• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    1株耐輻射酵母菌的鑒定及其生長特性和產(chǎn)物的檢測

    2015-08-20 12:08:26杭姣陳亞利陳可泉韋萍
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2015年7期
    關鍵詞:鑒定酵母菌

    杭姣 陳亞利 陳可泉 韋萍

    摘要:對未知菌種的鑒定是研究挖掘此菌種功能用途以及產(chǎn)物的基礎之一。根據(jù)形態(tài)學、生理生化鑒定以及26S rRNA的D1/D2區(qū)域的測序、5.8S rRNA-ITS的RFLP分析等對1株酵母菌進行了鑒定,并探究了其特殊的生長特性與產(chǎn)物。研究結(jié)果,該酵母菌被鑒定為圓形或者卵圓形,以出芽生殖為主,菌落為乳白色、圓形、凸起、邊緣光滑的淺白隱球酵母;經(jīng)過研究還發(fā)現(xiàn),該酵母菌能在較大的pH值范圍(pH值3~13)內(nèi)生長,能在比較高的溫度(39 ℃)以及強酸強堿下生長,檢測到其產(chǎn)物為多糖,與以往淺白隱球酵母的產(chǎn)物有區(qū)別。

    關鍵詞:耐輻射;酵母菌;鑒定;核糖體序列分析

    中圖分類號: TQ920.1 文獻標志碼: A 文章編號:1002-1302(2015)07-0320-05

    傳統(tǒng)的也是權威的酵母菌鑒定方法是首先依據(jù)形態(tài)學特征和生理生化進行分析。20世紀90年代開始應用的商業(yè)化Biolog系統(tǒng)[1-2],即測試微生物在鑒定板各孔中對不同碳源的代謝能力進行菌種鑒定,這種鑒定也被稱為代謝指紋圖譜分析。但該方法對于那些并未得到很好分離純化的酵母菌,在特殊條件(如強輻射、光照、酸堿條件等)下產(chǎn)生變異的新菌種,其遺傳密碼和代謝途徑可能發(fā)生了變化有時也難以辨別。與傳統(tǒng)分類法互補的分子生物學方法研究酵母菌的基因型,主要以遺傳物質(zhì)核酸作為研究對象,更能反映其遺傳本質(zhì),對酵母菌的多樣性分析能夠提供基因水平的詳細信息,使鑒定更具準確性和遺傳特異性。目前,常用分子生物學鑒定酵母菌株的遺傳信息最直接檢測對象為:染色體基因組DNA、核糖體DNA、線粒體DNA,具體方法主要有基于聚合酶鏈反應(PCR)的酵母核糖體基因序列分析,例如26S rRNA的D1/D2區(qū)域基因序列測序,5.8S rRNA-ITS-RFLP分析等。本研究對于1株未知菌株從表型到代謝圖譜到基因型多種手段進行的鑒定,得出此菌株為淺白隱球酵母菌。由于其獨特的生長環(huán)境,該酵母菌各方面的特性都比較好,產(chǎn)物中有含量比較高的多糖,而多糖的存在可能是菌體對環(huán)境中普遍存在的抗菌物質(zhì)的反應,如表面活性物質(zhì)、細菌毒素、噬菌體、抗生素、抗體等,所以野生菌株產(chǎn)生的胞外多糖對細菌的黏附以及在競爭環(huán)境中的存活和生長都具有重要的作用[3]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)多種細菌的胞外多糖具有很強的生物學活性和醫(yī)學作用,然而淺白隱球菌一般是一種病原菌,有進一步分析多糖的潛在研究價值。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    菌株:實驗室保藏編號為J2002的菌株(由羅布泊地區(qū)分離得到);酵母菌基因提取試劑盒:OMIGA公司產(chǎn)品;PCR引物:由金斯瑞公司合成;KOD-Plus DNA Polymerase,dNTPs:TOYOBO公司產(chǎn)品;HhaⅠ、HaeⅢ、Hinf Ⅰ3種酶:TOYOBO公司產(chǎn)品;PCR擴增儀:Applied Biosystems公司生產(chǎn);GIS-2009 凝膠成像儀:伯樂公司生產(chǎn);DYY-6B電泳儀:北京六一公司生產(chǎn);Bioloy生物自動分析儀以及96微孔板(YT板):華粵公司生產(chǎn);其他培養(yǎng)基所用試劑均為市售分析純試劑。

    1.2 方法

    1.2.1 酵母菌的鑒定

    1.2.1.1 酵母菌形態(tài)觀察 酵母菌在YPD斜面培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基:葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母提取物1%,瓊脂粉2%)30 ℃條件下培養(yǎng)2 d,直接刮取制成玻片,在顯微鏡下觀察未染色以及染色后的酵母菌的形態(tài),同時又將活化的酵母菌轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基上30 ℃過夜培養(yǎng),稀釋涂布于平板上觀察酵母菌的外觀形態(tài)。

    1.2.1.2 酵母菌生理生化試驗 酵母菌的生理生化試驗主要是利用Biolog自動分析儀來進行。將分離到的純種用棉簽挑到無菌水中,配成指定細胞濃度的(酵母菌為47%[4],由比濁儀測量濁度)菌懸液。將菌懸液按每孔100 μL的量加到Y(jié)T板(即96微孔孵育板)后孵育(此孵育條件根據(jù)儀器掃描所要的培養(yǎng)條件來定,各種菌有不同的培養(yǎng)需要,酵母菌為 26 ℃ 孵育)。所有孔在剛開始時候都是無色的,當孵育一段時間之后,那些能被細胞利用的碳源孔中的呼吸作用增強了。增強呼吸作用導致四唑氧化還原染料被還原,變成紫色。同時,能被利用的碳源孔中的微生物也開始生長,導致濁度變高。孵育24、48、72 h后,通過YT板上顯紫色及濁度變化所產(chǎn)生的指紋圖譜同Biolog數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對。如果找到匹配的,所分離出來的微生物即可得到鑒定。

    1.2.1.3 酵母菌的26S rDNA的D1/D2區(qū)域基因序列分析 以提取的酵母菌總DNA為模板,用真菌26S rDNA的 D1/D2 區(qū)通用引物NL1 和NL4[5](NL1:5′-GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3′;NL4:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACG-3′)作為上下游引物,擴增菌株26S rDNA的D1/D2區(qū)域片段,PCR條件為:94 ℃預變性2 min,94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,68 ℃延伸45 s。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳驗證,將純化后的PCR產(chǎn)物送至金斯瑞公司測序,拼接后的26S rDNA D1/D2區(qū)序列于NCBI-GenBank 數(shù)據(jù)庫中的進行搜索,應用BLAST工具與已登陸的酵母菌26S rDNA 序列進行比對,并利用軟件MEGA制成系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.2.1.4 酵母菌的5.8S rDNA-RFLP酶切 以提取的酵母菌的總DNA為擴增模版,以ITS1/ITS4[6](ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′;ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為上下游引物擴增5.8S-ITS區(qū)域,PCR條件為:94 ℃預變性2 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,68 ℃ 延伸45 s。將擴增的片段用3種限制酶,分別是HhaⅠ、HaeⅢ、 Hinf Ⅰ[7]進行單酶切,酶切的片段在TBE緩沖液中電泳。電泳結(jié)果與由 Esteve-Zarzoso等在1999年首次做的5.8S rDNA-RFLP的酶切圖譜大全[8]進行比對。

    1.2.2 酵母菌生長條件的研究

    1.2.2.1 溫度對酵母菌生長的影響 酵母菌于YPD斜面培養(yǎng)基上30 ℃活化2 d,繼而轉(zhuǎn)接于YPD液體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基的裝液量為50 mL,接種量為2%。30 ℃過夜培養(yǎng),調(diào)整到統(tǒng)一的D600 nm=1.0,進行2次擴大培養(yǎng),培養(yǎng)條件相同,設計不同的溫度;溫度分別為27、30、33、36、39、41 ℃,不同溫度下通過D600 nm值檢測其細胞生長密度。

    1.2.2.2 pH值對酵母菌生長的影響 酵母菌于YPD斜面培養(yǎng)基上活化2 d,培養(yǎng)條件同上,調(diào)整到統(tǒng)一的D600 nm=10,再次轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中,設計不同的pH值:pH值分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、110、12.0、13.0、14.0,在不同pH值下通過D600nm處的值簡單檢測其生長狀況。

    1.2.2.3 酵母菌生長曲線的研究 在YPD斜面培養(yǎng)活化酵母菌,轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng),調(diào)整到統(tǒng)一的D600 nm為1.0,2次轉(zhuǎn)接于YPD培養(yǎng)液中,于30 ℃培養(yǎng)條件下,根據(jù)培養(yǎng)時間、生長密度,繪制出其培養(yǎng)周期內(nèi)的生長曲線。

    1.2.3 淺白隱球酵母產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)及含量測定 淺白隱球酵母的產(chǎn)物方面已報道過的一般為油脂[9-10],但是這株經(jīng)過強輻射后的淺白隱球酵母的產(chǎn)物中有多糖。菌體以YPD培養(yǎng)基按上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)6~8 h,控制菌數(shù)大約在1×107個/mL,按上述接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖3%、硫酸銨0.3%、酵母提取物0.2%、水硫酸鎂0.05%。培養(yǎng)基也以上述培養(yǎng)基條件培養(yǎng),多糖含量以改進的苯酚-硫酸法跟蹤測定[11]。10 mg葡萄糖定容至100 mL,根據(jù)表1內(nèi)容繪制葡萄糖標準曲線。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酵母菌碳氮源的利用分析及其檢測

    利用Biolog自動掃描儀進行的分析,對碳/氮檢測結(jié)果見表2。

    由表2可以初步得出,該酵母菌是淺白隱球酵母。根據(jù)源數(shù)據(jù)進行分析,該酵母菌能利用多種碳氮源,具體利用情況見表3,并且經(jīng)過驗證試驗發(fā)現(xiàn),對于葡萄糖跟蔗糖的利用程度差不多,可利用碳源有:糊精、菊糖、纖維二糖、龍膽二糖、麥芽糖、麥芽三糖、松三糖、棉籽糖、海藻糖。處于臨界值:乙酸、琥珀酸、異麥芽酮糖、山梨糖、水楊苷、山梨醇、阿拉伯糖醇。與《酵母菌的特征與鑒定手冊》中淺白隱球酵母的同化試驗數(shù)據(jù)相比大多碳氮源利用相同。

    2.2 酵母菌的26S rDNA的D1/D2區(qū)域基因序列以及樹狀圖分析

    以NL1 和NL4 作為上下游引物,擴增菌株26S rDNA的D1/D2區(qū)域片段,片段長度在700 bp左右,電泳結(jié)果見圖1。

    該電泳結(jié)果條帶單一,將此產(chǎn)物純化后送至金斯瑞公司測序,反饋的序列經(jīng)過比對的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

    系統(tǒng)發(fā)育樹的分支表示是親緣關系,離得越遠親緣關系越低,彼此靠近的二者基本可以認定為同種(如果blast出來后發(fā)現(xiàn)二者同源性非常高的話),而它們之間那個數(shù)值表示這個同源性的可靠程度多高。數(shù)值越高表示二者的親緣關系(也就是同種)越可信。一般要>95才能表示是同種,66以上可以表示是亞種或者變種之類。構(gòu)建此酵母系統(tǒng)發(fā)育樹時,選擇了相似性高達95%以上的序列作為比對對象,分析出該酵母菌與模式菌株10666等構(gòu)成1個大分支,與淺白隱球酵母為同1個種,與羅倫隱球酵母為亞種關系或者變種(圖2)。

    2.3 酵母菌5.8S rDNA-RFLP單酶切結(jié)果

    以引物擴增5.8S-ITS區(qū)域PCR產(chǎn)物電泳見圖3,片段長度大概在600bp左右,酶切片段見圖4。圖中目的條帶清〗

    晰而明亮,長度約為600 bp,但是有雜帶和引物二聚體條帶,本試驗將目的條帶切膠回收后進行單酶切反應。

    從圖3、圖4看出,第一泳道為HaeⅢ酶切片段,片段長度為500+70+60 bp;第二泳道為HhaⅠ酶切片段,片段長度為330+330 bp;HinfⅠ酶切片段,片段長度為350+160+120 bp。參照 Esteve-Zarzoso等在1999年首次做的5.8S rDNA-RFLP的酶切圖譜大全的結(jié)果可以判定此酵母菌為淺白隱球酵母。

    2.4 溫度、pH值對淺白隱球酵母生長的影響

    將淺白隱球酵母培養(yǎng)于YPD培養(yǎng)基上,進行2次轉(zhuǎn)接后以D600nm為指標檢測其生長狀態(tài),結(jié)果見圖5、圖6。

    由于該淺白隱球酵母取自新疆羅布泊強輻射地區(qū),生長特性比一般酵母菌頑強,能在比較高的溫度(39 ℃)下生長,除此之外強酸強堿(pH值3~13)下也能較好地生長。相關特性還需進一步研究。

    2.5 淺白隱球酵母在最適溫度以及pH值下的各生長時期

    淺白隱球酵母于最適培養(yǎng)條件下探究其各個時期的具體生長時間。

    這株淺白隱球酵母的各生長時期與典型的酵母菌的生長有很大的相似之處,在生長4~5 h后進入對數(shù)生長期,在 22~24 h 后進入延緩期,27 h后進入衰退期(圖7)。

    2.6 淺白隱球酵母形態(tài)特征

    此株淺白隱球酵母呈現(xiàn)圓形或者卵圓形,以出芽生殖為主,菌落為乳白色,圓形,凸起,邊緣光滑(圖8、圖9)。

    2.7 淺白隱球酵母多糖的含量

    樣品處理為1 mL樣品液加1 mL蒸餾水,加1 mL 6%的苯酚,加5 mL的濃硫酸,沸水浴10 min加熱后以流水徹底冷卻,在490 nm處測吸光度。葡萄糖標準曲線見圖10。將測得的多糖D值換算成稀釋后的值代入葡萄糖標準曲線,得到多糖含量見圖11,多糖含量及活菌率見表4。

    由圖10得到葡萄糖標準曲線擬合方程為y=0.047 5x+0.014 8,r=0.999 7。該曲線方程的趨勢線擬合度很高,相關系數(shù)高達0.999 7。

    根據(jù)以上結(jié)果可以得出,淺白隱球酵母產(chǎn)物中的多糖含量最高可達0.9 mg/mL,在搖瓶發(fā)酵至18 h后,產(chǎn)量達到最高后隨著菌體死亡速度的加快而下降。

    3 結(jié)論與討論

    經(jīng)多種方法鑒定得知,該酵母菌為淺白隱球酵母。該菌株生長能夠耐受較高溫度,最高溫度能達到39 ℃, 該菌株能在強酸強堿中生存,最酸壞境pH值僅為3.0,最高堿度pH值可達13。經(jīng)試驗驗證發(fā)現(xiàn),自新疆羅布泊地區(qū)分離所得的該淺白隱球酵母菌具有一定的抗輻射性能。酵母菌耐輻射性質(zhì)揭示,可能該酵母菌自身所產(chǎn)生的物質(zhì)如多糖、蛋白質(zhì)或者多糖與蛋白的復合物,本菌株的產(chǎn)物可能是多糖具有抗輻射性能,相關報道認為,多糖等物質(zhì)能耐受輻射,王璐璐研究發(fā)現(xiàn),多糖AEPS具有清除自由基的能力,尤其是對羥基自由基和超氧陰離子的清除能力非常顯著[12];也有可能是酵母菌本身的生長、代謝機制在外界條件下發(fā)生了變化,進一步研究,有可能找到一種微生物耐輻射的新機制,有望將這類酵母菌選作其他有利于微生物生長的候選產(chǎn)物的宿主細胞;也有可能就是此酵母菌自身的某些特定基因的表達能耐受強輻射,張永芹等利用pprI 基因轉(zhuǎn)染救治小鼠致死性輻射損傷的研究表明,PprI 蛋白質(zhì)有可能成為一種新的來自原核生物的輻射防護劑[13]。他們研究發(fā)現(xiàn),pprI 基因是一個對電離輻射抗性起關鍵作用的DNA 修復開關基因。

    無論是尋找到抗輻射產(chǎn)物,還是尋找耐輻射相關基因,對這1株特殊條件地域獲得的淺白隱球酵母的進一步研究都有可能發(fā)現(xiàn)宿主細胞或者表達產(chǎn)物的新視野。

    參考文獻:

    [1]李金霞,程 池,姚 粟,等. Biolog微生物自動分析系統(tǒng)——酵母菌鑒定操作規(guī)程的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(7):50-53.

    [2]程 池,楊 梅,李金霞,等. 微生物自動分析系統(tǒng)——細菌鑒定操作規(guī)程的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(5):50-54.

    [3]Costerton J W,Irvin R T,Cheng K J. The bacterial glycocalyx in nature and disease[J]. Annual Review of Microbiology,1981,35:299-305.

    [4]Praphailong W,van Gestel M,F(xiàn)leet G H,et al. Evaluation of the biolog system for the identification of food and beverags yeasts[J]. Letters in Applied Microbiology,1997,24:455-459.

    [5]Kurtzman C P,Christie J R. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit(26S) ribosomal DNA partial sequences[J]. Antonie van Leeuwenhoek,1998,73(4):331-371.

    [6]Tay S T,Na S L,Tajuddin T H. Natural occurrence and growth reaction on canavanine-glycine-bromothymol blue agar of non-neoformans Cryptococcus spp.in Malaysia[J]. Original Article,2008,52:515-519.

    [7]N′ Guessan K F , Brou K,Jacques N ,et al.Identification of yeasts during alcoholic fermentation of tchapalo,a traditional sorghum beer from Cted,Ivoire[J]. Antonie van Leeuwenhoek,2011,99:855-864.

    [8]Esteve-Zarzoso B,Belloch C,Uruburu F,et al. Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers[J]. International Journal of Systematic Bacteriology,1999,49:329-337.

    [9]吳開云,程俊文,李紀元,等. 淺白隱球酵母產(chǎn)油工程菌液體深層發(fā)酵技術研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學,2012(21):12-15.

    [10]中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所. 一種高產(chǎn)油酸的淺白隱球酵母工程菌株的構(gòu)建方法:中國,CN 101892250 A[P]. 2010-11-04.

    [11]Dubois M,Gilles K A,Hamilton J K,et al. A colorimetric method for the determination of sugars[J]. Nature,1951,28(7):167-168.

    [12]王璐璐. 土芽孢桿菌TS3-9胞外多糖的初步研究[D]. 杭州:浙江工商大學,2013:1-82.

    [13]張永芹,周 輝,陳 潔,等. 耐輻射球菌PprI蛋白質(zhì)表達及其純化的實驗研究[J]. 輻射研究與輻射工藝學報,2011,29(2):117-122.

    猜你喜歡
    鑒定酵母菌
    酵母菌知多少
    米卡芬凈對光滑假絲酵母菌在巨噬細胞內(nèi)活性的影響
    為什么酵母菌既能做面包也能釀酒?
    試析檔案整理與鑒定
    青年時代(2016年28期)2016-12-08 19:41:51
    古籍版本鑒定
    淺議檢察機關司法會計鑒定的主要職責
    青銅器鑒定與修復初探
    資治文摘(2016年7期)2016-11-23 00:23:20
    八種氟喹諾酮類藥物人工抗原的合成及鑒定
    高職院校教學檔案的鑒定與利用
    讓面包變“胖”的酵母菌
    久久久久久久久大av| 伦精品一区二区三区| 亚洲va在线va天堂va国产| 成人特级av手机在线观看| 亚洲国产精品专区欧美| 日本与韩国留学比较| 在线天堂最新版资源| 麻豆成人av视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产精品人妻久久久久久| 99久久综合免费| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 精品一区在线观看国产| 亚洲欧洲国产日韩| 一区在线观看完整版| 国产精品成人在线| 只有这里有精品99| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 国产免费一级a男人的天堂| 成人免费观看视频高清| 日韩国内少妇激情av| 国产探花极品一区二区| 欧美激情国产日韩精品一区| 尾随美女入室| 日韩欧美一区视频在线观看 | 免费黄网站久久成人精品| 国产69精品久久久久777片| 国产精品熟女久久久久浪| 一级a做视频免费观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 在线观看一区二区三区| 在线观看一区二区三区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 日韩制服骚丝袜av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 99热国产这里只有精品6| 久久国产乱子免费精品| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 国产精品成人在线| 看非洲黑人一级黄片| 日韩中字成人| 欧美日韩在线观看h| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 精品熟女少妇av免费看| 久久久久久久久久久免费av| 国产成人freesex在线| 人妻一区二区av| 国产成人精品一,二区| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲不卡免费看| 国产在线一区二区三区精| 在线观看人妻少妇| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 一个人免费看片子| 一个人免费看片子| 高清在线视频一区二区三区| 国产乱来视频区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产成人免费观看mmmm| 黄片wwwwww| 国产黄频视频在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 午夜日本视频在线| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 边亲边吃奶的免费视频| 国产黄色免费在线视频| 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产精品嫩草影院av在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 在线观看免费高清a一片| 色哟哟·www| 有码 亚洲区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久久久伊人网av| 草草在线视频免费看| 最新中文字幕久久久久| 久久精品国产自在天天线| 日韩精品有码人妻一区| 久久久久精品久久久久真实原创| 日韩伦理黄色片| 国产精品无大码| 亚洲在久久综合| 日韩成人伦理影院| 国产在线男女| 99久久精品一区二区三区| 黄色欧美视频在线观看| tube8黄色片| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 99久久精品一区二区三区| 国产精品国产av在线观看| 91狼人影院| 不卡视频在线观看欧美| 国产av码专区亚洲av| 欧美精品一区二区大全| 精品人妻偷拍中文字幕| 交换朋友夫妻互换小说| 日韩人妻高清精品专区| 最近2019中文字幕mv第一页| 极品少妇高潮喷水抽搐| 天天躁日日操中文字幕| 校园人妻丝袜中文字幕| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲,一卡二卡三卡| 成人无遮挡网站| 国产深夜福利视频在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 国产成人a区在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 国产亚洲欧美精品永久| 久久久久网色| 国产精品国产av在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 青春草亚洲视频在线观看| 秋霞在线观看毛片| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 少妇人妻一区二区三区视频| 在线观看免费高清a一片| 99久久人妻综合| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 精品熟女少妇av免费看| 亚洲欧洲日产国产| 三级国产精品片| 在线精品无人区一区二区三 | 亚洲av成人精品一区久久| 日韩欧美 国产精品| 黑人猛操日本美女一级片| 天堂俺去俺来也www色官网| 在线精品无人区一区二区三 | 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久精品国产自在天天线| 国精品久久久久久国模美| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 黄色一级大片看看| 日韩制服骚丝袜av| 99久久综合免费| 黑人猛操日本美女一级片| 99热这里只有是精品50| 欧美成人精品欧美一级黄| 51国产日韩欧美| 日本av免费视频播放| 亚洲国产精品国产精品| 涩涩av久久男人的天堂| av视频免费观看在线观看| 日韩成人伦理影院| 午夜福利在线在线| 国产精品欧美亚洲77777| 国产亚洲精品久久久com| 中文在线观看免费www的网站| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久国产精品大桥未久av | 国产免费又黄又爽又色| 中文字幕制服av| 极品教师在线视频| 欧美3d第一页| 人妻 亚洲 视频| av.在线天堂| 亚洲成人中文字幕在线播放| 激情 狠狠 欧美| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 成人二区视频| 人妻系列 视频| 一区二区三区四区激情视频| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲性久久影院| 黄色日韩在线| 亚洲av日韩在线播放| 国产黄色免费在线视频| 一区二区三区精品91| 国产永久视频网站| 亚洲无线观看免费| av卡一久久| 国产精品99久久久久久久久| 色网站视频免费| 黄片无遮挡物在线观看| 十分钟在线观看高清视频www | 最近中文字幕2019免费版| 寂寞人妻少妇视频99o| 人妻夜夜爽99麻豆av| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久久久久久久大av| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲精品乱久久久久久| 看免费成人av毛片| 免费人成在线观看视频色| av国产久精品久网站免费入址| 在线观看av片永久免费下载| 岛国毛片在线播放| 久久久精品免费免费高清| 国产精品一区www在线观看| 联通29元200g的流量卡| 性色av一级| 成年av动漫网址| 在线播放无遮挡| 日日啪夜夜撸| 亚洲精品国产色婷婷电影| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久精品夜色国产| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产高清三级在线| 在线精品无人区一区二区三 | 国产精品免费大片| 国产乱人视频| 国产成人一区二区在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 色网站视频免费| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲无线观看免费| 高清黄色对白视频在线免费看 | 中文字幕亚洲精品专区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 99热全是精品| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产伦精品一区二区三区四那| 99热这里只有是精品50| 国产精品熟女久久久久浪| 免费在线观看成人毛片| av女优亚洲男人天堂| 免费黄网站久久成人精品| 联通29元200g的流量卡| 在线精品无人区一区二区三 | 少妇丰满av| 亚洲国产高清在线一区二区三| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 岛国毛片在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲成人一二三区av| 国产一级毛片在线| 亚洲内射少妇av| 久久久久网色| 久久久久久久久久成人| 精品久久久久久久久亚洲| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 欧美3d第一页| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 成人国产麻豆网| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久久久久人妻| 亚洲美女搞黄在线观看| 观看免费一级毛片| 久热这里只有精品99| 免费观看在线日韩| 久久人妻熟女aⅴ| 少妇熟女欧美另类| 国产黄色视频一区二区在线观看| 舔av片在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲av福利一区| 国产精品一区www在线观看| 91精品国产国语对白视频| 精品少妇久久久久久888优播| 精品人妻熟女av久视频| 联通29元200g的流量卡| 永久免费av网站大全| 最新中文字幕久久久久| 91精品国产国语对白视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产日韩欧美在线精品| 午夜精品国产一区二区电影| 国产一级毛片在线| 色视频在线一区二区三区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 伦精品一区二区三区| 日本wwww免费看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲性久久影院| 国产精品一及| 国产美女午夜福利| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久久成人免费电影| 国产中年淑女户外野战色| 97超碰精品成人国产| 一区二区av电影网| 狂野欧美激情性bbbbbb| 免费大片黄手机在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 免费av中文字幕在线| 亚洲va在线va天堂va国产| 婷婷色av中文字幕| 涩涩av久久男人的天堂| 国产在线男女| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久青草综合色| 黄色怎么调成土黄色| 久久午夜福利片| 熟女人妻精品中文字幕| tube8黄色片| 久久av网站| 黄色日韩在线| 视频区图区小说| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产黄频视频在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 欧美成人a在线观看| 亚洲不卡免费看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚州av有码| 99热这里只有是精品在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲av.av天堂| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲无线观看免费| 男女边摸边吃奶| 高清不卡的av网站| 免费观看的影片在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 韩国av在线不卡| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 插逼视频在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 国产一级毛片在线| 亚洲经典国产精华液单| 欧美精品一区二区免费开放| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 精品一区二区三卡| 另类亚洲欧美激情| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲色图综合在线观看| 日韩电影二区| 亚洲国产精品专区欧美| 妹子高潮喷水视频| 我的老师免费观看完整版| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲国产高清在线一区二区三| av国产精品久久久久影院| 成人午夜精彩视频在线观看| 最黄视频免费看| 五月天丁香电影| 亚洲国产最新在线播放| 干丝袜人妻中文字幕| 国产欧美日韩精品一区二区| av.在线天堂| xxx大片免费视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 高清黄色对白视频在线免费看 | 亚洲精品,欧美精品| 少妇的逼好多水| 五月天丁香电影| 新久久久久国产一级毛片| 精品人妻偷拍中文字幕| 激情五月婷婷亚洲| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产 一区 欧美 日韩| 国产高清不卡午夜福利| 少妇被粗大猛烈的视频| 婷婷色综合www| 十八禁网站网址无遮挡 | 精品久久久久久久久亚洲| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美国产精品一级二级三级 | 国产欧美亚洲国产| 国产精品偷伦视频观看了| 2018国产大陆天天弄谢| 一级毛片久久久久久久久女| 免费看av在线观看网站| 看免费成人av毛片| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 超碰97精品在线观看| 亚洲色图av天堂| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 99久国产av精品国产电影| 成人亚洲精品一区在线观看 | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| av线在线观看网站| 欧美精品一区二区免费开放| 下体分泌物呈黄色| 看十八女毛片水多多多| 亚洲怡红院男人天堂| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 最近最新中文字幕免费大全7| 欧美成人a在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 免费观看在线日韩| 欧美另类一区| 亚洲图色成人| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 男女无遮挡免费网站观看| 国产免费一级a男人的天堂| 在线观看国产h片| 又爽又黄a免费视频| av在线蜜桃| 一级二级三级毛片免费看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| freevideosex欧美| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品嫩草影院av在线观看| 日本一二三区视频观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日本一二三区视频观看| av专区在线播放| 欧美精品一区二区免费开放| 一本一本综合久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 最新中文字幕久久久久| 亚洲国产最新在线播放| av在线老鸭窝| 欧美精品一区二区大全| 国产精品不卡视频一区二区| 色5月婷婷丁香| 国产黄频视频在线观看| 国产高清国产精品国产三级 | 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美激情国产日韩精品一区| 大码成人一级视频| 99久久综合免费| 久久久国产一区二区| 男女下面进入的视频免费午夜| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美一级a爱片免费观看看| av.在线天堂| av免费在线看不卡| 久热久热在线精品观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久99热这里只频精品6学生| 久久精品国产亚洲av天美| 国产日韩欧美在线精品| 国产69精品久久久久777片| 黄色一级大片看看| 一级a做视频免费观看| 男人添女人高潮全过程视频| 亚州av有码| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲av不卡在线观看| 精品久久久久久久久亚洲| 国产精品蜜桃在线观看| 一区在线观看完整版| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久久久久久久久久免费av| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产在线免费精品| 日日撸夜夜添| 国产黄色免费在线视频| 精品久久久久久久末码| 熟女av电影| 久久人人爽人人爽人人片va| 成年av动漫网址| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲av免费高清在线观看| 国产av码专区亚洲av| 久久影院123| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产有黄有色有爽视频| 不卡视频在线观看欧美| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 直男gayav资源| 免费人妻精品一区二区三区视频| 免费观看的影片在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 91在线精品国自产拍蜜月| 人妻一区二区av| 97在线视频观看| 国产淫语在线视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久久久久人妻| 看非洲黑人一级黄片| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产黄色免费在线视频| 国内精品宾馆在线| av福利片在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久99热这里只有精品18| 晚上一个人看的免费电影| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| av不卡在线播放| 久久久久国产网址| 搡老乐熟女国产| 久久这里有精品视频免费| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 日韩制服骚丝袜av| 欧美极品一区二区三区四区| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 老司机影院毛片| 97超视频在线观看视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 成年av动漫网址| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 一级av片app| 一区二区三区精品91| 99热6这里只有精品| 日韩欧美 国产精品| 国模一区二区三区四区视频| 大香蕉久久网| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久精品国产亚洲av涩爱| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产精品99久久久久久久久| 精品人妻一区二区三区麻豆| 又大又黄又爽视频免费| 极品教师在线视频| 五月伊人婷婷丁香| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 黄色配什么色好看| 精品久久久久久久久av| 国产免费又黄又爽又色| 丰满人妻一区二区三区视频av| 极品教师在线视频| 亚洲欧洲国产日韩| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久99热这里只有精品18| 丝袜喷水一区| 精品午夜福利在线看| 少妇精品久久久久久久| av免费在线看不卡| 97在线人人人人妻| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 好男人视频免费观看在线| 老司机影院毛片| 日韩欧美精品免费久久| 熟女电影av网| 亚洲欧美清纯卡通| 永久免费av网站大全| 最近手机中文字幕大全| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 一边亲一边摸免费视频| 黄色欧美视频在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 男女无遮挡免费网站观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 高清视频免费观看一区二区| 国产成人免费无遮挡视频| 看十八女毛片水多多多| 丰满少妇做爰视频| 免费av不卡在线播放| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲av.av天堂| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲真实伦在线观看| 99热全是精品| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 三级国产精品片| 久久久午夜欧美精品| 永久网站在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 网址你懂的国产日韩在线| 91久久精品国产一区二区成人| h日本视频在线播放| 久久午夜福利片| 大陆偷拍与自拍| 毛片女人毛片| 日韩人妻高清精品专区| 超碰97精品在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 老熟女久久久| av免费在线看不卡| 黄色欧美视频在线观看| 丰满乱子伦码专区| 在线播放无遮挡| 精品少妇久久久久久888优播| 网址你懂的国产日韩在线| 免费观看的影片在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲欧美精品专区久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 成人国产麻豆网| 国产 一区 欧美 日韩| 大码成人一级视频| 久热这里只有精品99| 舔av片在线| 九草在线视频观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲欧美精品自产自拍| 少妇熟女欧美另类| 少妇被粗大猛烈的视频| 免费黄频网站在线观看国产| 高清av免费在线| 熟女av电影| 美女内射精品一级片tv| 高清黄色对白视频在线免费看 | 高清欧美精品videossex| 男女啪啪激烈高潮av片| 妹子高潮喷水视频| 99久久精品热视频| av专区在线播放| 久久综合国产亚洲精品| 在现免费观看毛片| 一个人免费看片子| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久久久久伊人网av| 成人午夜精彩视频在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 午夜福利高清视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲自偷自拍三级|