溫陽通竅中藥復(fù)方含藥血清對C6腦膠質(zhì)瘤細胞增殖影響的實驗研究*

白　雪，李　亮，馮文茹，周　潔（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津0019；.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津00150；.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津0000）

·實驗研究·

溫陽通竅中藥復(fù)方含藥血清對C6腦膠質(zhì)瘤細胞增殖影響的實驗研究*

白雪1，2，李亮2，馮文茹3，周潔2
（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津300150；3.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津300020）

［目的］觀察溫陽通竅中藥復(fù)方含藥血清對C6腦膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響。［方法］采用MTT法測定樣品對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞生長的抑制作用，并在藥物代謝不同時間（2 h，4 h，6 h）檢測不同劑量的溫陽通竅中藥復(fù)方對C6腦膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用，同時進行空白組對照比較。［結(jié)果］溫陽通竅中藥復(fù)方對C6細胞的IC50值約為30.29 μg/mL，細胞毒效果欠佳。10%血清濃度下，藥物代謝2、4、6 h后，高、低劑量組對C6腦膠質(zhì)瘤細胞的抑制率分別為30.22%、21.6%、28.3%和32.87%、9.86%、47.98%。［結(jié)論］溫陽通竅中藥復(fù)方對C6腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖具有一定抑制作用，但其抑瘤作用不存在時間與劑量依賴關(guān)系，這一結(jié)果或許與藥物在體內(nèi)代謝、次生活性產(chǎn)物的出現(xiàn)相關(guān)。

溫陽通竅中藥復(fù)方；C6腦膠質(zhì)瘤細胞；增殖

腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率占全部顱內(nèi)腫瘤的40%［1］。生存期短、死亡率高、治療困難，對人類健康威脅極大。目前腦膠質(zhì)瘤治療所堅持的總原則仍然是手術(shù)、放療和化療［2］，但由于其浸潤性生長的生物學(xué)特點，使上述治療手段均難以達到滿意療效，患者中位生存時間平均只有12個月［3］，且骨髓抑制、消化道反應(yīng)等不良反應(yīng)多發(fā)，很多患者因不能耐受而退出治療。在我國，中藥治療一直以來具有傳統(tǒng)優(yōu)勢，因其較好的安全性和一定的有效性在腫瘤的治療中十分重要。溫陽通竅中藥復(fù)方由附子、麻黃、桂枝、蜈蚣、鱉甲、黃芪、川芎、當歸、澤瀉、防己、藁本等藥物組成，以整體觀念、辨證施治理論為指導(dǎo)，以扶正祛邪、標本兼治為治療大法，長期臨床應(yīng)用顯示其對腦膠質(zhì)瘤具有一定療效。為進一步證實其藥效，本課題通過抑瘤實驗，對其進行評估，并探尋其藥理機制。

1　材料與儀器

1.1動物SPF級SD大鼠，21只，雄性，體質(zhì)量（220-240）g（中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，動物許可證號SCXK-（軍）2009-007，動物合格證號0001506）。

1.2瘤株大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細胞（天津市醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院惠贈）。

1.3待測樣品溫陽通竅中藥復(fù)方（天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供；煎藥：600g生藥得浸膏175g，4℃冰箱保存）。

1.4試劑二甲基亞砜分析純（天津市化學(xué)試劑六廠，批號20070428）；培養(yǎng)基DMEM/F12（GIBCO公司，批號1285082）；MTT（北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司，批號T15051/15181）；胎牛血清（GIBCO公司，批號348555）。

1.5儀器CO2孵育箱（TyTe公司，型號C-2021）；內(nèi)熱蒸汽消毒器（山東新華醫(yī)療器械廠，型號yxQG02）；臺式離心機（北京醫(yī)用離心機廠，型號LD4-2）；酶標儀（Labsystems Dragon公司芬蘭產(chǎn)，型號353）；96孔板（Greinerbio-one，No.655180）；倒置顯微鏡（OLYMPUS，日本產(chǎn)）。

2　MTT法測定樣品對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞生長的抑制作用

2.1樣品的配制精密稱取樣品適量，加入含10%牛血清的營養(yǎng)液中，制備成濃度為500 g/L的混懸液，再依次倍比稀釋成10個濃度（實驗時根據(jù)結(jié)果情況調(diào)整樣品的配置濃度）。

2.2方法實驗采用常規(guī)MTT檢測方法。取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，將細胞稀釋成單細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)，接種于96孔板，100 μL/孔。將接種后的細胞置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h細胞貼壁后加樣品，將樣品用DMEM/F12培養(yǎng)液進行倍比稀釋。于96孔板中分別加入不同濃度待測樣品液，100 μL/孔加入樣品。實驗樣品設(shè)250～0.488 g/L 10個濃度。每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，對照設(shè)8個以上復(fù)孔。加樣后仍將細胞置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)72 h，然后加MTT。MTT5 g/L，每孔加10 μL。37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，每孔加入DMSO 150 μL，在酶標儀570 nm測定OD值。

2.3評價指標細胞生長抑制率IC50，抑制率=（1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%，以直線回歸方法計算IC50。

3　觀察溫陽通竅方含藥血清對體外培養(yǎng)的大鼠腦膠質(zhì)瘤增殖的影響

3.1分組SD大鼠21只，采用隨機數(shù)字表法，分成7組，即正常對照組、溫陽通竅中藥復(fù)方高劑量組（26 g/kg）、溫陽通竅中藥復(fù)方低劑量組（13 g/kg），其中高劑量組和低劑量組各分3組分別為2 h采血組、4 h采血組和6 h采血組。

3.2給藥配制高劑量組1.5 g/mL浸膏和低劑量組0.75 g/mL浸膏。除正常對照組給予蒸餾水外，其他各組均給以相應(yīng)受試藥，每日2次，0.5 mL/100 g，連續(xù)給藥7次。

3.3含藥血清的制備末次給藥后2、4、6 h，腹主動脈取血，室溫放置1 h后，離心分離血清，取上清液，同組動物血清等量混合，經(jīng)56℃，30 min滅活后，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

3.4方法取體外培養(yǎng)C6細胞，胰酶消化，用DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋成1.5×104個/mL單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每組設(shè)4個復(fù)孔。加入含藥血清培養(yǎng)液100 μL/孔，使終濃度為10%、20%，同時做相同濃度的正常鼠血清作為對照組，37℃，5%CO2孵育箱培養(yǎng)72 h后加入5 g/L MTT 10μL，作用4h，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO150 μL，輕輕搖動培養(yǎng)板，應(yīng)用酶標儀檢測570nm波長處的0D值。

3.5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0 for windows軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4　結(jié)果

本實驗采用MTT法對溫陽通竅中藥復(fù)方的細胞毒性進行分析。由表1得出溫陽通竅中藥對C6細胞的IC50值約為30.29 μg/mL，細胞毒效果欠佳。而表2可見末次給藥后經(jīng)藥物代謝2、4、6 h后制備含藥血清，將用量為10%、20%血清分別作用于高劑量組、低劑量組及對照組的C6細胞，觀察其細胞毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：10%血清濃度下，高劑量組血清樣本在不同時間對C6腦膠質(zhì)瘤的抑制率分別為30.22%、21.6%、28.3%，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。而低劑量組血清樣本在不同時間對C6腦膠質(zhì)瘤的抑制率分別為32.87%、9.86%、47.98%，在2 h與6 h間具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且作用6 h后效果最佳（P＜0.01）。

表1　溫陽通竅復(fù)方對C6細胞生長作用的影響（±s）Tab.1　The influence of Wenyang Tongqiao prescription to the growth of C6 glioma（±s）

表1　溫陽通竅復(fù)方對C6細胞生長作用的影響（±s）Tab.1　The influence of Wenyang Tongqiao prescription to the growth of C6 glioma（±s）

藥物濃度（g/L）62.5 31.25 15.625 07.8125 03.906 01.953 00.977 00.488 IC50OD值0.146±0.019 0.159±0.030 0.291±0.015 0.355±0.015 0.386±0.026 0.385±0.028 0.403±0.014 0.400±0.015 30.29

表2　溫陽通竅中藥復(fù)方抑制C6膠質(zhì)瘤細胞的增殖（±s）Tab.2　Wenyang Tongqiao prescription restrain the growth of C6 glioma（±s）

表2　溫陽通竅中藥復(fù)方抑制C6膠質(zhì)瘤細胞的增殖（±s）Tab.2　Wenyang Tongqiao prescription restrain the growth of C6 glioma（±s）

注：與10%血清濃度大鼠血清對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.001

組別OD值抑制率10%20%10%20%牛血清對照0.540±0.013大鼠血清對照0.847±0.0950.887±0.135高劑量2 h0.591±0.119*0.868±0.06230.22%02.41%高劑量4 h0.664±0.066*0.701±0.07421.60%21.05%高劑量6 h0.607±0.159*0.682±0.09028.30%23.16%低劑量2 h0.569±0.059*0.831±0.14332.87%06.28%低劑量4 h0.764±0.1170.856±0.13509.86%03.49%低劑量6 h0.441±0.029**0.742±0.14947.98%16.30%

5　討論

惡性腫瘤的發(fā)生是人體內(nèi)部功能平衡失調(diào)以致外邪入侵的復(fù)雜病理過程和必然結(jié)果。中國醫(yī)學(xué)雖未明確記載腦瘤病名，但古醫(yī)籍中所言之“厥逆”、“真頭痛”、“頭風”等癥狀或體征均與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的腦瘤類似。《靈樞·厥病篇》記載:“真頭痛，頭痛甚，腦盡痛，手足寒至節(jié)，死不治?！薄鹅`樞·大惑論》云：“故邪中于項，因逢其身虛，……入于腦則腦轉(zhuǎn)。腦轉(zhuǎn)則引目系急，目系急則目眩以轉(zhuǎn)矣?！薄端貑枴ぶ琳嬉笳摗酚涊d：“頭項囟頂腦戶中痛，目如脫。”《中藏經(jīng)》明確地指出：“頭目久痛，卒視不明者，死?！边@與膠質(zhì)瘤的臨床表現(xiàn)及預(yù)后非常相似。膠質(zhì)瘤的病位雖然在腦，但與肝、脾、腎等臟腑有關(guān)，痰、瘀、毒、虛為其主要的病理因素。其發(fā)病機制有多環(huán)節(jié)參與，但單純用“氣滯血瘀”、“痰濁阻滯”、“氣血凝滯”、“毒邪郁結(jié)”、“氣陰兩虛”的病機理論尚不能完全解釋對惡性腫瘤中醫(yī)藥治療難以收效的臨床現(xiàn)實?！端貑枴ど鷼馔ㄌ煺摗吩疲骸瓣枤庹?，若天與日，失其所則折壽而不彰?！薄鹅`樞·百病始生篇》云：“積之始生，得寒乃生，厥乃成積矣?！被仡檪鹘y(tǒng)中醫(yī)古籍關(guān)于“癥瘕積聚”發(fā)病的認識，“寒凝血瘀”為其主要病機。

溫陽通竅中藥復(fù)方是本課題組治療腦膠質(zhì)瘤的經(jīng)驗方［4］。方中附子為君藥，其性辛、甘，大熱，有大毒，其性剛雄，通行十二經(jīng)，溫五臟之陽，具有回陽救逆，祛風除濕，散寒止痛等功效，《本草經(jīng)讀》：“附子，味辛氣溫，火性迅發(fā)，無所不到，故為回陽救逆第一品藥?！狈街新辄S、桂枝配伍，麻黃辛溫氣薄，善行肌表衛(wèi)分，桂枝色赤入營，善于解肌和營，二者并重，意在取風藥辛溫之性，能暢達陽氣，振奮人體氣化功能，使氣血運行，血脈通暢，則陰霾得以消散。蜈蚣、鱉甲為臣藥，蜈蚣辛溫，性善走竄，內(nèi)而臟腑，外而經(jīng)絡(luò)，凡氣血凝聚之處皆能開之；鱉甲，其性咸平，主消散，平亦辛也，咸能軟堅，辛能走散，作為血肉有情之品，善于活血軟堅散結(jié)，與川芎、當歸等相配伍，則作用更強。黃芪甘溫大補脾氣；川芎味辛性溫，祛風散寒止痛，且又辛香走竄，可上通巔頂，下達氣海，祛瘀通絡(luò)，善入肝經(jīng)，行氣中之血；當歸暖中祛寒，潤養(yǎng)補虛，既可防諸藥辛燥，又能生血化陰，血為氣母，三者相合，氣血雙補，為佐藥。澤瀉瀉腎邪，養(yǎng)五臟，益氣力，起陰氣，補虛損；防己大辛苦寒，通行十二經(jīng)，開竅瀉濕，走而不守者，領(lǐng)諸藥環(huán)轉(zhuǎn)于周身，使上行下出，外通內(nèi)達，用黃芪助衛(wèi)氣于外，麻黃、桂枝通行營衛(wèi)，使防己大彰其效。藁本為太陽經(jīng)風藥，其氣雄壯，祛風散寒、勝濕止痛，善達巔頂，引諸藥上行。諸藥共奏溫陽化痰、活血通絡(luò)、軟堅散結(jié)之功。經(jīng)臨床及初步研究表明，溫陽通竅復(fù)方可使腫瘤細胞的損傷加重，導(dǎo)致細胞壞死凋亡［5］?，F(xiàn)代藥理證明，溫陽藥通過直接抑制或殺滅腫瘤細胞、誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的生物學(xué)行為改變，提高患者的生活質(zhì)量［6］。適當濃度附子多糖能夠在體外有效誘導(dǎo)肝癌患者外周血單核細胞分化為樹突狀細胞并表達成熟表型，從而作為第二信號活化T淋巴細胞，激發(fā)腫瘤免疫［7］。對胃癌細胞SGC-7901的增殖抑制作用也具有明顯的濃度和時間依賴性［8］。曹桂芬［9］等通過體外實驗發(fā)現(xiàn)桂皮醛對人口腔鱗狀細胞癌細胞增殖具有明顯的抑制作用，且與質(zhì)量濃度和作用時間有關(guān)，在一定程度上肯定了桂皮醛的抗腫瘤作用。劉兵［10］等發(fā)現(xiàn)少棘蜈蚣活性蛋白對舌癌Tea-8113細胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)明顯的量效及時間依賴關(guān)系，有一定的體外抗腫瘤活性。張秋菊等［11］認為黃芪通過阻滯腫瘤細胞增殖周期、影響細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、調(diào)控癌基因和抑癌基因的表達等途徑致細胞凋亡以達到抗腫瘤的目的。通過MTT法研究發(fā)現(xiàn)，川芎多糖在62.5～1 000 μg/mL的劑量范圍內(nèi)，能明顯抑制人肝癌HepG2細胞的增殖，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，其IC50為677.5 μg/mL［12］。藁本內(nèi)酯對癌細胞L1210、K562具有很強抑制作用，IC50分別為（2.27± 0.10）、（4.78±0.18）μmol/L［13］。研究顯示，藁本內(nèi)酯主要是通過抑制細胞增殖而非細胞毒素實現(xiàn)的抗癌作用，對腸癌細胞HT-29抑制作用IC50為（60.63± 6.7）μmol/L，要強于對正常結(jié)腸細胞CCD-18Co細胞毒作用［14］。

MTT比色法簡單、靈敏、可重復(fù)性好，現(xiàn)已被廣泛用于體外腫瘤藥敏的測定。本實驗應(yīng)用MTT法測定溫陽通竅中藥復(fù)方對C6腦膠質(zhì)瘤細胞增殖抑制的實驗表明，溫陽通竅中藥復(fù)方本身可能對C6細胞的細胞毒效果欠佳。但經(jīng)藥物代謝后對C6腦膠質(zhì)瘤細胞增殖發(fā)揮抑制作用，但根據(jù)不同取血時間點所獲取的含藥血清顯示出不同的抑制腫瘤細胞增殖的效果來看，其抑瘤作用不存在時間與劑量依賴關(guān)系。

體外法快速、簡便，具有一定可重復(fù)性和臨床相關(guān)性，同時也存在一定缺陷，如體外培養(yǎng)條件與體內(nèi)細胞生長環(huán)境之間存在著不同程度的差異，體外殺傷作用只能相對反映體內(nèi)的毒性情況等.因此體內(nèi)外療效相關(guān)性的研究、試驗中對藥物濃度的選擇等相關(guān)實驗，還應(yīng)更加深入進行。實驗結(jié)果初步證明，溫陽通竅中藥復(fù)方對C6腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖具有一定抑制作用，這一結(jié)果或許與藥物在體內(nèi)代謝、次生活性產(chǎn)物的出現(xiàn)相關(guān)［15］。這也體現(xiàn)了中藥需制劑復(fù)雜性的特點，為今后臨床使用提供依據(jù)，值得在未來的研究中進一步探討。

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（本文編輯：高杉，張震之）

The experimental study on the impact that secrum has Wenyang Tongqiao prescription on C6 glioma proliferation

BAI Xue1，2，LI Liang2，F(xiàn)ENG Wen-ru3，ZHOU Jie2
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300150，China；3.Tianjin Institute of Medical Science，Tianjin 300020，China）

［Objective］Inspect the impact that secrum has Wenyang Tongqiao prescription on C6 glioma proliferation.［Methods］Utilize MTT to determine the inhibition effect that the sample has to the grow of tumor cell cultivated in vitro，and to determine the inhibition effect that the different dosages of Wenyang Tongqiao prescription of traditiond Chinese medicinef（TCM）have to C6 glioma in different times of drug metabolism（2 h，4 h，6 h），at the same time，comparing the blank control group.［Results］IC50of Wenyang Tongqiao prescription that impact on the C6 glioma is 30.29 μg/mL approximately and has less cytotoxic effect.Under the 10%concentration secrum，drug metabolism after 2 h，4 h，6 h，the inhibition rates that the high and low dosages to C6 glioma are 30.22%，21.6%，28.3%and 32.87%，9.86%，47.98%.［Conclusion］Wenyang Tongqiao prescription has certain inhibitory effect on C6 glioma proliferation，but this effect has no relationship with time and dosages，this result perhaps has a relationship with the drug metabolism and the secondary active products.

Wenyang Tongqiao prescription；C6 glioma；proliferation

R285.5

A

1672-1519（2015）05-0282-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.08

天津市科技計劃項目（11JCYBJC12500）；天津市中醫(yī)藥管理局、中西醫(yī)結(jié)合科研專項課題（13085）。

白雪（1983-），女，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，從事中西醫(yī)治療腫瘤方面研究。

周潔，E-mail:cnzhoujie@126.com。

（2015-01-12）