基于實時熒光PCR的鵝鴨混合絨定量檢測

呂蓉+張冠楠+費靜+高琴+劉月明+宋青

摘要：傳統(tǒng)的羽絨品種定量檢測方法為顯微鏡檢測法，費時長且依賴檢測人員的經(jīng)驗。本研究建立了基于實時熒光PCR技術(shù)的鵝鴨混合絨定量檢測方法。通過設(shè)計針對鵝、鴨線粒體DNA序列的特異性引物和TaqMan探針，且兩組引物探針具有幾近相同的擴(kuò)增效率，建立羽絨品種檢測的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2>0.99）。以不同產(chǎn)地的鵝鴨混合絨驗證該方法，均得到較好結(jié)果，證明線粒體拷貝數(shù)對定量結(jié)果基本沒有影響。該方法有望用于羽絨品種的大批量快速定量檢測。

關(guān)鍵詞：鵝絨；實時熒光PCR；物種鑒定；定量分析

中圖分類號：TS959.16；TS07 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Quantitative Analysis of Goose and Duck Down Blends with Real-time PCR

Abstract： In this project， a quantitative method based on real-time PCR technique was developed to determine the weight of goose down and duck down in down products. Two sets of primers and TaqMan probes that can react specifically to goose and duck mitochondrial DNA were designed， and they exert almost the same amplification rate. The two systems were used to establish the quantitative standard curve of down species determination（R2>0.99）. Goose and duck down blends collected from different producing areas were employed to verify the method， and satisfactory results were obtained， which proved that the copy number of mitochondrion has little impact on quantifying results. The method can be applied to quick and large-batch quantitative identification of down species in down products.

Key words： goose down； real-time PCR； identification of species； quantitative analysis

在羽絨產(chǎn)業(yè)中，很大部分是作為紡織填充材料的鵝絨和鴨絨。鵝絨與鴨絨相比絨朵大，蓬松度高，保暖性強(qiáng)，因而在市場上鵝絨的價格比鴨絨更高。有些不法羽絨商販就企圖以鴨絨冒充鵝絨來獲取巨大的經(jīng)濟(jì)利益。因此世界各國的羽絨標(biāo)準(zhǔn)都對鵝絨中的鴨絨含量作了最高限定。目前國內(nèi)外普遍采用顯微鏡法來區(qū)分鵝鴨絨，然而顯微鏡檢測費時費力，且受人為經(jīng)驗影響大，不適宜大批量樣本的分析。目前也有部分學(xué)者運用光譜檢測分析技術(shù)開展鵝鴨混合絨的鑒別研究，但離實際推廣應(yīng)用還有一定的距離。

自1985年P(guān)CR技術(shù)誕生起，分子生物學(xué)檢測方法以其客觀性和精準(zhǔn)性在食品檢驗、醫(yī)療診斷及司法鑒定等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，并已開始運用于天然動物纖維的鑒定和檢測。費靜等開展了兔毛、狐貍毛的實時熒光PCR檢測方法研究。Ji等運用實時熒光PCR技術(shù)建立了羊毛羊絨混合物的定量檢測方法。但目前世界上還沒有基于實時熒光PCR技術(shù)開展鵝鴨混合絨定量檢測研究的報道。家鵝分中國鵝和歐洲鵝兩個系統(tǒng)，中國鵝是由鴻雁馴養(yǎng)而成，歐洲鵝則起源于灰雁。家鴨則主要是由綠頭鴨和斑嘴鴨培育形成。因此設(shè)計能橫跨兩個物種并相互區(qū)別的高效特異性引物和探針是本研究的關(guān)鍵點。

1實驗部分

1.1試劑

2%CTAB緩沖液；苯酚/氯仿（上海生工公司）；DTT（二硫蘇糖醇）溶液和蛋白酶K溶液（美國Promega公司）；TaqMan Gene Expression Master Mix（美國ABI公司）；引物和TaqMan探針由上海英駿公司合成。

1.2儀器

6870冷凍研磨儀（美國SPEX公司）；恒溫震蕩孵育器和冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Vii7熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.3試樣

純白鵝絨和純白鴨絨均購自上海民強(qiáng)羽絨廠，且經(jīng)顯微鏡檢測確認(rèn)。建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的羽絨樣品為人為混合樣品，在常溫常濕條件下將純鵝絨和純鴨絨配成重量比為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8，共8個混合比例梯度，每個樣品約2g。用于驗證實驗的中國灰鵝絨、中國白鵝絨、波蘭白鵝絨、保加利亞灰鵝絨、法國白鵝絨均為本實驗室留存樣品。

1.4實驗方法

1.4.1羽絨的前處理

將樣品混勻，用剪刀稍作剪碎，用冷凍研磨儀將樣品磨成面粉狀。研磨程序：預(yù)冷5min，10Hz運行1min，冷卻1min，共3個循環(huán)。

1.4.2DNA的提取

稱取30mg羽絨粉末樣品于2mL離心管中，加入0.8mLCTAB緩沖液，再加入150μLDTT和50μL蛋白酶K，震蕩混勻，56℃500r/min震蕩過夜。取出離心管，加入1mL苯酚/氯仿，上下顛倒1min以混合均勻。12000r/min離心10min，吸取900μL上清置于新2mL離心管，加入等體積苯酚/氯仿，上下顛倒1min以混合均勻。12000r/min離心10min，吸取800μL上清置于新2mL離心管，加入800μL氯仿，上下顛倒1min以混合均勻。12000r/min離心10min，吸取700μL上清置于新1.5mL離心管，加入500μL異丙醇，上下顛倒10次。4℃、12000r/min離心30min，傾倒離心管去除異丙醇，加入1mL預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀，小心傾倒出溶液。重復(fù)洗滌1次，盡可能去除洗滌液。打開蓋子，離心管置于空氣中干燥直到無氣味。加入100μL超純水，高速渦旋振蕩15s以溶解DNA。

1.4.3引物和探針的設(shè)計

根據(jù)NCBI中已發(fā)表的鴻雁和灰雁、綠頭鴨和斑嘴鴨的線粒體基因組序列（登錄號：KP238480.1，NC_011196.1，EU009397.1，NC_022418.1），兼顧鴻雁和灰雁兩者線粒體基因的相同部分，與綠頭鴨和斑嘴鴨的相應(yīng)區(qū)域序列進(jìn)行比較，選取合適的序列進(jìn)行引物探針設(shè)計，如表1所示。

1.4.4實時熒光PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系為25μL，包括TaqManGeneExpressionMasterMix12.5μL，引物各0.4μmol/L，探針0.2μmol/L，DNA模板5μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃、10min；95℃、15s，60℃、1min，共40個循環(huán)。用ABIVii7熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測。

2結(jié)果與討論

2.1鵝源性成分和鴨源性成分引物探針的特異性檢測

分別以純鵝絨DNA、純鴨絨DNA和ddH2O為模板進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增。鵝源性成分的引物探針檢測體系與鴨絨DNA有微弱的交叉反應(yīng)，而鴨源性成分的反應(yīng)體系與鵝絨DNA也有較弱的交叉反應(yīng)，但兩者Ct值（PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段并達(dá)到閾值所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)）之差均約為14，遠(yuǎn)大于10，交叉反應(yīng)DNA的相對等效濃度小于0.1%，對后續(xù)的定量影響不大。兩者的擴(kuò)增曲線如圖1、圖2所示，？Rn為標(biāo)準(zhǔn)信號與基線信號差值。

2.2鵝源性成分和鴨源性成分引物探針的靈敏度檢測

對純鵝絨DNA、純鴨絨DNA分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，用相應(yīng)引物探針檢測靈敏度。由檢測結(jié)果可知：純鴨絨DNA、純鴨絨DNA經(jīng)104稀釋仍能檢測到熒光信號。兩者的梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。且兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率相近，由此表明鵝、鴨檢測體系的PCR擴(kuò)增效率基本趨于一致，該檢測體系可以用于建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理，當(dāng)兩個反應(yīng)的擴(kuò)增效率非常接近時，可以近似地認(rèn)為鵝絨與鴨絨比值的對數(shù)與兩者對應(yīng)的Ct值之差存在線性關(guān)系。提取鵝絨含量為90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%的鵝鴨混合絨DNA，以鵝絨和鴨絨比值的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以3個獨立批次樣品的鵝絨Ct檢測值和鴨絨Ct檢測值之差的平均值為縱坐標(biāo)，取點進(jìn)行曲線擬合，得定量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），且R2>0.99。對于需定量的樣品，每次測得鵝絨鴨絨各自的Ct值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，即能得出混合絨中鵝絨的含量。

2.4方法驗證

2.4.1定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)性驗證

將純鵝絨與純鴨絨以85%鵝絨、60%鵝絨、20%鵝絨的投入量混合，各自取8個獨立的樣本，檢測鵝絨鴨絨各自的Ct值，并通過定量標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其中的鵝絨含量，結(jié)果如表2所示，總體來講該方法的重復(fù)性較好。

2.4.2實際樣品的驗證

考慮到線粒體拷貝數(shù)在不同生物品種和不同組織中的數(shù)目可能也不同，而鵝絨鴨絨線粒體數(shù)量的穩(wěn)定性是本定量方法是否準(zhǔn)確的關(guān)鍵。同時動物纖維中所含的天然色素也可能會抑制PCR反應(yīng)的進(jìn)行，進(jìn)而影響本方法的有效性。為驗證該方法的準(zhǔn)確性，采用不同地區(qū)和不同顏色的已知鵝絨含量的鵝鴨混合絨，每個樣品均做平行樣，經(jīng)實驗得出鵝絨的比例，結(jié)果見表3。可以看到，作為鵝絨主要產(chǎn)區(qū)的中國和歐洲，來源于不同品種的鵝絨和鴨絨，其線粒體DNA的相對含量沒有很明顯的差異；且鵝鴨絨中所含的天然色素對PCR反應(yīng)基本沒有影響。

3結(jié)論

對天然動物纖維而言，DNA檢測方法不依賴于纖維固有的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其他理化性質(zhì)，而是依據(jù)物種自身的特異性核苷酸序列開展檢測，因而不受檢測人員的主觀判斷及經(jīng)驗影響，結(jié)果更為準(zhǔn)確和可靠。本方法利用鵝、鴨線粒體DNA序列上的差異，設(shè)計特異性好、靈敏度高的引物和探針，建立高效、可靠的鵝鴨混合絨實時熒光PCR定量檢測方法。比起傳統(tǒng)顯微鏡的定量方法，該方法可進(jìn)行批量樣本的檢測分析，更為省時、省力，同時具有更高的可靠度和準(zhǔn)確性，對保護(hù)我國羽絨企業(yè)對外貿(mào)易的順利開展有著重要的意義。

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作者簡介：呂 蓉，女，1982年生，工程師，從事動植物分子生物學(xué)檢測技術(shù)的研究。

作者單位：上海出入境檢驗檢疫局。

基金項目：上海出入境檢驗檢疫局科研項目（HK007-2014）。