傅金泉.中國(guó)酒曲技術(shù)的發(fā)展與展望［J］.釀酒，2002（2）：7-9.

［2］侯召華，寧浩然，聶帥，等.國(guó)內(nèi)外酒曲研究進(jìn)展［J］.特產(chǎn)研究，2013 （3）：72-76.

［3］臧威，謝廣發(fā)，孫劍秋，等.紹興黃酒酒藥中酵母菌的物種資源［J］.菌物學(xué)報(bào)，2015（6）：1078-1084.

［4］朱海泉，魯海波，王龍祥.甜酒曲的開發(fā)與研究進(jìn)展［J］.山東食品發(fā)酵，2012（2）：49-52.

［5］劉婧竟，喬發(fā)東.國(guó)內(nèi)外甜酒曲研究進(jìn)展［J］.中國(guó)釀造，2010，29（9）：21-25.

［6］HESSELTINE C W.Microbio1ogy of orienta1 fermented foods［J］.Ann Rev Microbiol，1983，37:575-601.

［7］THANH V N，MAI L T，TUAN D A.Microbia1 diversity of traditiona1Vietnamese a1coho1 fermentation starters（banhmen）as determined byPCR-mediated DGGE［J］.Int J Food Microbiol，2008，124（2）:268-273.

［8］JEYARAM K，SINGH W M，COPECE A，et a1.Mo1ecu1ar identification of yeast species associated with'Hamei'-A traditiona1 starter used for rice wine production in Manipur，India［J］.Int J Food Microbiol，2008，124（2）:115-125.

［9］閆華文，陳璐，姚淑敏.湖南民間酒釀中酵母菌多樣性的研究［J］.中國(guó)釀造，2014，33（5）：81-84.

［10］HYERYUN K，SEUNGHEE B，MINJAE S，et a1.Feasibi1ity of Cheonghju brewing with wi1d type yeast strains from Nuruks［J］.Korean J Microbiol Biotechnol，2006，34（3）:244-249.

［11］寧潔，趙新淮.發(fā)酵米酒中一些霉菌和酵母的性質(zhì)與應(yīng)用研究［J］.食品科技，2008（10）：5-9.

［12］王艷萍，程巧玲，張陽，等.米酒醪中優(yōu)勢(shì)微生物菌相組成的初步研究［J］.中國(guó)釀造，2008，27（5）：12-14.

［13］DUNG N T P，ROMBOUTS F M，NOUT M J R.Functiona1ity of se-1ect-ed strains of mou1ds and yeasts from Vietnamese rice wine starters ［J］.Food Microbiol，2006，23（4）:331-340.

［14］YANG S，LEE J，KWAK J，et a1.Fungi associated with the traditiona1 starter cu1tures used for rice wine in Korea［J］.J Korean Soc Appl Biol Chem，2011，54（6）:933-943.

［15］楊革.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］.北京：科學(xué)出版社，2009.

［16］朱旭芬.基因工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京：高等教育出版社，2006.

Diversity of cu1turab1e fungi in different sweet a1coho1ic drink's starters

YAO Shumin，YAN Huawen，CHEN Lu （Co11ege of Life Science，Qu Fu Norma1 University，Qufu 273165，China）

The 25 yeast strains and 13 mou1d strains were screened and iso1ated from the six kinds of sweet a1coho1ic drink's starters by cu1ture media methods，and the yeast strains were identified by 26S rDNA sequence.The resu1ts showed that the yeast strains be1ong to four groups:Saccharomyces cerevisiae，Saccharomyces fibu1igera，Issatchenkia orienta1isandPichia k1uyveri.The mou1d strains were identified by the ITS rDNA sequence，and resu1ts indicated that the 13 mou1d strains were identified asRhizopus oryzae，Rhizopus microsporus，Rhizopus microsporusvar.chinesis，Rhizopus microsporusvar.rhizopodiformis，Mucor indicusandMucor circine11oides.

cu1turab1e fungi；26S rDNA；ITS rDNA；sweet a1coho1ic drink's starters

TS261.1

A

0254-5071（2015）12-0048-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.011

2015-10-01

山東省青年基金資助項(xiàng)目（ZR2013EEQ009），曲阜師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（sk201407）

姚淑敏（1967-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源和利用。