超高效液相色譜法快速測定葡萄酒中酚酸

唐　柯，馬　磊，徐　巖*，李記明（.江南大學 生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，食品科學與技術國家重點實驗室，釀酒微生物與酶技術研究室，江蘇無錫4；.煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東 煙臺 64000）

超高效液相色譜法快速測定葡萄酒中酚酸

唐柯1，馬磊1，徐巖1*，李記明2
（1.江南大學 生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，食品科學與技術國家重點實驗室，釀酒微生物與酶技術研究室，江蘇無錫214122；2.煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東 煙臺 264000）

通過選擇檢測波長和優(yōu)化色譜條件，建立一種8 min內分離葡萄酒中13種酚酸的反相超高效液相色譜（UPLC）檢測方法。色譜條件：以2%乙酸和純甲醇為流動相，采用ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，流速為0.30 mL/min，檢測波長為280 nm和320 nm，柱溫為50℃，進樣量為1 μL。結果表明：13種酚酸的最低檢測限均＜0.10 mg/L，標準曲線線性相關性（R2）均＞0.99，回收率為90%～110%，且其相對標準偏差（RSD）均＜3.00%，保留時間及峰面積的RSD均分別＜1.00%、3.00%。該方法靈敏度高、速度快、分離度高，精密度及穩(wěn)定性良好。樣品中檢測結果表明，該方法適合葡萄酒中酚酸的檢測。

超高效液相色譜；酚酸；葡萄酒；檢測

葡萄酒是以新鮮的葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)過全部或者是部分發(fā)酵釀造而成的含有一定酒精度的飲料［1］，是世界上消費量最大的果酒。酚酸是葡萄及葡萄酒中最主要的非類黃酮，多為對羥基苯甲酸和對羥基肉桂酸及其衍生物，作為一種次生代謝產物廣泛存在于植物體中，這類化合物具有一個苯核。大量研究證明，酚酸與葡萄的生長發(fā)育和抗性密切相關。近年來研究發(fā)現(xiàn)，酚酸類物質，對葡萄酒的風味、色澤等起著重要的作用，如咖啡酸具有抗氧化性，有助于葡萄酒顏色的穩(wěn)定［2］。除此之外，酚酸具有營養(yǎng)保健作用和抗氧化性的藥用價值，與人類的健康有密切關系［3］。

高效液相色譜法（high performance 1iquid chromatography，HPLC），尤其是液相色譜質譜（1iquidchromatographymass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用法是目前應用最為廣泛的檢測葡萄酒中酚酸的方法。JAITZ L等［4］應用液相色譜串聯(lián)質譜（1iquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法檢測了奧地利葡萄酒中5種酚酸；PEREIRA V等［5］建立了葡萄酒中9種酚酸的HPLC檢測方法；陳建業(yè)等［6］也建立了葡萄酒中11種酚酸的HPLC檢測方法。這些方法準確、靈敏、重復性好，但存在耗時較長的缺點，分離時間大都接近1 h。隨著超高效液相色譜（u1tra performance 1iquid chromatography，UPLC）的問世，更高效率，高靈敏度，高分離度的檢測葡萄酒中酚類物質的方法被開發(fā)出來。除此之外，由于UPLC-DAD方法檢測限更低，因而越來越受到世界各大研究機構的歡迎［7-10］。SPáCˇIL Z等［11］建立了4 min以內分離葡萄酒中11種酚酸的UPLC檢測方法，對比了UPLC-二極管陣列檢測器（diode-array detector，DAD）和HPLC-DAD分析酚類物質的方法，兩種方法都得到了良好的分離效果，但UPLC-DAD更加靈敏、快速同時大幅減少流動相的消耗，節(jié)約成本。TRAUTVETTER S等［12］建立了14 min以內分離蜂蜜中37種酚類物質的超高效液相-質譜（UPLC-MS）聯(lián)用檢測方法。目前國內關于UPLC檢測葡萄酒中風味物質的研究報道甚少，而酚酸不僅是葡萄酒風味物質的關鍵組成，同時也是葡萄酒中重要的生理活性物質，因此建立葡萄酒中酚酸類物質的快速測定方法，分析葡萄酒中酚酸的種類及含量具有重要意義。本實驗通過對色譜條件的選擇和優(yōu)化，旨在建立一種利用UPLC高效、快速測定葡萄酒中13種酚酸的分析方法，并應用于葡萄酒樣品的測定。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葡萄酒樣品由煙臺張裕集團提供，其中包括2款干紅葡萄酒（干紅2010年、干紅2011年）和2款干白葡萄酒（干白2010年、干白2011年）；0.22 μm濾膜：上海安譜實驗科技股份有限公司。

沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、p-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸、芥子酸、鞣花酸、水楊酸（純度≥95%）：美國Sigma-A1drich公司；甲醇、冰醋酸（純度≥98%）：德國CNW公司；電阻率18 MΩ·cm的超純水：美國Mi11ipore simp1icity公司。

1.2儀器與設備

Waters ACQUITY UPLC H-C1ass超高效液相色譜儀（配置二極管陣列檢測器、樣品管理器、溶劑管理器、柱溫箱、Empower色譜工作站）、ACQUITYUPLCBEHC18（100mm× 2.1mm，1.7μm）色譜柱：美國沃特世公司；Mi11i-QAcademic超純水系統(tǒng)：密理博（中國）有限公司；E1masonic E60H超聲波振蕩器：德國ELMA公司；循環(huán)水式真空泵SHZ-D（Ⅲ）：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3實驗方法

1.3.1流動相配制

流動相A：準確量取10.00 mL乙酸，定容至500 mL容量瓶中，經(jīng)0.22 μm的水相濾膜減壓抽濾后，于超聲波振蕩器內振蕩10 min。

流動相B：準確量取500 mL甲醇，經(jīng)0.22 μm的有機相濾膜減壓抽濾后，于超聲波振蕩器內振蕩10 min。

1.3.2酚酸標準品溶液的制備

分別稱取約10～50mg的沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、p-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸、芥子酸、鞣花酸、水楊酸標準品，用色譜級甲醇定容于10 mL容量瓶中，配成混合溶液，將此溶液稀釋成不同濃度梯度的標準溶液，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3樣品前處理

用于酚酸測定的葡萄酒樣品經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾后直接進樣。

1.3.4色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱，檢測波長為280 nm和320 nm，柱溫50℃，流速0.3 mL/min，進樣量1 μL。

流動相A：100%甲醇，B：2%乙酸。

洗脫程序：0～3.2 min，8～20%B；3.2～8.0 min，20～44%B；8.0～8.2 min，44～8%B；8.2～10 min，8%B。

1.3.5定性定量方法

定性方法：峰面積增高法進行定性。定量方法：外標法進行定量。

2　結果與分析

2.1檢測波長的選擇

分別對13種酚酸的標準品溶液進行全波長掃描，掃描波段為210～400nm。結果表明：13種物質最大吸收峰互不相同，但除龍膽酸（320nm）外，其他酚酸在280nm處均有最大或較大吸收。因此，本實驗選擇280nm、320nm為檢測波長。

2.2流動相的選擇

當前，國內外有關葡萄酒中酚酸的反相液相色譜檢測的報道主要以稀酸水溶液和有機相為流動相進行梯度洗脫。本實驗分別嘗試了不同濃度的甲酸或乙酸和甲醇或乙腈為組合作為流動相進行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)2%的乙酸和100%甲醇洗脫時，效果最佳。因此，本實驗選擇100%甲醇及2%乙酸作為流動相。

2.3色譜條件的優(yōu)化

本實驗以2.0%乙酸水溶液和純甲醇為流動相，進行梯度洗脫。分別以0.20 mL/min、0.25 mL/min、0.30 mL/min、0.35mL/min的流速進樣；溫度分別設置為20℃、30℃、40℃、50℃；進樣量設置為1μL、2μL、3μL、4μL、5μL。結果顯示：進樣量選擇1 μL，在50℃的柱溫下，以0.30 mL/min的流速進樣時分離效果最好。

2.4葡萄酒中酚酸的定性

對13種酚酸混合標準品進行色譜檢測，得到13種酚酸標準品色譜圖（見圖1），對葡萄酒樣品進行色譜檢測，得到葡萄酒樣品中13種酚酸的UPLC色譜圖（見圖2）。由圖1、圖2可知，13種酚酸標準品和葡萄酒樣品在上述色譜條件下，能夠充分分離。

用峰面積增高法進行定性，13種酚酸出峰順序依次為：沒食子酸（ga11ic acid）、原兒茶酸（protocatechuic acid）、龍膽酸（gentisic acid）、p-羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）、綠原酸（ch1orogenic acid）、咖啡酸（caffeic acid）、香草酸（vani11ic acid）、丁香酸（syringic acid）、p-香豆酸（p-coumaric acid）、阿魏酸（feru1ic acid）、芥子酸（sinapic acid）、鞣花酸（e11agic acid）、水楊酸（sa1icy1ic acid）。

圖1　13種酚酸標樣的UPLC檢測色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of 13 phenolic acids in standard sample

圖2　葡萄酒樣品13種酚酸UPLC檢測色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of 13 phenolic acids in wine

2.5標準曲線的建立

葡萄酒中的酚酸的定量采用外標法，準確配制0.20～211.20 mg/L的8個不同質量濃度的13種酚酸的混合標樣，按照上述液譜條件進樣。以峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X）為橫坐標，計算得到13條酚酸標準曲線回歸方程。結果見表1。由表1可知，13種酚酸標準品溶液的質量濃度與峰面積間的線性相關系數(shù)均大于0.99，呈現(xiàn)出良好的線性關系。根據(jù)3倍基線噪音所對應的各組分的質量濃度值即為各組分的最低檢出限，測定結果表明13種酚酸最低檢測限（1imit of detection，LOD）均低于0.10 mg/L，說明此方法定量靈敏度高、準確度高、可行性好，符合實驗對于定量要求。

表1　13種酚酸的線性方程及最低檢出限（n=8）Table 1 Linear equation and the lowest detectable limit of 13 phenolic acids（n=8）

2.6加標回收率實驗

在已測定葡萄酒樣品中分別添加一定質量濃度的12種酚酸的標準品，測定其總質量濃度，計算加標回收率，結果見表2。加標回收率=（加標試樣測定值-試樣測定值）÷加標量×100%。由表2可知，葡萄酒中可以檢測到的12種酚酸的回收率為90%～110%，相對標準偏差（re1ative standard deviation，RSD）均小于3.00%，表明該方法準確度高，符合實驗對于定量的要求。

表2　12種酚酸的加標回收率試驗結果（n=5）Table 2 Results of recovery rates of 12 phenolic acids（n=5）

2.7精密度和穩(wěn)定性檢驗

表3　精密度及穩(wěn)定性試驗結果（n=5）Table 3 Results of precision and stability tests（n=5）

在上述色譜條件下，分別在當天和隔天將葡萄酒樣品連續(xù)進樣5次，對12種酚酸的保留時間和峰面積進行相對標準偏差（RSD）計算，結果見表3。由表3可知，12種酚酸保留時間的RSD都極小，均低于1.00%；峰面積的RSD均小于3.00%。說明該檢測方法精密度高，穩(wěn)定性好。

2.8葡萄酒樣品中酚酸的檢測

應用上述建立的UPLC方法檢測4款葡萄酒中酚酸的含量，結果如表4所示。由表4可知，4款葡萄酒樣品中均沒有檢測到綠原酸。干紅葡萄酒中，沒食子酸是最主要的酚酸，含量最高；咖啡酸、丁香酸、p-香豆酸含量也比較高，其他酚酸含量較低，有些不足1mg/L。干白與干紅葡萄酒差別很大，除綠原酸外香草酸、阿魏酸沒有檢測到，沒食子酸含量極低，不足1 mg/L；龍膽酸和咖啡酸含量比較高，但仍不足10 mg/L，其他酚酸含量較低，這與GóMEZ-ALONSO S等［13-14］的研究結果基本一致。干紅葡萄酒樣品總酚酸含量為61.47～74.41 mg/L，干白葡萄酒樣品總酚酸含量為32.49～44.08 mg/L，干紅葡萄酒總酚酸含量明顯高于干白葡萄酒，主要源于干紅、干白葡萄酒釀造工藝的不同所致［15］。

表4　葡萄酒樣品中13種酚酸的檢測結果（n=3）Table 4 Detection results of 13 phenolic acids in wine（n=3）

3　結論

本實驗建立了一種快速分離葡萄酒中13種酚酸的UPLC檢測方法。通過檢測波長的選擇和色譜條件的優(yōu)化，實現(xiàn)了8min以內分離葡萄酒中13種酚酸。13種酚酸的最低檢測限均低于0.10 mg/L，標準曲線線性相關性均大于0.99，回收率為90%～110%且RSD均小于3.00%，保留時間的RSD均低于1.00%，峰面積的RSD均小于3.00%，該方法靈敏度高、速度快、分離度高，精密度及穩(wěn)定性良好。與傳統(tǒng)HPLC法相比，分離速度快，檢測限低［6］。

酒樣中酚酸檢測結果表明，綠原酸均沒有檢測到。紅葡萄酒中，沒食子酸是最主要的酚酸，咖啡酸、丁香酸、p-香豆酸含量也比較高，其他酚酸含量較低。干白與干紅葡萄酒中酚酸含量差別很大，干白中除綠原酸外，香草酸、阿魏酸也未檢測到，而沒食子酸含量極低，龍膽酸和咖啡酸含量相對較高?？偡铀岷?，干紅葡萄酒明顯高于干白葡萄酒。

UPLC作為一種新型液相色譜技術以靈敏度高、速度快、分離度高等特點為現(xiàn)代色譜分析提供了廣闊的前景，將會為葡萄酒分析化學的發(fā)展中發(fā)揮更重要的作用。

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Rapid determination of pheno1ic acids in wine by u1tra performance 1iquid chromatography

TANG Ke1，MA Lei1，XU Yan1*，LI Jiming2（1.Key Laboratory of Industria1 Biotechno1ogy，Ministry of Education；State Key Laboratory of Food Science&Techno1ogy；Centre for
Brewing Science and Enzyme Biotechno1ogy，Schoo1 of Biotechno1ogy，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Center of Science and Techno1ogy，ChangYu Group Co.，Ltd.，Yantai 264000，China）

By se1ecting wave1ength and optimizing chromatographic condition，a rapid determination method for separating 13 pheno1ic acids in wine in 8 min was estab1ished using reversed-phase u1tra performance 1iquid chromatography（RP-UPLC）.13 pheno1ic acids were separated by ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）with mobi1e phases of 2%acetic acid and pure methano1.The chromatographic conditions was as fo11ows: f1ow rate 0.30 m1/min，the UV detection wave1ength 280 nm and 320 nm，co1umn temperature 50℃，injection vo1ume 1 μ1.The resu1ts indicated that the 1owest detectab1e 1imit of 13 pheno1ic acids was 1ess than 0.10 mg/L，the corre1ation coefficients（R2）was more than 0.99.The recovery rates were in the range of 90%-110%and the re1ative standard deviation（RSD）was 1ess than 3.00%.The RSD va1ues of retention time and peak area were 1ess than 1.00%and 3.00%，respective1y.Due to its high sensitivity，fast speed，high separation，good precision and re1iab1e stabi1ity，the method was suitab1e for the detection of pheno1ic acids in wine.

UPLC；pheno1ic acids；wine；detection

O657.7

A

0254-5071（2015）12-0157-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.035

2015-11-01

國家自然科學基金項目（31501470）；國家高技術研究發(fā)展計劃‘863計劃’項目（2013AA102108）

唐柯（1981-），男，副教授，博士，研究方向為葡萄酒風味化學。

徐巖（1962-），男，教授，博士，研究方向為釀造微生物學與應用酶學。