五味子多糖對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞體外增殖及侵襲能力的抑制作用

黃曉東，路　倩，沈　楠，王艷春

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，吉林 吉林 132013)

五味子多糖對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞體外增殖及侵襲能力的抑制作用

黃曉東1，路倩1，沈楠2，王艷春1

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，吉林 吉林 132013)

目的：探討五味子多糖(ASPS)對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖和侵襲活性的影響，闡明ASPS的抗腫瘤作用。方法：40只 Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(給予生理鹽水)和100、200、400 mg·kg-1ASPS組，每組10只，取各組大鼠血清,HT-29細(xì)胞體外培養(yǎng)，以各組大鼠血清進(jìn)行預(yù)處理，采用MTT法和Transwell小室檢測(cè)各組HT-29細(xì)胞的增殖抑制率和侵襲活性抑制率；Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中bcl-2、bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與對(duì)照組和100 mg·kg-1ASPS組比較，200和400 mg·kg-1ASPS組HT-29細(xì)胞增殖抑制率和侵襲活性抑制率均升高(P<0.05，P<0.01)。400 mg·kg-1ASPS組HT-29細(xì)胞上清液中bcl-2蛋白表達(dá)水平低于其他組(P<0.05，P<0.01),bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：ASPS能顯著抑制細(xì)胞的體外增殖和侵襲能力，其機(jī)制可能與下調(diào)HT-29細(xì)胞的bcl-2基因表達(dá)，上調(diào)bax和Caspase-3基因表達(dá)，激活細(xì)胞凋亡通道有關(guān)聯(lián)。

結(jié)直腸腫瘤；五味子多糖；侵襲活性；細(xì)胞凋亡

直腸癌患者死亡的主要原因是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，控制惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移非常重要。五味子多糖(AlkalineS.chinensispolysaccharides，ASPS)為中藥北五味子中的主要成分，含有多種果糖、多聚糖、氨基酸和10余種微量元素[1-2]。大量研究[3-5]表明：ASPS可以抗腫瘤，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但是其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及其機(jī)制均未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用ASPS含藥血清對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，觀察ASPS對(duì)HT-29細(xì)胞增殖和侵襲活性的抑制作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供；40只Wistar大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK吉-2012-0104)。ASPS由吉林大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室自提，純度為91.4%；bax鼠抗人單克隆抗體、bcl-2鼠抗人單克隆抗體、FITC-羊抗鼠單克隆抗體、兔抗人β-肌動(dòng)蛋白多克隆抗體和鼠抗人Caspase-3單克隆抗體購(gòu)于北京中杉公司；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司；蛋白Marker和PVDF膜購(gòu)于凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 ASPS血清的制備40只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和100、200、400 mg·kg-1ASPS組，每組10只。各ASPS組大鼠給予灌胃ASPS，每天2次，對(duì)照組大鼠灌胃生理鹽水，連續(xù)7 d。麻醉大鼠后，腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清，56℃水浴中，滅活30 min后，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，-20℃保存。

1.3MTT法檢測(cè)HT-29細(xì)胞增殖抑制率用RPMI-1640培養(yǎng)基配制HT-29細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔加200 μL，培養(yǎng)24 h；取出孔板棄去上清，加入10% ASPS血清200 μL，培養(yǎng)72 h；再棄上清，加入200 μL MTT(0.5 g·L-1)，作用4 h后，吸去上清，加入200 μL DMSO，搖床混勻10 min，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.4Transwell小室法檢測(cè)HT-29細(xì)胞的侵襲活性抑制率取HT-29細(xì)胞1×105mL-1，接種于Transwell板的上室，每孔160 μL，再加入20% ASPS血清40 μL，將800 μL RPMI-1640培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)24 h。倒置上室，甲醇固定20 min，PBS漂洗×2，染色5 min，蒸餾水漂洗，1%鹽酸酒精浸泡10 s，再用蒸餾水漂洗，淡氨水浸泡5 min，漂洗，依次放入體積分?jǐn)?shù)為90% 和100%的酒精脫水，剪下濾膜，正置載玻片上，計(jì)數(shù)。觀察中央和上下左右各5個(gè)視野的侵入濾膜細(xì)胞數(shù)，取均值。侵襲活性抑制率=(對(duì)照組侵入濾膜細(xì)胞數(shù)-ASPS組侵入濾膜細(xì)胞數(shù))/對(duì)照組侵入濾膜細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5Western blotting法測(cè)定HT-29細(xì)胞上清液中bcl-2、bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平取HT-29細(xì)胞1×105個(gè)，培養(yǎng)24 h，加入不同濃度ASPS組血清，處理48 h后，收集細(xì)胞。bradford法提取蛋白，將20 μg蛋白加入緩沖液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，室溫下PBS-T洗膜3次，分別加入1∶200稀釋一抗4℃孵育過(guò)夜，再分別加入1∶1 000稀釋的相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，室溫PBS-T洗3次，DAB顯色。Imagel凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，目的條帶凈灰度值與內(nèi)參照β-actin測(cè)定值的比值即蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)　果

2.1各組HT-29細(xì)胞增殖抑制率和侵襲活性抑制率MTT檢測(cè)：不同濃度ASPS含藥血清培育72 h后，HT-29細(xì)胞株均表現(xiàn)為抑制，200和400 mg·kg-1ASPS組HT-29細(xì)胞增殖抑制率均高于對(duì)照組和100 mg·kg-1ASPS組(P<0.05或P<0.01)。200和400 mg·kg-1ASPS組HT-29細(xì)胞侵襲活性抑制率均高于對(duì)照組和100 mg·kg-1ASPS組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1各組HT-29細(xì)胞增殖抑制率和侵襲活性抑制率

GroupInhibitoryrateofproliferationInhibitoryrateofinvasionabilityControl1.02±0.601.71±1.14ASPS(mg·kg-1) 1004.02±2.702.88±1.72 20010.52±5.20*△44.37±18.91*△ 40013.75±3.40**△48.47±26.38*△

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05vs100 mg·kg-1ASPS group.

2.2HT-29細(xì)胞上清液中bcl-2、bax和 Caspase-3蛋白的表達(dá)免疫印跡法檢測(cè)：與對(duì)照組比較，400 mg·kg-1ASPS組HT-29細(xì)胞上清液中bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)，200和400 mg·kg-1ASPS組HT-29細(xì)胞上清液中bax蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。Caspase-3條帶隨ASPS濃度的增大而明顯變深，與對(duì)照組比較，200和400 mg·kg-1ASPS 組HT-29細(xì)胞上清液中Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表2。

Lane 1: Control group;Lane 2-4: 100，200，and 400 mg·kg-1ASPS groups.

圖1各組HT-29細(xì)胞上清液中bcl-2、bax和 Caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.1Electrophoregram of expressions of bax,bcl-2,and Caspase-3 proteins in supernatant of HT-29 cells in various groups

3　討　論

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，行切除術(shù)后的患者有一半以上會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，有50%～60%結(jié)直腸癌患者表現(xiàn)為進(jìn)行性肝轉(zhuǎn)移[6]。除手術(shù)治療外，化療所用的常用藥物在殺滅結(jié)腸癌細(xì)胞同時(shí)，也會(huì)損害正常細(xì)胞，所以對(duì)患者傷害較大。ASPS在提高機(jī)體的非特異性免疫功能的同時(shí)，還可以升高外周血白細(xì)胞數(shù)，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能和體液免疫功能，提高機(jī)體的抗癌能力[7]。本實(shí)驗(yàn)觀察了含ASPS血清對(duì)HT29細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果顯示：ASPS血清可以明顯抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株的增殖，200、400 mg·kg-1ASPS組細(xì)胞增殖抑制率分別為10.52%±5.2%、13.75%±3.4%，說(shuō)明ASPS可以抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖。

表2各組HT-29細(xì)胞上清液中bcl-2、bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平

Groupbcl-2proteinbaxproteinCaspase-3proteinControl0.94±0.600.07±0.060.82±0.70ASPS(mg·kg-1) 1000.87±0.500.42±0.040.83±0.40 2000.91±0.700.97±1.03*0.92±0.70* 4000.28±0.50**0.94±0.91*0.98±0.80*

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

惡性腫瘤的最主要標(biāo)志是侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。脫離原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞，在黏連蛋白等表面黏附分子的特異性黏附作用下黏附于器官表面，并穿入細(xì)胞間隙釋放基質(zhì)蛋白水解酶，降解局部基質(zhì)，穿過(guò)基底膜后，向周圍間質(zhì)侵潤(rùn)性生長(zhǎng)，大量增殖成新的腫瘤[9]。腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移最先到達(dá)的就是細(xì)胞基底膜。Transwell小室模型中，腫瘤細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)凝膠，到達(dá)另一側(cè)，計(jì)算其數(shù)量，可反映其侵襲活性[10-11]。本實(shí)驗(yàn)采用Transwell小室做為模型，觀察ASPS含藥血清對(duì)HT-29細(xì)胞體外侵襲活性的抑制作用，結(jié)果表明：ASPS含藥血清可以明顯抑制HT-29體外侵襲基底膜Matrigel成分，其抑制率高于對(duì)照組，說(shuō)明ASPS對(duì)結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有抑制作用。

bcl-2基因家族主要作用于細(xì)胞線粒體[12]，其中bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，兩者功能相反卻共同參與著細(xì)胞凋亡，bcl-2/bax比值是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素[13]。bcl-2家族蛋白與蛋白酪氨酸磷酸酶結(jié)合，開(kāi)放線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)孔通道，釋放大量細(xì)胞色素C，結(jié)合細(xì)胞凋亡激活因子Apaf-1，使Caspase-9前體活化，促使Caspase-3激活，引發(fā)Caspases 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[14-15]。本研究中Western blotting結(jié)果表明：HT-29細(xì)胞在ASPS含藥血清處理下，上清中bcl-2蛋白表達(dá)條帶變窄、變淺，bax蛋白表達(dá)條帶明顯變寬、變深，說(shuō)明bax基因的表達(dá)產(chǎn)物隨ASPS濃度的升高而表達(dá)增加，bcl-2基因的表達(dá)產(chǎn)物水平隨之降低。同時(shí)，Caspase-3蛋白表達(dá)水平也隨著ASPS濃度升高而升高。說(shuō)明ASPS可能通過(guò)調(diào)節(jié)HT-29細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，使bax基因的表達(dá)上調(diào)，bcl-2表達(dá)下調(diào)，激活Caspase凋亡通路，而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

綜上所述，ASPS對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這為臨床開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了理論依據(jù)，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Inhibitory effects ofAlkalineS.chinenispolysaccharides on proliferation and invasion abilities of colon cancer HT-29 cellsinvitro

HUANG Xiaodong1,LU Qian1,SHEN Nan2,WANG Yanchun1

(1.Department of Pharmacology,Jilin Medical College,Jilin 132013,China;2.Function Experiment Center, Jilin Medical College,Jilin 132013,China)

ObjectiveTo investigate the effect ofAlkalineS.chinenispolysaccharides(ASPS) on the proliferation and invasion abilities of the human colon cancer HT-29 cells,and to clarify the anti-tumor effect of ASPS.Methods40 Wistar rates were randomly divided into control group(n=10,given saline),and 100,200,400 mg·kg-1ASPS groups(n=10),respectively.The serum of the rats in various groups were gotten.The HT-29 cells were treated with the serum of the rats in various groups. The inhibitory rates of proliferation and invasion abilities were tested by MTT and Transwell assay;the expression levels of bcl-2,bax,and Caspase-3 proteins in the supernatant of the cells of the rats in various groups were determined by Western blotting method.ResultsCompared with control group,the inhibitory rates of proliferation and invasion abilities of the HT-29 cells in 200 and 400 mg·kg-1ASPS groups were increased(P<0.05,P<0.01).The expression level of bcl-2 protein in 400 mg·kg-1ASPS group was lower than those in other groups (P<0.05),while the expression levels of bax and Caspase-3 proteins were higher than those in control group(P<0.05,P<0.01).ConclusionASPS can inhibit the proliferation and invasion abilities of the human colon cancer HT-29 cells,and its mechanism may be related to down-regulating the expression of bcl-2 protein and up-regulating the expressions of bax and Caspase-3 proteins,thus activating the apoptotic pathway of HT-29 cells.

colon cancer；AlkalineS.chinensispolysaccharides； invasive ability； apoptosis

1671-587Ⅹ(2015)02-0287-04

10.13481/j.1671-587x.20150215

2014-08-26

吉林省教育廳“十二五”科研項(xiàng)目資助課題(2014547)

黃曉東(1978-)，男，遼寧省撫順市人，講師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事腫瘤藥理學(xué)方面的研究。

王艷春，教授，碩士研究生導(dǎo)師(Tel：0432-64560470，E-mail：wangyanchun1972@163.com)

R730.52；R735.3

A