丹參磷脂浸膏對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制

曲　圓，付丹陽，紀影實

(1.吉林大學第二醫(yī)院骨科， 吉林 長春 130041；2.吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學系,吉林 長春 130021)

丹參磷脂浸膏對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制

曲圓1，付丹陽*，紀影實2

(1.吉林大學第二醫(yī)院骨科， 吉林 長春 130041；2.吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學系,吉林 長春 130021)

目的：觀察丹參磷脂浸膏(DSLZ)對腦缺血再灌注損傷的保護作用，探討其可能機制。方法：60只Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照丹參酮ⅡA組和低、中、高劑量DSLZ組(5.0、10.0、20.0 mg·kg-1，以丹參酮ⅡA計)，每組10只。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，缺血2 h、再灌注22 h后檢測大鼠神經(jīng)功能評分，TTC染色檢測大鼠腦梗死面積百分比，HE染色檢測大鼠腦組織病理形態(tài)學，檢測大鼠腦組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分升高(P<0.05)，腦梗死面積百分比增大(P<0.05)，腦組織中SOD活性明顯降低(P<0.01)，MDA和NO水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，中、高劑量DSLZ組大 鼠神經(jīng)功能評分降低，腦梗死面積百分比明顯縮小，腦組織中 SOD活性明顯升高， MDA及NO水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。HE染色，模型組大鼠神經(jīng)細胞胞膜不清，細胞出現(xiàn)腫脹、變形、壞死，細胞間質(zhì)水腫，細胞間隙增大；高劑量DSLZ組大鼠神經(jīng)細胞核仁清晰，間質(zhì)輕微水腫。結(jié)論：DSLZ可減輕腦缺血大鼠神經(jīng)細胞損傷，其機制可能與減輕自由基損傷、抑制NO神經(jīng)毒性有關(guān)聯(lián)。

丹參磷脂；腦缺血灌注；氧化應(yīng)激；超氧化物歧化酶；丙二醛

丹參是唇型科植物丹參的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、調(diào)經(jīng)止痛和養(yǎng)血安神等功效。丹參具有改善微循環(huán)、清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化等作用，并廣泛應(yīng)用于冠心病、缺血性腦卒中等缺血性疾病的臨床治療。丹參既可單獨使用亦可與其他多種藥物配伍用于缺血性心腦血管病的治療。丹參酮(tanshinone，Tan)是丹參中脂溶性二萜類化合物，按其結(jié)構(gòu)可分為丹參酮ⅡA(TanⅡA)、丹參酮ⅡB和隱丹參酮等，其中丹參酮ⅡA是丹參中主要成分[1]。磷脂酰膽堿是乙酰膽堿的前體，其在體內(nèi)水解成膽堿等物質(zhì)，參與大腦的記憶和思維活動[2]。而丹參磷脂浸膏(danshenlinzhi,DSLZ)對于腦缺血的影響國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。本研究觀察DSLZ(丹參酮ⅡA∶磷脂酰膽堿比例為2∶1)對于腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。

1　材料與方法

1.1動物、主要試劑和儀器雄性Wistar大鼠120只，體質(zhì)量180～220 g，購自吉林大學動物中心，清潔級，動物許可證編號:SYXK(吉)2007-0011。DSLZ由吉林大學化學學院提供，丹參酮ⅡA(Sigma公司，美國，批號：A02121005)，超氧化物歧化酶(SOD) 、丙二醛(NO)和一氧化氮(NO)試劑盒(南京建成生物公司，中國)。LR56495型臺式低溫高速離心機(Thermoerectron公司，美國)，RS232酶標儀(Sunrise公司，美國)，CX21FS1C光學顯微鏡(奧林巴斯有限公司，日本)。

1.2動物分組和給藥雄性Wistar大鼠平均分為2批，第1批用于觀察大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死面積，第2批用于檢測大鼠腦組織 中SOD 活性、MDA和 NO水平及病理組織形態(tài)學，每批大鼠60只，每批大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、陽性對照丹參酮ⅡA(20.0 mg·kg-1)組和低、中、高劑量DSLZ組(5.0、10.0、20.0 mg·kg-1，以丹參酮ⅡA計)，每組10只。DSLZ用大豆油配制備用。在大鼠腦缺血再灌注損傷模型制備前，連續(xù)灌胃給藥10 d。假手術(shù)組和模型組大鼠給予同體積的大豆油。

1.3大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的制備于末次給藥后30 min，大鼠經(jīng)腹腔注射20%烏拉坦(1 g·kg-1)麻醉。行頸正中切口，分離右側(cè)頸總動脈(arteria carotis communis,CCA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA)及頸外動脈(external carotid artery,ECA)，用動脈夾夾閉CCA，并在CCA剪開一小口，將直徑0.175 mm的尼龍線插入約18 mm，阻塞大腦中動脈起始部，然后逐層縫合肌肉和皮膚，單籠飼養(yǎng)。術(shù)后自由進食水，2 h后拔出栓線使血流再灌注22 h，假手術(shù)組大鼠僅分離右側(cè) CCA、ICA和ECA，其余同上。

1.4大鼠神經(jīng)功能評分大鼠再灌注 22 h后進行行為指標評分：活動正常大鼠為 0分；豎毛、輕度運動低下大鼠為 0.5分；前肢屈曲運動障礙大鼠為 1.0分；行動不協(xié)調(diào)、旋轉(zhuǎn)運動大鼠為2.0分；偏癱、不能站立和行走大鼠為 3.0分；痙攣、昏睡大鼠為 4.0分；死亡大鼠為 5.0分(術(shù)后2 h以上死亡)。

1.5大鼠腦梗死面積百分比測定大鼠斷頭取腦，將腦組織行冠狀切片，間隔4 mm，共5片，放入2% TTC磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)37℃水浴中10 min，正常大鼠腦組織呈深紅色，梗死的腦組織呈白色。將每片組織照相，應(yīng)用BI2000軟件處理系統(tǒng)計算各部分面積，腦梗死面積百分比=非染色區(qū)面積之和/腦組織面積之和×100%。

1.6大鼠腦組織中SOD活性和MDA、NO水平測定實驗結(jié)束后，處死大鼠，冰上斷頭取腦，制備10%腦組織勻漿，采用SOD、MDA和NO檢測試劑盒進行檢測。

1.7大鼠腦組織病理學檢測取大鼠腦組織，用10%甲醛固定，0.01 mol·L-1PBS浸泡過夜，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇復(fù)水后，行HE染色，再進行梯度乙醇脫水，滴加中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。

2　結(jié)　果

2.1大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死面積百分比與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分升高(P<0.05)，TTC染色可見明顯的梗死灶，說明模型成立。與模型組比較，中、高劑量DSLZ組及陽性對照丹參酮ⅡA組大鼠腦梗死面積百分比明顯縮小(P<0.05或P<0.01)，神經(jīng)功能評分均明顯降低(P<0.05)。見表1和圖1(插頁三)。

2.2大鼠腦組織中SOD活性和MDA、NO水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中MDA、NO水平明顯增高，SOD活性明顯減低(P<0.01)；與模型組比較，低、中、高劑量DSLZ組大鼠腦組織中MDA和NO水平呈劑量依賴性降低，其中，中、高劑量DSLZ組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，中、高劑量DSLZ組大鼠腦組織中SOD活性明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表1各組大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死面積百分比

GroupNeurologicscorePercentageofinfarctionarea(η/%)Sham0 0Model3.30±0.67*43.90±2.70*TanⅡA2.28±0.28△31.70±2.50△DSLZ(mg·kg-1) 5.02.75±0.3239.30±5.10 10.02.55±0.49△32.70±3.15△ 20.02.15±0.43△26.60±2.70△△

*P<0.05 compared with sham group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.

表2　各組大鼠腦組織中SOD活性和MDA、NO 水平

*P<0.01 compared with sham group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.

2.3各組大鼠腦組織病理形態(tài)學假手術(shù)組大鼠神經(jīng)細胞膜清晰完整，無水腫，核仁清晰可見。模型組大鼠神經(jīng)細胞膜不清，出現(xiàn)腫脹，變形，神經(jīng)細胞壞死，間質(zhì)水腫，細胞間隙增大。高劑量DSLZ組大鼠神經(jīng)細胞核仁清晰，間質(zhì)輕微水腫，腦組織損傷程度較陽性藥丹參酮ⅡA組大鼠減輕。見圖2(插頁三)。

3　討　論

腦功能活動的正常有賴于一定量的腦血流供應(yīng)，當血流供應(yīng)突然停止或突然減少，會引起腦功能損傷，動物則表現(xiàn)為不同程度的神經(jīng)功能缺損。缺血一定時間后即使恢復(fù)血流供應(yīng)，損傷仍進一步加重，病理檢測顯示動脈供血區(qū)出現(xiàn)梗死灶，神經(jīng)細胞變性和壞死[3]。研究[4-5]表明：丹參能夠減輕氧化應(yīng)激損傷，縮小急性心肌梗死范圍。亦有研究[6]表明：磷脂酰膽堿具有防治心血管疾病、增強記憶力等多種功能作用。本研究結(jié)果顯示：DSLZ能夠縮小腦梗死面積，減輕神經(jīng)細胞損傷程度，改善大鼠行為指標,DSLZ治療腦缺血再灌注損傷效果強于單獨應(yīng)用丹參酮ⅡA。

腦缺血再灌注時自由基(oxygen free radical,OFR)大量產(chǎn)生，此時腦組織清除自由基的能力則下降，體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，造成OFR大量堆積， 導(dǎo)致腦組織氧化損傷。研究[7-9]顯示：OFR增加是再灌注損傷的主要機制之一。腦缺血再灌注時OFR生成增多已被大量的研究所證實，大鼠大腦中動脈結(jié)扎15 min后羥自由基開始升高，可持續(xù)到再灌注30 min。在腦缺血早期， 由一氧化氮合酶(NOS) 催化 L-精氨酸生成的內(nèi)源性 NO 主要表現(xiàn)為腦保護作用；而在缺血中后期， 因疾病處于持續(xù)狀 態(tài)，NOS 表達增多，產(chǎn)生大量 NO，對細胞產(chǎn)生嚴重的毒性作用，此結(jié)果與國內(nèi)研究[10-12]相似。OFR可損害神經(jīng)元等富含脂質(zhì)的腦細胞，使多聚不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，促使多糖分子聚合和解聚，引起生物膜裂解，蛋白質(zhì)變性，酶喪失活性，神經(jīng)元死亡或凋亡。SOD 是一種抗氧化酶，其活性的高低可直接反映組織 清除自由基的能力。MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其水平可間接反映組織的損傷程度。本研究結(jié)果顯示：DSLZ可提高大鼠腦組織中SOD活性，降低MDA水平，同時降低腦組織中NO水平，說明DSLZ能夠減輕NO神經(jīng)毒性作用。

綜上所述，丹參酮ⅡA與磷脂酰膽堿配伍對腦缺血再灌注損傷具有良好的防治作用，本研究為DSLZ成為臨床治療腦缺血的藥物提供了實驗依據(jù)[13-16]。

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*吉林大學臨床醫(yī)學院2011級臨床醫(yī)學專業(yè)

Protective effect of Danshenlinzhi on cerebral ischemia reperfusion injury in rats and its mechanism

QU Yuan1,FU Danyang*,JI Yingshi2

(1.Department of Orthopedics,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China; 3.Department of Pharmacology,School of Basic Medical Sciences,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of Danshenlinzhi(DSLZ) on the cerebral ischemia reperfusion injury in the rats, and to explore its mechanism. Methods60 Wistar rats were randomly divided into sham group,model group,TanⅡA group, and low,middle,high, doses (5.0,10.0,20.0 mg·kg-1) of DSLZ groups(n=10). The thread embolism was performed to establish the rat models of focal cerebral ischemia reperfusion injury. The neurologic scores of the rats after 2 h ischemia and 22 h reperfusion were measured and the percentages of the cerebral infarction area of the rats were detected by TTC staining method; the pathomorphology of the brain tissue of the rats was detected by HE staining. The activities of superoxide dismutase (SOD) and levels of malondialdehyde(MDA),nitric oxide (NO) in the brain tissue of the rats were detected.ResultsCompared with sham group,the neurologic score of the rats in model group was increased(P<0.05),the percentages of the cerebral infarction area was increased(P<0.05),the activity of SOD was decreased(P<0.01) and the levels of MDA and NO were increased (P<0.01). Compared with model group,the neurologic scores of the rats in middle and high doses of DSLZ groups were decreased and the percentages of the cerebral infarction area were decreased,the activities of SOD were increased and the levels of MDA and NO were decreased(P<0.05 orP<0.01).The HE staining results showed the membrane of neurocyte was unclear,and the cells became swelling,deformation or necrosis,severe edema in interstitium and the cell space was enlarged in model group;the nucleolus could be found clearly and there was slight edema in interstitium of the cells of the rats in high dose of DSLZ group. ConclusionDSLZ has a protective effect on the cerebral ischemia reperfusion injury of the rats,and its mechanism may be related to the anti-radical damage and lessening the neurotoxicity of NO.

Danshenlinzhi; cerebral ischemia reperfusion injury; oxidative stress; superoxide dismutase; malondialdehyde

1671-587Ⅹ(2015)02-0291-04

10.13481/j.1671-587x.20150216

2014-10-29

吉林省科技廳創(chuàng)新型企業(yè)科技項目資助課題(20140310001)

曲圓(1989-)，吉林省長春市人，在讀醫(yī)學碩士，主要從事股骨頭缺血壞死的藥物治療方面的研究。

紀影實，副教授，碩士研究生導(dǎo)師(Tel:0431-85619799,E-mail:jiyingshi@126.com)

R541.4

A