王氏連樸飲對(duì)脾胃濕熱證大鼠血清ALD、血漿ADH和β-EP影響的研究

錢(qián)益嘯，李云鵬，陳景良，鐘偉麗，賀婧，文小敏*（.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州5055；.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東廣州5035）

王氏連樸飲對(duì)脾胃濕熱證大鼠血清ALD、血漿ADH和β-EP影響的研究

錢(qián)益嘯1，李云鵬1，陳景良2，鐘偉麗2，賀婧2，文小敏1*
（1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東廣州510315）

目的觀察脾胃濕熱證模型大鼠中血清醛固酮（ALD）、血漿抗利尿激素（ADH）及β-內(nèi)啡肽（β-EP）的變化，并探討王氏連樸飲的調(diào)控作用。方法將40只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、王氏連樸飲（高、中、低劑量）組。除正常對(duì)照組外，其余各組均采用復(fù)合因素法（外部濕熱環(huán)境+肥甘飲食+病原微生物）造成脾胃濕熱證大鼠模型，造模后按不同劑量組給予中藥灌胃，采用放射免疫法檢測(cè)血清ALD、血漿ADH和β-EP的水平。結(jié)果與模型組比較，王氏連樸飲（高、中、低劑量）組ALD、ADH以及β-EP水平明顯降低（P＜0.01）；中劑量組與高、低劑量組之間比較水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論復(fù)合因素造?？梢允蛊⑽笣駸嶙C大鼠ALD、ADH和β-EP發(fā)生異常改變，王氏連樸飲可降低ALD、ADH和β-EP的釋放水平，且以中劑量組效果最好，這可能是其清熱祛濕的作用機(jī)制之一。

王氏連樸飲；脾胃濕熱證；醛固酮；抗利尿激素；β-內(nèi)啡肽

〔Abstract〕ObjectiveTo observe the changes of serum ALD，plasma ADH and plasma β-EP in with damp-heat syndrome of spleen-stomach and the regulative action of Wangshi Lianpu drink（WSLPY）.Methods Forty male Wister rats wererandomlydividedintonormalcontrolgroup（NCG），modelgroup（MG），highdoseofWSLPYgroup （HWG），moderate dose of WSLPY group（MWG）and low dose of WSLPY group（LWG）.The mouse models in all groups but the normal control group were built with the compound factor method.The levels of ALD，ADH，and β-EP were detected by radioimmunoassay.Results Compared with normal control group，the concentration of ADH，β-EP in plasma and serum ALD of the rats in the model group increased significantly（P＜0.01）.Compared with the MWG and LWG，the MWG can reduce the levels of ADH，β-EP and ALD（P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion The complex factors way that establishing the model rats withthespleenandstomachdamp-heatsyndromecanchangetheconcentrationofADH，β-EPandALD. Wangshi Lianpu drink could regulate the status of ALD，ADH and β-EP which was probably one of its mechanisms of clearing heat and expelling damp.

〔Keywords〕Wangshi Lianpu drink；damp-heat syndrome of spleen-stomach；ALD；ADH；β-EP

脾胃濕熱證是指由于濕熱內(nèi)蘊(yùn)中焦，脾胃功能失調(diào)為主要證候的一類(lèi)濕熱病證［1］，其臨床癥狀復(fù)雜多變，病程日久纏綿。在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，多種致病因素、濕熱之邪和其他因素對(duì)人體的刺激引起機(jī)體做出應(yīng)激反應(yīng)，而下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（HPA）軸作為應(yīng)激的樞紐，會(huì)發(fā)生神經(jīng)-內(nèi)分泌的改變。本文擬通過(guò)復(fù)合因素（外部濕熱環(huán)境+肥甘飲食+病原微生物）造模［2-3］，探討脾胃濕熱證模型大鼠血清醛固酮（ALD）、血漿抗利尿激素（ADH）及β-內(nèi)啡肽（β-EP）的變化，及王氏連樸飲清熱祛濕的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供40只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，合格證號(hào)為SCXK（粵）2006-0015。

1.1.2藥物藥物均購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院中藥房，參照清·王孟英《霍亂論》原方組成：制厚樸6 g，川黃連、石菖蒲、制半夏各3 g，香豉、焦山梔各9 g，蘆根60 g。把各藥物在水中浸泡至少30 min，加約為藥量8倍的水量，煎煮3次，采用冷凝管收集蒸汽中所揮發(fā)性的藥物成分，并將3次藥汁混合，離心取澄清藥汁。依據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》［4］中的人與大鼠之間劑量換算公式（大鼠按200 g/只計(jì)算），濃縮配制成濃度為0.48、0.97、1.94 g/mL的藥液，存放于4℃冰箱備用。

1.1.3菌種及試劑ALD、ADH和β-EP放免試劑盒均購(gòu)自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。侵襲性大腸桿菌，濃度為109/mL，由南方醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.4高糖高脂飼料采用自制飼料，于普通飼料中混入12%豬油和8%蜂蜜混合加工而成，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制作提供。

1.1.5主要儀器AvantiTM230型超速冷凍離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN公司）；SN-695型放射免疫γ計(jì)數(shù)測(cè)量系統(tǒng)（上海核福光電儀器有限公司）；仿真模擬氣候倉(cāng)［模擬濕熱環(huán)境設(shè)置為溫度（33±2）℃、相對(duì)濕度75%±5℅，由南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生熱帶學(xué)院提供］。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組將40只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法抽取8只，分在正常對(duì)照組，其余32只造模后隨機(jī)分為模型組、王氏連樸飲（高、中、低劑量）4組，每組8只。造模前所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后禁食12 h，自由飲水。

1.2.2造模與給藥（1）正常對(duì)照組：在20～28℃溫度，50%～60%相對(duì)濕度的環(huán)境下，給以普通混合飼料、清水飼喂，每日上午9時(shí)投食。（2）脾胃濕熱證大鼠模型：在20～28℃溫度，50%～60%相對(duì)濕度環(huán)境下，給以高糖高脂飼料喂養(yǎng)10 d。然后置于仿真模擬氣候倉(cāng)（每天上午9時(shí)至11時(shí)）共8 d。第19天回歸自然環(huán)境，上午9時(shí)開(kāi)始灌胃：模型組按2 mL/200 g給予大腸桿菌1次，24 h后再加強(qiáng)感染1次（1 mL/200 g）；王氏連樸飲高、中、低劑量組分別給予濃度為1.94、0.97、0.48 g/mL的王氏連樸飲煎劑灌服大鼠（2 mL/200 g體質(zhì)量），1次/d。7 d后所有動(dòng)物處死取相關(guān)組織并做檢查。

1.2.3標(biāo)本采集及檢測(cè)大鼠于處死前，禁食、不禁水12 h，用10%水合氯醛按照0.72 mL/200 g腹腔注射麻醉后迅速打開(kāi)腹腔：（1）檢測(cè)ALD：經(jīng)腹主動(dòng)脈采血2 mL置入普通采血管，待凝固后，進(jìn)行4℃3 000 r/min離心10 min，分離血清，凍存于-20℃冰箱待測(cè)。（2）檢測(cè)ADH、β-EP：經(jīng)腹主動(dòng)脈采血2 mL置入加有乙二胺四乙酸和抑肽酶的采血管內(nèi)，輕緩混勻，進(jìn)行4℃3 000 r/min離心10 min，分離血漿，凍存于-20℃冰箱待測(cè)。以上標(biāo)本均利用放射免疫法檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明嚴(yán)格操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型組血清ALD、血漿ADH、β-EP顯著升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。經(jīng)灌服王氏連樸飲1周后，與模型組比較，王氏連樸飲（高、中、低劑量組）的ADH和β-EP均有下降，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。對(duì)ADH、β-EP的影響，中劑量與高、低劑量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），而高劑量與低劑量之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)ALD的影響，王氏連樸飲（高、中、低劑量）組之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠血清ALD、血漿ADH以及β-EP含量比較（±s，n=8，pg/mL）

表1　各組大鼠血清ALD、血漿ADH以及β-EP含量比較（±s，n=8，pg/mL）

注：與模型組比較**P＜0.01；與正常對(duì)照組比較##P＜0.01；與王氏連樸飲中劑量組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模型組王氏連樸飲高劑量組王氏連樸飲中劑量組王氏連樸飲低劑量組ALD 0.13±0.02** 0.26±0.03 0.16±0.02** 0.14±0.02** 0.15±0.02** ADH 132.26±24.54** 295.99±34.33 235.05±24.49**##△△191.06±20.55**##241.14±23.57**##△△β-EP 472.37±33.68** 698.26±62.95 597.20±54.20**##△△511.59±51.66** 568.02±51.61**##△

3　討論

脾胃濕熱證是臨床常見(jiàn)和多發(fā)病證，其發(fā)生原因多樣，中醫(yī)認(rèn)為主要和外部濕熱環(huán)境、飲食不節(jié)、內(nèi)傷脾胃等多種因素有關(guān)。查閱相關(guān)文獻(xiàn)［5-8］發(fā)現(xiàn)：清代醫(yī)家王孟英在《霍亂論》中提出的王氏連樸飲是治療這一癥候的首選方之一，方中梔子、黃連性均苦寒，共奏清熱瀉火燥濕之功，而厚樸、半夏、石菖蒲三者配伍并施，苦溫和辛溫相配，辛苦開(kāi)泄，燥濕化濁，半夏兼和胃止嘔之效，豆豉透熱，蘆根生津，有清熱燥濕、理氣化濁之功。

目前對(duì)脾胃濕熱證的相關(guān)發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，但考慮內(nèi)外濕熱、肥甘厚膩以及濕熱之品刺激之下，機(jī)體內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)全身性的非特異性反應(yīng)，以及神經(jīng)內(nèi)分泌的興奮表現(xiàn)，在行為和內(nèi)環(huán)境的代謝等各方面也都會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化［9］，這可能與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的相關(guān)改變有關(guān)。本課題組［10］前期已通過(guò)大量相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SPF級(jí)Wistar大鼠在脾胃濕熱復(fù)合因素造模的過(guò)程中，濕熱環(huán)境、高脂高糖飲食和生物刺激會(huì)讓大鼠發(fā)生一定的應(yīng)激反應(yīng)，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)出現(xiàn)興奮，HPA軸進(jìn)入亢進(jìn)狀態(tài)，其中血清皮質(zhì)醇和促腎上腺皮質(zhì)激素分泌水平明顯增高。在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中，β-EP是一種與體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切的內(nèi)源性阿片肽，有研究表明［11］炎性疼痛使β-EP的消耗增多，促使體內(nèi)合成與釋放更多的β-EP來(lái)對(duì)抗疼痛，使痛與鎮(zhèn)痛維持在一個(gè)較高的水平，這是機(jī)體對(duì)傷害性刺激自身的適應(yīng)性調(diào)整。有研究顯示［12］縮泉丸可以增加自然衰老大鼠血中ALD和ADH的含量，有明顯的抗利尿作用，可以從調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)的重吸收和分泌發(fā)揮作用。劉德芳等［13］在進(jìn)行濕阻中焦證大鼠造模過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，濕阻中焦證大鼠的ADH釋放和ALD分泌水平均有升高的趨勢(shì)，提示兩者可能共同參與了濕阻中焦證模型中水、電解質(zhì)平衡的調(diào)節(jié)。此外研究還發(fā)現(xiàn)［14］，在一定的熱暴露后，可引起機(jī)體水鹽代謝紊亂，并通過(guò)HPA軸的神經(jīng)內(nèi)分泌參與了熱應(yīng)激的反應(yīng)，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)這在一過(guò)程中具有重要作用。而ALD也會(huì)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的下丘腦，下丘腦分泌激素促使垂體釋放ADH，來(lái)進(jìn)行腎小管對(duì)水分的重吸收作用。ALD、ADH的相互作用對(duì)水鹽代謝及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的恒定起著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示脾胃濕熱證模型組大鼠ALD、ADH及β-EP的表達(dá)升高，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明脾胃濕熱證大鼠機(jī)體在對(duì)抗?jié)駸岽碳ぃw內(nèi)鈉離子及水份的吸收增加，遠(yuǎn)端腎小管與集合管水分重吸收加強(qiáng)，被保留在體內(nèi)，存在水、鈉潴留現(xiàn)象；灌服王氏連樸飲湯煎劑高、中、低3種劑量后，各組均有不同程度的降低，以中劑量組效果最好，ALD、ADH和β-EP表達(dá)與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示王氏連樸飲能調(diào)節(jié)內(nèi)分泌激素使機(jī)體水電解質(zhì)的平衡，適應(yīng)環(huán)境改變，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定，其機(jī)制可能與上調(diào)神經(jīng)內(nèi)分泌激素表達(dá)有關(guān)，這可能是其清熱祛濕作用機(jī)制之一。

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（本文編輯匡靜之）

Effect of Wangshi Lianpu Drink on Serum ALD，Plasma ADH and β-EP in Rats with Damp-Heat Syndrome of Spleen-Stomach

QIAN Yixiao1，LI Yunpeng1，CHEN Jingliang2，ZHONG Weili2，HE Jing2，WEN Xiaomin1*
（1.College of Pharmacy，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong 510515，China；2.Hospital of Integrated TCM and Western Medicine，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong 510315，China）

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.02.006.017.03

2014-11-12

廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目資助（2008195）；廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目資助（20131242）。

錢(qián)益嘯，男，在讀碩士研究生，主要從事脾胃病的基礎(chǔ)與臨床治療研究。

*文小敏，男，教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：wxm@fimmu.com。