強(qiáng)心膠囊對(duì)心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)及MAPK信號(hào)通路的影響

李曉 童曉云 倪凱 楊建紅 侯肖霖 胡孝剛

摘要：目的探討強(qiáng)心膠囊對(duì)心力衰竭大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)及絲裂原活化蛋白激酶（ MAPK）信號(hào)通路的影響。方法采用鹽酸阿霉素腹腔注射法制作心衰大鼠模型，造模成功后的50只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、卡托普利組、強(qiáng)心膠囊低、中、高劑量組 另設(shè)正常對(duì)照組10只。分別給予生理鹽水20mL/kg、卡托普利組100mg/kg、強(qiáng)心膠囊0.2g/kg、強(qiáng)心膠囊0.4g/kg、強(qiáng)心膠囊0.8 g/kg、生理鹽水20mL/kg灌胃給藥4周，4周后觀察心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)改變，Westem印跡法觀察心衰大鼠心肌ERK、P38、JNK的表達(dá)情況。結(jié)果強(qiáng)心膠囊低、中、高劑量組均可改善心衰大鼠的血液動(dòng)力學(xué)（P<0.05），且對(duì)心衰大鼠心率無明顯影響，其中強(qiáng)心膠囊高劑量組效果與卡托普利組相仿；與模型對(duì)照組比較，強(qiáng)心膠囊中、高劑量組ERK、P38、JNK的蛋白表達(dá)水平均不同程度降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論中、高劑量強(qiáng)心膠囊可改善心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，可能與其通過下調(diào)MAPK通路ERK、P38、JNK蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：強(qiáng)心膠囊；心力衰竭；MAPK通路

中圖分類號(hào)：R285

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007 - 2349（ 2015） 01 - 0062 - 03慢性心力衰竭（ Chronic Heart Failure，CHF）的發(fā)生與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過度激活有關(guān)，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)主要是通過信號(hào)傳導(dǎo)途徑，長(zhǎng)期、慢性激活促進(jìn)心肌重塑，最終導(dǎo)致CHF的發(fā)生。CHF的發(fā)生、發(fā)展起重要作用的是細(xì)胞凋亡，絲裂原活化蛋白激酶（ Mitogen activated protein kinase.MAPK）是調(diào)控細(xì)胞增長(zhǎng)與凋亡過程的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ ERK）、P38蛋白激酶、c-jun N末端激酶（JNK）等亞型[1]。強(qiáng)心膠囊由生黃芪、制附子、生曬參、澤瀉、血竭等13味中藥組成，其功效為益氣活血，溫陽利水，臨床用于治療心力衰竭已10余年，取得了較好的臨床療效。本研究以強(qiáng)心膠囊干預(yù)心力衰竭大鼠，觀察心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)改變，用Western印跡法進(jìn)行MAPK信號(hào)通路相關(guān)ERK、P38、JNK蛋白表達(dá)的檢測(cè)，進(jìn)一步探討強(qiáng)心膠囊治療CHF可能的作用靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。1 材料與儀器1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年清潔級(jí)雄性SD大鼠100只，體重180 -220g，購白昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（昆）2011 - 0004，常規(guī)條件飼養(yǎng)，保持室溫23 - 25℃，濕度30% -70%。1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 強(qiáng)心膠囊：生黃芪、制附子、生曬參、桂枝、血竭等13味中藥組成，0. 4g/粒，由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心制作，批號(hào)20130429；注射用鹽酸阿霉素，lOmg/支，浙汀海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)130703；卡托普利：25 mg/片，北京亞寶生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)12080031；BS368（ bioworld）； ab31828（ abcam）， BS1544（ bioworld）； Ab75744（ ab-cam）；30%丙烯酰胺；ddH20；SDS（ Amresco）；TEMED（ Sigma）等。1.3實(shí)驗(yàn)主要儀器與材料 電子天平為Sartorius公司（德國）產(chǎn)品，微量加樣器為Cilson公司（法國）產(chǎn)品，微量加樣吸頭為北京鼎同牛物有限公司產(chǎn)品，電熱恒溫水浴槽為上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠產(chǎn)品，- 80℃低溫冰箱為SANYO（日本）產(chǎn)品，制冰機(jī)為AF10 SCOTSMAN（美國）產(chǎn)品，PVDF膜（孔徑為0. 22μm）為Millipore公司產(chǎn)品，醫(yī)用X射線膠片為柯達(dá)公司產(chǎn)品，通用顯影粉、酸性定影粉為天津亨達(dá)公司感光材料廠產(chǎn)品，高速離心機(jī)為上海醫(yī)用分析儀器廠產(chǎn)品，轉(zhuǎn)移脫色搖床為海門其林貝爾儀器制造公司產(chǎn)品，旋渦混勻器為海門麒麟醫(yī)用儀器廠產(chǎn)品，電泳儀為北京百晶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，低溫離心機(jī)為德國Sigma公司產(chǎn)品，凝膠玻璃板、固定夾、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽為美國BIO - Rad公司產(chǎn)品，美國UVP凝膠成像系統(tǒng)，為thermo公司產(chǎn)品，型號(hào)：CA91786 USA UVPGDS - 8000 System。半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)為ATTO公司產(chǎn)品，型號(hào)：WSF - 4040。2實(shí)驗(yàn)方法2.1 動(dòng)物模型復(fù)制、分組、給藥100只成年SD雄性大鼠，隨機(jī)抽取10只為正常對(duì)照組，余90只采用腹腔注射鹽酸阿霉素法復(fù)制心衰大鼠模型21，按第1次和第2次1. 0mg/kg.d劑最；第3次和第4次2. 0mg/kg.d劑量；第5次和第6次1.0mg/kg.（1劑量；第7次和第8次2.Omg/kg.d劑量；累積劑量12mg/kg，隔天注射，共計(jì)15d，觀察大鼠表征及行為改變。l5大后行心臟彩超檢查，以左室射血分?jǐn)?shù)（ LVEF）值低于45%作為心衰模型成功的標(biāo)志，同時(shí)大鼠出現(xiàn)體重減輕、精神萎靡、毛色無光澤，列入觀察對(duì)象。篩選存活且造模成功的50只夫鼠按隨機(jī)分為5個(gè)組：M組為模型對(duì)照組（生理鹽水20mL/kg）；K組為卡托普利組（100mg/kg溶于生理鹽水）；D組為強(qiáng)心膠囊低劑量組（0. 2g/kg，相當(dāng)于人的臨床劑量的2.5倍）；Z組為強(qiáng)心膠囊中劑量組（0. 4g/kg，相當(dāng)于人的臨床劑量5倍）；G組為強(qiáng)心膠囊高劑量組（0.8 g/kg，相當(dāng)于人的臨床劑量的10倍）。Y組為正常對(duì)照組（生理鹽水20mL/kg），連續(xù)灌胃給藥4周，觀察整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中大鼠一般情況。2.2 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定各組灌喂不同藥物4周后，于末次給藥后6h，以25%烏拉坦按SmL/kg腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥固定分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，由頸總動(dòng)脈插管至左心室，連接八導(dǎo)生理記錄儀，記錄動(dòng)脈收縮壓（ SBP）、動(dòng)脈舒張壓（ DBP）、心率（HR）、平均動(dòng)脈壓（MAP）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（ LVEDP）、左室內(nèi)壓最大收縮率（+dp/dtmax）、左室內(nèi)壓最大舒張壓（- dp/dtmax）。2.3

Westem印跡法檢測(cè)ERKI/2、p38和JNK蛋白表達(dá)2.3.1 心肌采集，蛋白提取各組于灌喂不同藥物4周后各取3只大鼠，腹腔注射麻醉處死大鼠，仰臥固定四肢，取出心臟，冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干稱重，勻漿，心肌組織蛋白提取，- 80℃保存?zhèn)溆谩?.3.2制備SDS - PAGE凝膠，組裝電泳槽將灌膠玻璃板洗凈，晾干固定，配制10%分離膠8 mL快速灌入凝膠玻璃槽中；立即用去離子水覆蓋膠面，室溫放置約40 min至分離膠凝固；配制5%濃縮膠4 mL；倒掉去離子水覆蓋液，并用吸水紙吸掉殘留的液體；將凝膠板重新垂直放置，輕輕加入5%濃縮膠液，插入樣品梳，室溫凝膠約40 min。輕輕拔去梳子，將玻璃夾板“凹”面貼緊電泳槽，固定在電泳槽上。2.3.3樣品變性及電泳、凝膠轉(zhuǎn)膜及曝光、洗片、掃描由一80℃冰箱取出提取的組織總蛋白樣品，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液混合，95℃變性10 min，將電壓調(diào)至80V，使樣品通過濃縮膠與分離膠（電壓約8v/cm）。電泳使染料至分離膠適當(dāng)位置，結(jié)束電泳。凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后分別用非標(biāo)記·抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗對(duì)其進(jìn)行孵育，洗膜，曝光洗片.，采用美國UVP分析儀器，對(duì)膠片進(jìn)行掃描，然后括住每·個(gè)條帶，系統(tǒng)自動(dòng)生成灰度值，即為結(jié)果。2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本均數(shù)比較用one - way ANOVA法，數(shù)據(jù)先進(jìn)行方差齊性的Levene檢驗(yàn)，方差齊時(shí)用組間比較的LSD法，符合正態(tài)分布但方差不齊時(shí)用Tamhane's T2檢驗(yàn)。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)情況各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)情況見表1。由表l可見，模型對(duì)照組血壓（ SBP、DBP、MAP）與正常對(duì)照組及各治療組比較均有顯著性差異（P<0.05），強(qiáng)心膠囊低、中、高劑量組Im壓與劑量呈正相關(guān)，強(qiáng)心膠囊高劑量組與卡托普利組之間差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示強(qiáng)心膠囊高劑量組與卡托普利組效果相仿；各組間心率差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與空白對(duì)照組的左室收縮壓、左室舒張末壓、左窀內(nèi)壓最大收縮率、左室內(nèi)壓最大舒張率相比，模型對(duì)照組及各治療組均存在顯著性差異；強(qiáng)心膠囊低、中、高劑量組左室舒張末壓與劑量呈負(fù)相關(guān)，左室收縮壓、左室內(nèi)壓最大收縮率及左室內(nèi)壓最大舒張率與劑量呈正相關(guān)；與卡托普利組相比，強(qiáng)心膠囊高劑量組左室收縮壓、左室舒張末壓、左室內(nèi)壓最大收縮率及左室內(nèi)壓最大舒張率之間差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2 各組大鼠心肌ERK、P38、JNK蛋白表達(dá)水平 Westem印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，強(qiáng)心膠囊中、高劑量組的ERK、P38、JNK的蛋白表達(dá)水平均不同程度降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。4討論

慢性心力衰竭屬祖國醫(yī)學(xué)中“心悸”、“胸痹”、“喘證”、“怔忡”、“水腫”、“痰飲”等范疇。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心衰為本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛以氣虛為基礎(chǔ)，甚則氣損及陽，血脈瘀滯為中心病理環(huán)節(jié)，瘀血、痰濁、水飲是其標(biāo)實(shí)之候。強(qiáng)心膠囊即是以為治則研制的純中藥制劑，強(qiáng)心膠囊由生黃芪、制附子、生曬參、桂枝、血竭、葶藶子、車前子等13昧中藥組成，治以益氣溫陽、活血利水，方中黃芪、附片為主藥，以益氣溫陽；生曬參、桂枝為臣藥，以助主藥益心氣，通心陽，推動(dòng)血液運(yùn)行；血竭等活血化瘀；葶藶子、車前子化痰利水消腫，諸藥合用，祛邪而不傷正。據(jù)現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，上述藥物有增強(qiáng)心肌收縮力、利尿、擴(kuò)血管、降低血黏度等作用，臨床治療CHF療效確切。

MAPK是脊椎動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在的絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，屬于細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，是細(xì)胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)的主要信號(hào)通路，在缺血、缺氧、牽張、激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等各種細(xì)胞外刺激.可誘導(dǎo)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖等核反應(yīng)，因此，有細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核聯(lián)系的樞紐之稱。它可將胞外刺激信號(hào)傳遞給胞核，與細(xì)胞連接以及內(nèi)皮通透性等有密切關(guān)系。近年來，MAPK通路研究表明[3-4]，MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路在心肌細(xì)胞肥大的啟動(dòng)以及心肌細(xì)胞肥大從代償狀態(tài)進(jìn)入心衰的轉(zhuǎn)換中起重要作用，活化的MAPK轉(zhuǎn)位人核后引起轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，提高應(yīng)激蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平，合成相關(guān)蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。目前，已在哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆和鑒定出4條MAPK通路，即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular sig-nal regulated protein kinase.ERKl/2）通路、c- Jun氨基末端激酶（c- Jun amino - terminal kinase，JNK/SAPK）通路、p38通路和ERK5通路[5]。這些激酶的信號(hào)通路具有高度保守性，即都由3個(gè)關(guān)鍵酶經(jīng)過級(jí)聯(lián)信號(hào)將胞外刺激傳遞到胞核，通過磷酸化因子調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[6-7]。在MAPK通路的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，ERK、JNK、p38MAPK是具有代表性的三個(gè)亞類。在應(yīng)用藥物干預(yù)過程中，通過檢測(cè)上述通路蛋白的相關(guān)表達(dá)，可揭示干預(yù)藥物的部分作用機(jī)理。

本研究結(jié)果顯示，強(qiáng)心膠囊低、中、高劑量組均可改善心衰大鼠的血液動(dòng)力學(xué)，且對(duì)心衰大鼠心率無明顯影響，其中強(qiáng)心膠囊高劑量組效果與卡托普利組相仿。強(qiáng)心膠囊中、高劑量組ERK、P38、JNK的蛋白表達(dá)水平較模型組均有不同程度降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但低劑量組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低劑量組出現(xiàn)上述情況可能與中藥的多成分性有關(guān)，影響了藥物與受體的親和力和內(nèi)在活性，使蛋白的表達(dá)不明顯。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心膠囊可改善心衰大鼠的血液動(dòng)力學(xué)情況，并通過對(duì)心衰大鼠MAPK信號(hào)通路相關(guān)ERK、P38、JNK蛋白表達(dá)的檢測(cè)，表明強(qiáng)心膠囊可能是通過ERK通路進(jìn)行應(yīng)激介導(dǎo)，調(diào)節(jié)心肌肥大相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，促使相關(guān)心肌細(xì)胞凋亡，清除受損的心肌細(xì)胞；可能通過JNK通路抑制血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素以及兒茶酚胺的激活；并可能通過p38MAPK促進(jìn)白細(xì)胞的聚集和活化，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性及細(xì)胞因子的合成，從而控制炎癥反應(yīng)、改善心衰。通過本研究，初步揭示了強(qiáng)心膠囊改善心衰大鼠血液動(dòng)力學(xué)的部分機(jī)理，為臨床治療CHF提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。參考文獻(xiàn)：[1] Downward J The ins and outs of signaling[J]. Nature， 2001，411（ 6839）：759.[2]李梅秀，田國忠，歐葉濤，等大鼠阿霉素慢性心衰模型的制備與心衰指標(biāo)的判定[J].解剖學(xué)研究，2005，27（3）：176-178.[3] Ravingerova T，Barancik M，Strniskova M. Mitogen-activated protein kinases：a new therapeutic target in cardiac pathology. Mol Cell Bio-Chem ，2003 ，247（1 -2）：127 - 138.[4] Sugden P H.Signalling pathways in cardiac myocyte hypertrophy. AnnMed，2001 ，33（9）：611 - 622.[5] Wang X，Tournier C.Regulation of cellular functions by the ERK5 siglalling pathey.Cell Signal，2006； 18（6）：753 - 760.[6]姜勇，RJ Ulevitch.LPS介導(dǎo)細(xì)胞激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：從CD14到p38MAPK通路的研究，生理科學(xué)進(jìn)展，1999，30（1）：29 -34.[7]Lee M，Choi L，Park K. Activation of stress signaling molecules in bat brain during aroused from hibernation. J - Neurochem，2002，82（4）：867 - 873（收稿日期：2014 - 11 - 10）