pH示差法測定茄子皮中花青苷條件的優(yōu)化

張艷俠 徐超 張立華

摘要：為探討pH示差法測定茄子皮中花青苷的含量，用酸性乙醇溶液從茄子皮中提取花青苷，確定提取液的最大吸收波長、pH值的變化及平衡時間，還做了精密度試驗、回收試驗。結(jié)果表明，茄子皮提取液的最大吸收波長為530 nm，pH值選定為1.0、4.5，反應(yīng)平衡時間為90 min，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%（n=6），加標(biāo)回收率為9642%。該方法能有效消除溶液中雜質(zhì)對測定結(jié)果的影響，可用于茄子皮中花青苷的定量分析。

關(guān)鍵詞：茄子皮；花青苷；pH示差法；定量分析

中圖分類號：TS201.1 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0338-02

花青素是具有2-苯基苯并吡喃陽離子結(jié)構(gòu)的衍生物，是廣泛存在于植物中的水溶性天然色素。自然條件下游離狀態(tài)的花青素極少見，其A環(huán)3-、5-、7-碳位上的羥基以糖苷鍵與一些單糖結(jié)合形成花青苷，因結(jié)合糖基的種類、數(shù)量、結(jié)合位置不同，花青苷的種類有所不同[1]?；ㄇ嘬站哂锌寡趸⑾杂苫?、降低血清膽固醇、抗變異、抗腫瘤、促進視網(wǎng)膜上視紅素再合成等生理功能，因而花青苷被作為功能性食品添加劑，具有果香味、水溶性好、安全性高等優(yōu)點，已被消費者普遍接受[2]。茄子（Solanum melongena L.）果皮多紫紅色，含有豐富的花青苷，且穩(wěn)定性好。我國茄子種植面積大，其皮為副產(chǎn)物，因此茄子皮色素是一種極具開發(fā)前景的天然食用色素[3]，但目前對于其含量的測定缺少統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

花青苷的定量分析方法通常有：單一pH法、差減法、高效液相色譜法、pH示差法。其中單一pH法測定花青苷時準(zhǔn)確度相對較低，當(dāng)僅以含量作為指標(biāo)的對比依據(jù)時，可選用單一pH法，操作簡便；差減法在測定花青苷含量的過程中，由于干擾組分的吸光度受提取試劑的影響，從而使得理論測定總花青苷的濃度準(zhǔn)確度降低[4]；高效液相色譜技術(shù)雖已廣泛應(yīng)用于菠蘿、柑橘、桃、杏等果實中的糖、酸組分和含量的測定，并具備高效、高靈敏度、分析速度快、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點，且方法精密度高、重復(fù)性好，但在測定花青苷單體含量時，要對樣品花青苷進行分離純化，并需要花青苷單體標(biāo)準(zhǔn)品，而花青苷標(biāo)準(zhǔn)品的不穩(wěn)定，或是不明確樣品中的花青苷單體組成，使該方法的使用受到限制[5]。有人研究pH示差法測定葡萄[6]、桑椹[7]中花青苷含量，結(jié)果表明該法的準(zhǔn)確度較高、重現(xiàn)性好，而且操作方法簡便、設(shè)備儀器較低廉、便于推廣。本試驗進行pH示差法測定茄子皮中花青苷含量的方法學(xué)研究，以期為茄子皮乃至其他植物材料中花青苷的定量分析提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為在棗莊當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I的新鮮成熟的茄子，品種為臺灣紅茄，用打皮刀削取茄子皮備用。

試驗試劑：無水乙醇（天津市致遠化學(xué)試劑有限公司）；濃鹽酸、氫氧化鉀（山東省萊陽市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細化工廠）；乙酸鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠）等。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器有：UV-2000型紫外-可見分光光度計（尤尼科儀器有限公司）、電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、pHS-2F型酸度計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、RE52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、KS-300EI型超聲波清洗機（寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司）。

1.3 技術(shù)路線

準(zhǔn)備植物材料→花青苷的提取→最大吸收波長的測定→pH值的確定→反應(yīng)平衡時間的確定→精密度試驗→回收試驗。

1.4 茄子皮中花青苷的浸提

準(zhǔn)確稱量5 g茄子皮，按照1 g ∶10 mL的料液比加入酸性乙醇溶液，在50 ℃下浸提30 min；將過濾的濾液重復(fù)浸提3～4次；合并濾液并定容至250 mL。

1.5 測定花青苷的最大吸收波長

用酸性乙醇溶液將茄子皮浸提液稀釋至適當(dāng)濃度，在400～600 nm可見波長范圍內(nèi)用紫外-可見分光光度計進行光譜掃描，繪制吸收光譜曲線，并找出峰值。

1.6 pH值的選定

以溶液pH值為變量構(gòu)建梯度試驗，在已測得的最大吸收波長下測量茄子皮浸提液的吸光度。繪制pH值-吸光度（D）曲線，選擇最適pH值，要求在選定的2個pH值左右變動時吸光度變化不大。

1.7 平衡時間

在選定的2個最適pH值條件下，每隔20 min測量1次樣品的吸光度，觀察溶液吸光度隨時間的變化，確定溶液的反應(yīng)平衡時間。

1.8 精密度試驗

將浸提液靜置至反應(yīng)平衡后，在已測得的最適pH值及最大吸收波長下，測量花青苷的吸光度，平行測定6次。按照Fuleki等的經(jīng)驗公式計算茄子皮中的花青苷含量[8]：

X=ΔDVFM×1 000/（εm）。

式中：X為茄子皮中的花青苷含量，mg/g；ΔD為pH值為1.0、4.5時吸光度的差值；V為稀釋體積，L；F為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.9 回收試驗

采用加入回收法，在試樣中加入已知量的被測組分與等量的另1份相同的平行試樣進行分析，求得加入的被測組分的回收率，根據(jù)回收率檢查系統(tǒng)誤差的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長

取一定量的茄子皮浸提液，用酸性乙醇溶液稀釋，在400～600 nm波長范圍內(nèi)進行可見光掃描，并繪制吸收光譜圖曲線。由圖1可知，在400～600 nm可見光譜范圍內(nèi)，浸提液中花青苷的吸光度變化表現(xiàn)為先增加后減小，即只存在唯一的峰值，可以看出，茄子皮中花青苷的最大吸收波長為530 nm。

2.2 pH值確定

為保證pH示差法有較高的的準(zhǔn)確性和靈敏度，在選擇pH值時應(yīng)考慮以下3點：（1）所選擇的2個pH值處所測得的花青苷吸光度差異應(yīng)當(dāng)是顯著的；（2）單一pH值的變動，對花青苷的吸光度影響應(yīng)是極小的；（3）花青苷在所處的2個最適pH值條件下，其結(jié)構(gòu)應(yīng)是相當(dāng)穩(wěn)定的。由于花青苷只在酸性介質(zhì)中可以保持穩(wěn)定，因而試驗中只測定酸性介質(zhì)中不同pH值條件下花青苷浸提液最大吸收波長處的吸光度變化，并以pH值為橫坐標(biāo)、吸光度D530 nm為縱坐標(biāo)作圖，詳見圖2。從圖2可以得知，在pH值為0.8～ 1.5、4.0～ 5.0這2個區(qū)域內(nèi)，pH值的輕微變動對吸光度的變化影響較小，并且在這2個pH值范圍內(nèi)，花青苷在酸性介質(zhì)中具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，滿足試驗要求。綜上所述，選擇的2個pH值分別為10、4.5。

2.3 反應(yīng)平衡時間

花青苷在溶液介質(zhì)中存在4種結(jié)構(gòu)形式，這4種結(jié)構(gòu)形式在某一pH值下處于動態(tài)平衡，當(dāng)pH值改變時，動態(tài)平衡發(fā)生轉(zhuǎn)移，總的趨勢是pH值降低時，平衡向紅色的2-苯基苯并吡喃陽離子移動；pH值升高時，平衡向藍色醌式移動，并隨時間的變化達到一個新的平衡。因此提取液用緩沖液稀釋后，必須靜置一段時間，等動態(tài)平衡處于穩(wěn)定后，才能測定吸光度。試驗中量取等量的浸提液，分別調(diào)其pH值至1.0、45，每隔20 min測量其吸光度，觀察溶液吸光度隨時間的變化，確定溶液平衡的時間，茄子皮花青苷在不同pH值溶液中的吸光度隨時間的變化見表1。

由表1可知，在不同的緩沖溶液中隨時間的變化，花青苷的吸光度不同。隨時間的延長，在pH值為1.0的緩沖溶液中花青苷的吸光度基本穩(wěn)定；在pH值為4.5的緩沖溶液中花青苷的吸光度隨時間的延長而升高，90 min時處于穩(wěn)定狀態(tài)。因此，選擇花青苷在緩沖液中的平衡時間為90 min。

2.4 精密度試驗

按照“1.4”節(jié)的提取方法制得茄子皮花青苷浸提液 500 mL，從500 mL提取液中準(zhǔn)確量取2份各25 mL的溶液，分別調(diào)節(jié)pH值至1.0、4.5，在波長530 nm處測定吸光度D530 nm，平行測定6次。按照相關(guān)公式計算樣品中花青苷含量，結(jié)果（表2）可知，茄子皮中花青苷平均含量為0120 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%。

2.5 回收試驗

從上述茄子皮花青苷浸提液中準(zhǔn)確量取2份100 mL溶液，分別標(biāo)記為1、2，在50 ℃條件下真空干燥。將材料1溶解于100 mL 1.2 mol/L HCl-70%乙醇溶液中，用本研究的方法測定酸性乙醇中花青苷的含量，即為加標(biāo)量。將材料2再溶解于100 mL浸提液中， 采用相同方法測定浸提液中加標(biāo)后花青苷的含量。將材料2試驗所測得的含量減去浸提液中原有花青苷含量，即為加標(biāo)樣的實際測得量。由測定結(jié)果、回收率（表3），可以看出，平均回收率為96.42%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.49%。

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，茄子皮中花青苷的最大吸收波長為530 nm，與文獻報道的花青苷最大吸收波長在520～540 nm之間的數(shù)據(jù)相符。而反應(yīng)平衡時間由于受到溫度、濕度、提取時間等因素的影響，會有較大的差別；根據(jù)相關(guān)研究可以看出，反應(yīng)平衡時間選擇在90～110 min對試驗不會有影響。通過精密度試驗結(jié)果得出，茄子皮中花青苷的含量為 0.120 mg/g，而根據(jù)加入回收法測得的平均回收率為9642%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.49%，可知溶液中其他因素對花青苷含量測定的影響極小，可以忽略不計?？傊?，采用pH示差法對茄子皮中花青苷的含量進行定量分析，能有效地消除溶液中其他有機雜質(zhì)對測定結(jié)果的影響，可信度較高，為今后的茄子皮及其他植物果實中花青苷定量分析提供了一定的理論依據(jù)。

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