傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

劉思佳，孫曉東，2*，盧萌萌，盧影影，胡光琴，馬一涵（.大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 6600；2.大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 6024）

傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

劉思佳1，孫曉東1，2*，盧萌萌1，盧影影1，胡光琴1，馬一涵1
（1.大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024）

脂肪酶屬于羧基酯水解酶類，能將甘油三酯逐步地水解成甘油和脂肪酸。該研究從東北三省傳統(tǒng)的家庭自制豆醬上獲得純培養(yǎng)真菌389株，通過三丁酸甘油酯平板法初篩獲得具有脂肪酶活性的菌株41株，其中青霉屬的真菌27株、曲霉5株、毛霉3株、犁頭霉2株、酵母菌1株、鐮孢菌2株、帚霉菌1株。結(jié)果表明，青霉屬的真菌無論從數(shù)量還是酶活都高于其他屬的真菌，其中橘灰青霉（Penici1-1ium aurantiogriseum）數(shù)量最多。在分離到的菌株中，毛霉屬的卷枝毛霉（Mucor circine11oides）酶活最高，是具有生物催化潛力的功能菌株。

豆醬；真菌；脂肪酶活性；三丁酸甘油酯；橘灰青霉；卷枝毛霉

豆醬（soybean paste）是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品，它是以大豆為主要原料，經(jīng)自然發(fā)酵而成的半流動狀態(tài)的發(fā)酵食品，也稱黃豆醬、黃醬或大豆醬。豆醬在自然發(fā)酵過程中pH和總酸在起始發(fā)酵的2～4周內(nèi)變化較快，后期變化緩慢，到16周時分別達到4.55和3.48%（以干基計）［1］。傳統(tǒng)豆醬是通過天然接菌，自然發(fā)酵3～4個月而形成的，微生物及其酶系在醬曲培養(yǎng)和醬醪發(fā)酵中發(fā)揮了重要作用［2］。微生物分子生態(tài)學(xué)作為分子生物學(xué)與微生物生態(tài)學(xué)交叉而形成的學(xué)科，在傳統(tǒng)發(fā)酵食品行業(yè)中的應(yīng)用還處于起步階段［3］。傳統(tǒng)的家庭自制豆醬是自然發(fā)酵而成，在完全開放式的制作過程中，空氣中的大量微生物自由落入，形成特殊的微生物區(qū)系，其中真菌伴隨在豆醬的整個制作過程中，尤其在制曲階段為優(yōu)勢類群［4］。中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品的生產(chǎn)過程中發(fā)生了一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，使其制品具有特定的風(fēng)味、組成和營養(yǎng)。豆醬在發(fā)酵過程中微生物的分布及這些微生物在工業(yè)生產(chǎn)方面的發(fā)掘與利用，通過對菌種的篩選、改良進一步提高產(chǎn)品的營養(yǎng)、風(fēng)味及功能性［5］。有人分離得到的霉菌，經(jīng)鑒定主要為黑曲霉（Aspergi11us niger）、米曲霉（Aspergi11usoryzae）、高大毛霉（Mucor mucedo）和醬油曲霉（Aspergi11us sojae）等［6］，這些真菌分解大豆中的蛋白質(zhì)和脂肪，將大分子物質(zhì)分解成可被人體吸收利用的小分子營養(yǎng)物質(zhì)［7］。

脂肪酶是一種特殊的酯鍵水解酶，將脂肪分解為甘油脂和脂肪酸，它廣泛存在于動植物和微生物中，也可通過化學(xué)合成獲得，是一種既可催化水解反應(yīng)又可催化合成反應(yīng)的生物催化劑。因微生物脂肪酶的產(chǎn)量高，便于基因操作，生產(chǎn)無季節(jié)波動等原因，故比植物和動物來源的脂肪酶的應(yīng)用更為廣泛［8］。脂肪酶是一類能夠催化酯的水解反應(yīng)以及在非水相體系中催化脂肪酸和醇類發(fā)生酯化反應(yīng)的酶類。隨著酶學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，微生物脂肪酶也受到了越來越多的關(guān)注［9］。目前，產(chǎn)脂肪酶的微生物包括黑曲霉、白地霉、假單胞菌屬、毛霉、根霉、假絲酵母等，所產(chǎn)脂肪酶應(yīng)用于工業(yè)中，如洗滌業(yè)、食品行業(yè)、化學(xué)業(yè)、皮革業(yè)、造紙業(yè)等［10］。脂肪酶是重要的工業(yè)用酶。脂肪酶在焙烤食品中可作為綠色生物改良劑；在油脂工業(yè)上可促油脂水解、促酯交換和促酯化；在乳品工業(yè)中可用于乳酯水解；在食品添加劑中應(yīng)用可增香改質(zhì)、提高食品檔次。目前國內(nèi)外還開發(fā)出了許多新型脂肪酶產(chǎn)品［11］。更多還原脂肪酶的應(yīng)用范圍雖不如淀粉酶、蛋白酶廣泛，但在諸多方面已顯示出不可估量的開發(fā)潛力。

本研究對254份采自東北三省各地的家庭自制豆醬進行分離，獲得純培養(yǎng)真菌菌株389份，明確了各菌株的分類地位。對這些菌株進行了脂肪酶活性的篩選，通過三丁酸甘油酯平板法［12］、發(fā)酵復(fù)篩等獲得高產(chǎn)脂肪酶的菌株，并對其活性進行了測定。本研究為脂肪酶功能菌株的開發(fā)及發(fā)酵條件的優(yōu)化，脂肪酶的提取和應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和菌種支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

自然發(fā)酵豆醬：均取自東三省農(nóng)戶家。

三丁酸甘油酯（分析純）：上海索萊寶生物科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、酚酞（指示劑）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

麥芽浸出液瓊脂（ma1t extract agar，MEA）培養(yǎng)基：麥芽浸膏20 g，蛋白胨1 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。

查氏酵母膏瓊脂（Czapek yeast extract agar，CYA）培養(yǎng)基：K2HPO41 g，查氏濃縮液10 mL，酵母抽提物5 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2儀器與設(shè)備

奧林帕斯CX21顯微鏡：日本奧林帕斯株式會社；2-16KL離心機：德國Sigma公司；HZQ-Q全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；FA2004型電子天平：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3方法

1.3.1菌種活化

將保存于凍存管里的各供試菌株接入新鮮的PDA平板中，置25℃黑暗培養(yǎng)，待長出菌落后進行菌株的初篩。

1.3.2產(chǎn)脂肪酶菌株的初篩

采用三丁酸甘油酯平板法進行菌株初篩。在直徑9 cm的無菌培養(yǎng)皿中，注入15 mL三丁酸甘油酯培養(yǎng)基，待凝固成平板后，挑取單菌落接種于平板上，置25℃黑暗培養(yǎng)。產(chǎn)生脂肪酶的菌株會將培養(yǎng)基中的三丁酸甘油酯分解，在菌落周圍形成白色的油花。選取形成油花的菌株進行復(fù)篩的發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.3發(fā)酵復(fù)篩

采用煮熟、滅菌的大豆為復(fù)篩的固體培養(yǎng)基。取煮熟的大豆20 g，置于150 mL三角瓶中，滅菌。將初篩選出的新鮮菌株制成濃度為1×106CFU/mL的菌懸液，取1 mL接種于滅菌的大豆中，于25℃黑暗培養(yǎng)15 d。

1.3.4酶液的制備

將發(fā)酵15d的大豆三角瓶從培養(yǎng)箱中取出，加入50 mL無菌的去離子水，分散均勻，30℃振蕩培養(yǎng)4 h，靜置。濾液4 200 r/min離心20 min，取上清液作為粗酶液測定。

1.3.5脂肪酶活性測定

用NaOH滴定法測酶活力［13］。取100 mL錐形瓶向其中加入4 mL 0.025 mo1/L磷酸緩沖液和5 mL的三丁酸甘油酯乳化液，置于40℃水浴中保溫5 min，然后向錐形瓶中加入1 mL的粗酶液。從加入酶液開始精確計時，繼續(xù)保溫15 min，取出立即加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇15 mL終止酶的作用。向反應(yīng)液中加入3滴酚酞指示劑，用0.05 mo1/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)液滴定至粉紅色?？瞻讟悠吩诿敢杭尤胫埃尤塍w積分?jǐn)?shù)95%的乙醇15 mL，使酶液失活。

酶活定義：在一定pH值和40℃溫度條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1 μmo1脂肪酸所需的酶量定義為一個脂肪酶活力單位（U）。每個樣品做3個平行試驗，酶活力計算公式如下：

式中：U為樣品的酶活力，μmo1/（min·mL）；V為滴定樣液所消耗的NaOH體積，mL；V0為滴定空白樣液所消耗的NaOH體積，mL；t為反應(yīng)時間，min；n為酶液體積，mL；M為滴定用的NaOH溶液的濃度，mo1/mL。

1.3.6菌株的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定

將初篩得到的菌株接種到標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基MEA和CYA上［14-17］，25℃黑暗培養(yǎng)5 d，待菌株產(chǎn)孢后在顯微鏡下觀察其顯微形態(tài)，結(jié)合菌落特征進行形態(tài)學(xué)鑒定。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)脂肪酶菌株的初篩結(jié)果

將分離自豆醬的389株真菌進行三丁酸甘油酯平板法初篩，其中有41株表現(xiàn)出脂肪酶活性，在菌落周圍水解三丁酸甘油酯，形成了白色的油花。其中包括曲霉菌（Aspergi11us）、青霉菌（Penici11ium）、毛霉（Mucor）、犁頭霉（Absidia）、鐮孢菌（Fusarium）、帚霉（Scopu1ariopsis），還有一株未定種的酵母菌。其中青霉菌27株，橘灰青霉（Penici11ium aurantiogriseum）的數(shù)量最多，是豆醬發(fā)酵過程中降解脂肪酶的優(yōu)勢種群。

分離菌株培養(yǎng)5 d后，在顯微鏡下觀察各菌株的顯微特征，按參考文獻中不同屬的分類標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合菌落特征，將菌株鑒定到種［14-17］。部分菌株的顯微形態(tài)見圖1。

圖1　部分菌株顯微形態(tài)Fig.1 Micromorphology of some strains

2.2NaOH滴定法測粗酶液活性結(jié)果

用NaOH滴定法測定發(fā)酵復(fù)篩后提取的粗酶液，共有41株表現(xiàn)出了不同程度的脂肪酶活性。各菌株的酶活詳見表1。

表1　脂肪酶活性測定結(jié)果Table 1 Detection results of lipase activity

續(xù)表

由于脂肪酶的酶解反應(yīng)比較復(fù)雜，容易受底物的種類和形態(tài)、穩(wěn)定時間、反應(yīng)體系的酸度、溫度等多種因素的影響，因此反應(yīng)并非十分穩(wěn)定，這就決定了測定脂肪酶活力時存在一定的誤差。測定脂肪酶的方法很多，有酸堿滴定法、分光光度法、濁度測定法、正己烷抽提法等。所使用的底物也很多，有三油酸甘油酯、三丁酸甘油酯、橄欖油等。迄今為止，仍然沒有一種統(tǒng)一的檢測手段，目前比較公認(rèn)的測定方法是酸堿滴定法［18］。

由表1可知，從豆醬上分離到的產(chǎn)脂肪酶的菌株多數(shù)為青霉菌，其中橘灰青霉（Penici11ium aurantiogriseum）數(shù)量最多，毛霉屬中的卷枝毛霉（Mucor circine11oides）酶活最高，橘灰青霉（Penici11ium aurantiogriseum）可以在水瓊脂和有機溶劑中產(chǎn)生高酶活且穩(wěn)定的脂肪酶，是一種具有生物催化潛力的功能菌株［19］。本試驗獲得的7株橘灰青霉，可以進一步用于后續(xù)的產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，及酶學(xué)性質(zhì)的研究。

3　結(jié)論

用三丁酸甘油酯平板法對分離自豆醬上的389株真菌進行脂肪酶活性的初篩，得到了41株產(chǎn)生白色油花的菌株，其中青霉屬的真菌27株、曲霉5株、毛霉3株、犁頭霉2株、酵母菌1株、鐮孢菌2株、帚霉菌1株。脂肪酶活性測定結(jié)果表明，青霉屬的真菌無論從數(shù)量還是酶活都遠遠高于其他屬的真菌，其中橘灰青霉（Penici11ium aurantiogriseum）數(shù)量最多，毛霉屬中的卷枝毛霉（Mucor circine11oides）酶活最高，以上兩種類群都可以作為豆醬發(fā)酵過程中分解大豆脂肪的主要功能菌株。其他屬的真菌也具有或高或低的脂肪酶合成能力，在豆醬的發(fā)酵中是多菌株混合發(fā)酵，相互協(xié)同，共同將大豆脂肪降解。本研究獲得的橘灰青霉和卷枝毛霉可以進一步用來發(fā)酵獲得微生物脂肪酶，為脂肪酶種類的增加和應(yīng)用提供了試驗基礎(chǔ)和菌種支持。

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Screening of 1ipase-producing strains from traditiona1 fermented soybean paste

LIU Sijia1，SUN Xiaodong1，2*，LU Mengmeng1，LU Yingying1，HU Guangqin1，MA Yihan1
（1.Co11ege of Environment and Resources，Da1ian Nationa1ities University，Da1ian 116600，China；2.Schoo1 of Life Science and Biotechno1ogy，Da1ian University of Techno1ogy，Da1ian 116024，China）

Lipase be1ongs to carboxy1ic ester hydro1ytic enzymes，and it can gradua11y hydro1yze trig1yceride into g1ycero1 and fatty acids.389 strains of pure cu1ture fungi were obtained from the traditiona1 homemade soybean paste in northeast three provinces.41 strains with the 1ipase activity were pre1iminari1y screened by g1ycery1 tributyrate p1ate method，inc1uding 27Penici11iumspp，5Aspergi11usspp，3Mucorspp，2Absidiaspp，1Saccharomycetessp，2Fusariumspp，1Scopu1ariopsissp.Resu1ts indicated that the quantity and enzyme activity ofPenici11iumfungus were better than that of other fungi.The quantity ofPenici11ium aurantiogriseumwas the 1argest among a11 strains.The enzyme activity ofMucor circine11oideswas the highest in that of screened strains，and it was the functiona1 strain with biocata1ysis potentia1.

soybean paste；fungi；1ipase activity；g1ycery1 tributyrate；Penici11ium aurantiogriseum；Mucor circine11oides

Q939.99

A

0254-5071（2015）12-0034-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.008

2015-11-05

國家自然基金青年基金項目（31200014）；中央高校自主基金項目（DC201501012）；大連民族大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（X201512222）

劉思佳（1994-），女，本科生，研究方向為食品微生物。

孫曉東（1979-），女，工程師，博士，研究方向為真菌分類與真菌毒素的檢測。