異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌脫氮同時降解苯酚特性

王國英,崔 杰,岳秀萍,李亞男,賈子龍 （太原理工大學環(huán)境科學與工程學院,山西 太原 030024）

異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌脫氮同時降解苯酚特性

王國英,崔 杰,岳秀萍*,李亞男,賈子龍 （太原理工大學環(huán)境科學與工程學院,山西 太原 030024）

研究了異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌Diaphorobacter sp. PDB3去除氨氮同時降解苯酚的特性.在最佳碳氮比7和搖床轉速160r/min下,該菌在21h內對初始濃度365mg/L苯酚的降解率達94.9%,總有機碳去除率達90.8%,同時40mg N/L氨氮被完全去除,中間代謝物硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮逐漸積累并在后期降低.氮平衡分析表明,52.3%的氨氮轉化為胞內氮,37.2%轉化為氮氣,菌株主要通過細胞同化作用和異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用去除氨氮.檢測到羥胺氧化酶、硝酸還原酶及亞硝酸還原酶活性,表明菌株PDB3具有完整的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化偶聯(lián)途徑.隨著苯酚濃度升高,抑制作用增強,脫氮效率降低.

異養(yǎng)硝化；好氧反硝化；苯酚；氨氮

苯酚是焦化、石油化工等工業(yè)排放廢水中主要污染物之一［1-2］.酚類廢水往往同時含有氨氮,是水體中的主要耗氧污染物［3］.因此同時去除苯酚和氨氮對于含氨氮酚類廢水的高效處理十分必要.一些研究者［4-7］發(fā)現(xiàn),苯酚和氨氮的去除可通過自養(yǎng)硝化菌和異養(yǎng)菌在好氧條件下配合完成,但是苯酚對自養(yǎng)硝化產生強抑制作用,降低硝化速率,如 Amor等［4］發(fā)現(xiàn),苯酚完全降解后硝化反應才開始,Liu等［7］發(fā)現(xiàn),15mg/L苯酚存在時硝化產物硝態(tài)氮的產生速率為沒有苯酚時的 77%.此外,氨氮僅被氧化為硝態(tài)氮或亞硝態(tài)氮,其仍需在厭氧或缺氧條件下還原為氮氣,造成系統(tǒng)復雜、過程耗時.

傳統(tǒng)脫氮理論認為硝化和反硝化是兩個獨立的過程［8-9］.然而近些年來,一些異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌被分離出來［10-14］,這些細菌進行異養(yǎng)硝化同時進行好氧反硝化反應,將氨氮最終轉化為氮氣.與自養(yǎng)硝化菌比,這些菌具有生長速度快,環(huán)境適應能力強,去除氨氮同時降解有機物等優(yōu)點.但是此類研究多以乙酸、琥珀酸和檸檬酸等有機酸為碳源,對以毒害物質如苯酚、甲酚等為底物的研究鮮有報道.

本實驗室前期分離得到一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化苯酚降解菌Diaphorobacter sp. PDB3［15］,對其降解苯酚和反硝化特征進行了研究,但是其異養(yǎng)硝化特性和脫氮途徑還未明了.本研究考察菌種的氨氮去除和苯酚降解特征,對脫氮產物及脫氮途徑進行分析,為異養(yǎng)硝化-好氧反硝化苯酚降解菌的實際應用提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化苯酚降解菌Diaphorobacter sp. PDB3由本實驗室篩選保藏［15］.

1.1.2培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10,酵母浸出粉 5,NaCl 10.pH 7.2.

無機鹽培養(yǎng)基（g/L）：NH4Cl 0.153,K2HPO40.5, KH2PO40.5, CaCl20.1, MgSO4?7H2O 0.2, NaMoO4?2H2O 0.01, MnSO4?H2O 0.01, Fe2（SO4）3?H2O 0.01, ZnSO4?7H2O 0.01, CuSO4?5H2O 0.01, CoCl2?6H2O 0.01.pH 7.2.

以上培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌器在 121℃滅菌20min,苯酚按需要量加入.

1.2實驗方法

1.2.1搖床實驗 將菌株接種至含有 100mg/L苯酚的LB培養(yǎng)液中,在搖床中連續(xù)活化2代,將細胞清洗后接種至含有苯酚的100mL無機鹽培養(yǎng)基中,30℃下?lián)u瓶振蕩培養(yǎng),每隔適宜時間取樣檢測細胞濃度,在4℃及8000r/min下離心15min,取上清液測量苯酚、總有機碳（TOC）、總氮（TN）、NH4+-N、NH2OH-N、NO3--N及NO2--N含量.

1.2.2氮平衡分析實驗 將100mL含有苯酚的無機鹽培養(yǎng)基裝入250mL厭氧瓶,接種后向厭氧瓶中充入純氧氣,用瓶塞塞緊瓶口,在 30℃下振蕩培養(yǎng)27h.用注射器取瓶中氣體測量O2、N2和N2O含量.取培養(yǎng)液離心后取上清液測量苯酚、TN、NH4+-N、NH2OH-N、NO3--N及NO2--N,取沉淀測量胞內氮.

1.2.3細胞粗酶液的提取 將菌株接種至無機鹽培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期,將菌液在4℃,12000r/min下離心,收集菌體,用磷酸鹽緩沖液清洗2次后重懸細胞,置于冰水混合物中,用超聲破碎儀破碎細胞,再次12000r/min離心,收集上清液,即為粗酶液.以上實驗均重復3次.

1.3分析方法

細胞濃度的測定采用可見分光光度法,在600nm波長下測定培養(yǎng)液的吸光度（OD600）,根據(jù)細胞干重標準曲線將其轉換為細胞干重；溶解氧采用溶解氧分析儀（HQ30d,美國哈希）測量；TOC 和TN用TOC/TN分析儀 （TOC-VCPH/TNM-1,日本島津）測量； NH4+-N、NO2--N和NO3--N的測定分別采用納氏試劑分光光度法、N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法和酚二磺酸分光光度法；NH2OH-N測定參照文獻［16］；有機氮為TN減去NH4+-N、NO2--N及NO3--N之和；胞內氮含量用元素分析儀（EA3000,意大利歐維特）測量；苯酚用高效液相色譜儀（P1201,大連依力特）測量；O2和 N2用配有熱導檢測器的氣相色譜儀（456GC,美國布魯克）測量；N2O用配有電子捕獲器的氣相色譜儀（6890,美國安捷倫）測量.

酶活分析參照 Zhao等［17］的方法：羥胺氧化酶測定體系10mL,內含10mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.1）,0.11mmol/L細胞色素c和粗酶液；硝酸還原酶和亞硝酸還原酶測定體系各 10mL,內含10mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.4）,0.2mmol/L NADH和粗酶液.分別向反應體系中加入羥胺、NaNO3及 NaNO2,并測定羥胺消耗速率、NO2-生成速率及 NO2-消耗速率.總蛋白含量用Bradford法測定［18］.活力單位（U）為每分鐘轉化1μmol 底物所需酶量.酶的比活力以每毫克的蛋白質中所含酶的活力單位數(shù)計算.

2　結果與討論

2.1碳氮比對苯酚降解和氨氮去除的影響

如圖 1所示,隨著碳氮比升高,Diaphorobacter sp. PDB3對氨氮的去除率升高,苯酚降解率降低,當碳氮比升高至13時,苯酚降解率下降至61.2%.苯酚為菌體生長代謝提供能源和碳源,低碳氮比時碳源不足,細胞代謝能力不足,導致氨氮去除率較低；高碳氮比時,碳源的供給高于菌體所需,碳源濃度不再是限制性因素,氨氮去除率不再增加.當碳氮比為7時,苯酚降解率和氨氮去除率都處于較高的水平,因此最佳碳氮比為7.

圖1　碳氮比對苯酚降解和氨氮去除的影響Fig.4　Effect of C/N ratio on phenol degradation and ammonium removal

2.2搖床轉速對苯酚降解和氨氮去除的影響

圖2　搖床轉速對菌株培養(yǎng)15h后苯酚降解和氨氮去除的影響Fig.4　Effect of shaking speed on phenol degradation and ammonium removal after strain incubation for 15h

苯酚好氧降解的第一步是苯酚被苯酚羥化酶催化為鄰苯二酚,異養(yǎng)硝化的第一步是氨被氨單加氧酶催化為羥胺,這2個反應都需要氧分子的參與,因此溶氧可影響 Diaphorobacter sp. PDB3的苯酚降解和氨氮去除能力.在搖床轉速80,120,160,200r/min下實驗初期（1h）培養(yǎng)液的溶氧 分 別 為 （5.43±0.02）,（6.11±0.03）,（6.62±0.04）,（6.80±0.04）mg/L,因此提高搖床轉速可以提高培養(yǎng)液中溶氧水平.如圖2所示,隨著搖床轉速提高,苯酚降解率和氨氮去除率均提高；搖床轉速達到160r/min時,苯酚降解率漸趨穩(wěn)定,氨氮去除率達到最大；當搖床轉速為200r/min時,苯酚降解率沒有明顯變化,表明溶氧不再是苯酚降解的限制因素,而氨氮去除率降低,說明溶氧過低或過高均不利于氨氮去除,與 Acinetobacter sp. Y16［19］和Bacillus methylotrophicus strain L7［11］的特性一致.選擇160r/min為最佳搖床轉速.

2.3菌體生長及異養(yǎng)硝化-好氧反硝化特性

如圖3a所示,菌體經歷3h的延滯期后,進入對數(shù)生長期,細胞濃度快速增長,最大比生長速率為0.14/h,高于自養(yǎng)硝化菌Nitrosomonas europaea的0.03～0.05/h［20］.苯酚在細胞對數(shù)生長期被大量降解,于21h降解率達到94.9%.細胞生長與苯酚降解是同步的,證明了菌株的異養(yǎng)代謝能力.總有機碳與苯酚的降解趨勢相似,21h去除率為 90.8%,表明培養(yǎng)液中剩余有機物含量較低,苯酚主要轉化為無機碳和胞內碳.

氨氮濃度在細胞對數(shù)生長期內顯著降低（圖3b）,最終于 21h被完全去除,最大去除速率為3.2mg NH4+-N/（L?h）.Alcaligenes faecalis no.4［21］和Acinetobacter junii YB［10］的最大去除速率分別為24,10.09mg NH4+-N/（L?h）,均高于本研究.這些報道中所用碳源為檸檬酸鹽和琥珀酸鹽,比苯酚更容易被細胞利用,且沒有毒性,細胞生長速度快,因此有更高的氨氮去除速率.

隨著氨氮的消耗,中間代謝物 NO2-和 NO3-逐漸積累,最大濃度分別于12h和9h達到1.07, 1.92mg N/L,隨后逐漸降低,沒有檢測到NH2OH-N,可能被迅速轉化為下游代謝物.其它異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的研究［10-12］中同樣發(fā)現(xiàn)了硝化產物的積累和消耗.原因可能是實驗前期氨氮充足,異養(yǎng)硝化作用強于好氧反硝化作用,硝化產物累積；后期氨氮濃度降低,好氧反硝化作用強于異養(yǎng)硝化作用,硝化產物被還原. Acinetobacter calcoaceticus HNR［17］和Alcaligenes faecalis NR［22］表現(xiàn)出不同的變化特征,這2株菌無法利用硝態(tài)氮進行反硝化反應,在脫氮過程后期硝態(tài)氮濃度沒有降低,而是逐漸積累.本文中硝態(tài)氮后期的變化情況及前期研究［15］均表明,菌株PDB3能夠以硝態(tài)氮為底物進行反硝化反應.總氮與氨氮的去除趨勢相似,最終去除率為 96.3%,沒有完全去除的主要原因是代謝中間物和細胞裂解物的積累.

圖3　菌株在苯酚初始濃度為365mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中苯酚降解,菌體生長及氨氮去除曲線Fig.4　Characteristics of phenol degradation, ammonium removal and cell growth in the mineral salt medium with initial phenol concentration of 365mg/L

Wehrfritz等［23］提出的異養(yǎng)硝化代謝理論認為,氨單加氧酶催化NH3生成NH2OH,這個過程由還原型輔酶Q提供電子；NH2OH轉化NO2--N過程產生的電子通過細胞色素復合物傳遞給反硝化還原酶系,不像自養(yǎng)硝化菌中電子傳遞給輔酶Q.因此輔酶Q是通過有機碳源的代謝得到電子,從而給氨單加氧酶提供電子.可見異養(yǎng)硝化菌對氨氮的去除和有機碳源的利用是偶聯(lián)的.從圖3可見,苯酚降解趨勢和氨氮去除趨勢相似,苯酚降解產生的電子傳遞給氨單加氧酶,使氨氮同步去除.Amor等［4］和Kim等［5］在污泥降解實驗中發(fā)現(xiàn)苯酚的存在抑制了硝化反應,苯酚完全降解后硝化反應才開始,可見自養(yǎng)硝化與苯酚降解不是偶聯(lián)的.

2.4氮平衡分析

密封瓶實驗中各物質的氮含量如表1所示.在實驗末期,氨氮全部去除,只有少量的硝化產物積累,胞內氮由0.35mg增長到2.43mg,增長量占氨氮去除量的52.3%,氮氣產量為1.48mg,占氨氮去除量的37.2%,沒有檢測到N2O. N2O是好氧反硝化過程的中間代謝物,具有溫室效應. Schalk-Otte等［24］認為,反硝化過程釋放N2O的主要原因是碳源不足,當碳源充足時,電子供應充足,各還原酶之間沒有競爭性抑制,一氧化二氮還原酶的活性可以正常發(fā)揮,使N2O及時轉化為N2,避免N2O逸出.本文中苯酚在實驗末期仍有剩余,碳源充足,是N2O沒有逸出的主要原因.胞內氮和氮氣合計占氨氮去除量的89.5%,可見菌株PDB3主要通過細胞同化作用和異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用脫氮,與其他異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌［10,12,19］的研究結果一致.在實驗末期溶液中含有少量的有機氮,可能來自于細胞裂解物.

表1　菌株PDB3脫氮過程中氮平衡分析Table 1　Nitrogen balance analysis in nitrogen removal by strain PDB3

2.5脫氮途徑分析

異養(yǎng)硝化菌有2種脫氮途徑,常見的是異養(yǎng)硝化-好氧反硝化偶聯(lián)途徑：首先 NH3轉化為NH2OH,羥胺氧化酶催化NH2OH生成NO2-,NO2-可轉化為 NO3-,NO2-和 NO3-分別被亞硝酸還原酶和硝酸還原酶還原為NO和NO2--N,最終被還原為含氮氣體 N2O/N2.和偶聯(lián)途徑不同,Acinetobacter calcoaceticus HNR［17］和Alcaligenes faecalis NR［22］是通過 NH2OH 而非NO2-或NO3-生成含氮氣體,并且沒有亞硝酸還原酶和硝酸還原酶活性.通過測量脫氮途徑中酶的活性,可以明確Diaphorobacter sp. PDB3的脫氮途徑.結果表明羥胺氧化酶、亞硝酸還原酶和硝酸還原酶活性分別為（0.016 ± 0.003）,（0.029 ± 0.005）, （0.012 ± 0.002）U/mg蛋白質，表明菌株PDB3脫氮途徑是異養(yǎng)硝化-好氧反硝化偶聯(lián)途徑（圖4）.

圖4　Diaphorobacter sp. PDB3的脫氮途徑Fig.4　Nitrogen removal pathway of Diaphorobacter sp. PDB3

2.6苯酚濃度對脫氮作用的影響

如圖5所示,隨著苯酚濃度升高,細胞延滯期增長,最終細胞濃度逐漸升高,同時氨氮去除耗時增長.初始苯酚濃度522,679mg/L下,胞內氮增長量占氨氮去除量的比率分別為 56.2%和 61.1%,說明隨著苯酚濃度的升高,更多的氨氮用于合成細胞而不是進入異養(yǎng)硝化途徑.

異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌可以同時通過異養(yǎng)硝化-好氧反硝化途徑和以氧為電子受體的呼吸鏈產能［13,23］,然而前者低于后者的產能效率［23］,在氮源相對較少和溶氧充足時,菌體優(yōu)先利用產能效率高的途徑即氧化呼吸鏈產能,而不是異養(yǎng)硝化-好氧反硝化途徑.同時碳源充足時可以產生更多的碳骨架,有利于細胞生長.因此在更高的苯酚濃度下,更少的氨氮進入異養(yǎng)硝化途徑.

苯酚不僅可以改變細胞膜通透性［25］,而且能夠使酶蛋白變性［26］,其毒害作用隨著濃度增高而加強,也是異養(yǎng)硝化作用減弱的原因之一.自養(yǎng)硝化作用通常對苯酚敏感,例如 Stafford［6］發(fā)現(xiàn)5.6mg/L苯酚對自養(yǎng)硝化作用產生了 75%的抑制,Liu等［7］發(fā)現(xiàn)20mg/L苯酚存在時氨氮去除耗時約為沒有苯酚時的2倍.菌株PDB3在較高的苯酚濃度下仍然發(fā)生異養(yǎng)硝化作用,說明其對苯酚的耐受度比自養(yǎng)硝化菌強. Diaphorobacter sp. PDB3能利用苯酚為碳源去除氨氮,具有一定的處理含氨氮苯酚廢水應用前景；今后將研究相關功能基因的表達,進一步揭示脫氮機理,并研究反應器水平的工藝條件,為其實際應用提供支持.

圖5　苯酚初始濃度365,522,679mg/L對細胞生長和氨氮去除的影響Fig.4　Effect of phenol at initial concentrations of 365, 522 and 679mg/L on cell growth and ammonium removal

3　結論

3.1Diaphorobacter sp. PDB3的最佳苯酚降解和氨氮去除條件為碳氮比 7,搖床轉速160r/min.在此條件下,菌株 21h內對初始濃度365mg/L苯酚的降解率為94.9%,總有機碳去除率為90.8%,同時初始濃度40mg N/L氨氮被完全去除,中間代謝物硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮逐漸積累并在后期降低.

3.2氮平衡分析表明,氨氮去除量的52.3%轉化為胞內氮,37.2%轉化為氮氣,沒有檢測到N2O,菌株主要通過細胞同化作用和異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用去除氨氮.

3.3酶活分析檢測到羥胺氧化酶、硝酸還原酶及亞硝酸還原酶活性,表明菌株 PDB3具有完整的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化偶聯(lián)途徑.

3.4隨著苯酚濃度升高,脫氮效率降低,原因一是菌體優(yōu)先利用氧化呼吸鏈而非異養(yǎng)硝化-好氧反硝化途徑產能,原因二是苯酚的抑制作用增強.

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Simultaneous removal of phenol and ammonium by a heterotrophic nitrifiying-aerobic denitrifying bacterium.

WANG Guo-ying, CUI Jie, YUE Xiu-ping*, LI Ya-nan, JIA Zi-long （College of Environmental Science and Engineering, Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030024, China）.

China Environmental Science, 2015,35（9）：2644～2649

The simultaneous removal of phenol and ammonium by a heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacterium Diaphorobacter sp. PDB3 was investigated. The optimal C/N ratio was 7and the optimal shaking speed was 160r/min. The strain degraded 94.9% of 365mg/L phenol in 21h, and 90.8% of total organic carbon was removed. Simultaneously, ammonium at an initial concentration of 40mg N/L was completely removed. The intermediates nitrate and nitrite accumulated in the early phase and declined in the later phase. The nitrogen balance analysis showed that 52.3% of removed nitrogen was finally transformed to intracellular nitrogen and 37.2% was converted to nitrogen gas. Ammonium was removed mainly through cellular assimilation and heterotrophic nitrification-aerobic denitrification. The detection of hydroxylamine oxidase, nitrate reductase and nitrite reductase activities demonstrated a coupled heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying pathway of strain PDB3. With the increase of phenol concentration, the inhibitory effect increased, leading to lower efficiency of ammonium removal.

heterotrophic nitrification；aerobic denitrification；phenol；ammonium

X703.1

A

1000-6923（2015）09-2644-06

2015-02-10

國家自然科學基金資助項目（51408396,51378330）；山西省青年科技研究基金（2013021023-3）

*責任作者, 教授, yuexiuping@tyut.edu.cn

王國英（1984-）,男,山西太原人,講師,博士,主要從事環(huán)境微生物及水污染控制研究.發(fā)表論文10余篇.