艾灸對(duì)脾虛胃潰瘍模型大鼠血清TFF及胃黏膜ERK1/2、PCNA的影響

李鐵浪，粟艷梅，祁芳，倪偉，張泓*，張雨辰，郭華（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙4008；.婁底市中心醫(yī)院康復(fù)科，湖南婁底47000；.湖南省中醫(yī)院疼痛理療科，湖南長(zhǎng)沙40005）

艾灸對(duì)脾虛胃潰瘍模型大鼠血清TFF及胃黏膜ERK1/2、PCNA的影響

李鐵浪1，粟艷梅2，祁芳1，倪偉1，張泓1*，張雨辰3，郭華1
（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208；2.婁底市中心醫(yī)院康復(fù)科，湖南婁底417000；3.湖南省中醫(yī)院疼痛理療科，湖南長(zhǎng)沙410005）

目的觀察艾灸對(duì)脾虛胃潰瘍模型大鼠血清三葉因子（TFF1、TFF2）、胃黏膜細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）和增殖細(xì)胞抗原（PCNA）的影響，探討艾灸促進(jìn)胃黏膜增殖修復(fù)的可能機(jī)制。方法將50只健康SD大鼠隨機(jī)抽取10只為空白組，其余40只采用苦寒瀉下法+無(wú)水乙醇灌胃建立脾虛胃潰瘍大鼠模型，模型成立后隨機(jī)分為模型組、四君子湯組、艾灸組和艾灸非穴位組，每組10只。各組予以相應(yīng)處理，8 d后采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中TFF1、TFF2的含量，免疫印跡法檢測(cè)胃黏膜組織p-ERK1/2蛋白的表達(dá)，免疫組化法測(cè)胃黏膜細(xì)胞PCNA的表達(dá)。結(jié)果艾灸足三里、中脘等穴能明顯提高胃黏膜損傷大鼠血清TFF1、TFF2的含量，增強(qiáng)胃黏膜損傷大鼠胃黏膜組織p-ERK1/2蛋白和PCNA的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論艾灸能促進(jìn)脾虛胃潰瘍大鼠損傷胃黏膜的增殖修復(fù)，其可能的機(jī)制是通過(guò)提高TFF1、TFF2的含量，激活TFF/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增強(qiáng)PCNA的表達(dá)有關(guān)。

艾灸；胃黏膜增殖修復(fù)；三葉因子；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2；增殖細(xì)胞抗原

〔Abstract〕ObjectiveToobservetheeffectsofmoxibustiononcontentsofserumtrefoilfactor（TFF1，TFF2），andgastricmucosaextracellularsignal-regulatedkinase1/2（ERK1/2）andproliferatingcellnuclearantigen（PCNA）in spleendeficiencygastriculcerratmodels.Toexplorethepossiblemechanismofmoxibustioninpromotingmucosal proliferation repair.Methods 10 rats were randomly selected from the 50 healthy SD rats，the other 40 rats were built into the spleen deficiency gastric ulcer models by the cold diarrhea down+anhydrous ethanol gavage methods.After modeling，the ratswererandomlydividedintothemodelgroup，Sijunzidecoctiongroup，moxibustiongroupandnonacupoint-moxibustion group，10 in each group.The serum contents of TFF1 and TFF2 were detected by ELISA，the expression of gastric mucosa p-ERK1/2 protein was measured with Western blot，and the expression of gastric mucosa PCNA was determined by immunohistochemical method.Results Moxibustion Zusanli and Zhongwan points can significantly improve contents of TFF1 and TFF2 in rats with injury gastric mucosa，increase the expression of gastric mucosa p-ERK1/2 protein and PCNA in rats with injury gastric mucosal（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Moxibustion can promote the proliferation and repair of injury gastric mucosal in spleen deficiency gastric ulcer rats.The mechanism may be related with increasing the contents of TFF1 and TFF2，activating TFF/ERK signal transduction pathway，and enhancing the expression of PCNA.

〔Keywords〕moxibustio；mucosalproliferationrepair；trefoilfactor；extracellularsignal-regulatedkinase1/2；cell proliferation antigen

胃黏膜損傷后增殖修復(fù)是由多因素介導(dǎo)，并相互影響而形成的一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系。三葉因子家族（trefoil factor，TFF）是一群主要由胃腸道黏液細(xì)胞分泌的對(duì)胃黏膜修復(fù)與重建有重要作用的小分子多肽［1］，已有文獻(xiàn)證實(shí)，在大鼠胃潰瘍的愈合過(guò)程中，ERK1/2活性顯著增強(qiáng)，而阻斷這一通路胃潰瘍的愈合過(guò)程明顯延緩［2］。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）合成水平反映了細(xì)胞增殖率及DNA合成率，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的直接量度指標(biāo)［3］。大量臨床報(bào)道證實(shí)艾灸對(duì)脾虛胃潰瘍有很好的療效［4-5］，其機(jī)制可能是通過(guò)提高TFF1、TFF2、ERK1/2、PCNA的表達(dá)，促進(jìn)胃黏膜損傷后的增值修復(fù)，以起到對(duì)胃潰瘍的治療作用［6-7］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)TFF/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的TFF、ERK1/2以及他們之間相關(guān)性的研究，以期部分探討艾灸對(duì)脾虛胃潰瘍大鼠胃黏膜細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Sprague-Dawleyy大鼠50只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半，SPF級(jí)，飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50%～70%，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：4304701041）。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于本實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑和儀器

1.2.1主要試劑及藥品SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、TFF1、TFF2酶免試劑盒、兔抗大鼠ERK1/2抗體、兔抗大鼠PCNA多克隆抗體均由長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)維泰實(shí)驗(yàn)用玻璃儀器經(jīng)營(yíng)部提供。四君子湯：由人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草（由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供）組成，按照9∶9∶9∶6比例配制，配成含生藥0.233 g/mL的四君子湯藥液；太極灸：直徑7 mm，高1 cm（河南南陽(yáng)市臥龍漢醫(yī)艾絨廠）。

1.2.2主要儀器820型薄片切片機(jī)（美國(guó)型AO公司）；TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙科威實(shí)業(yè)有限公司）；QL-901旋渦混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；DYY-6C電泳儀、DYCZ-24EN電泳槽、DYCz-4OA轉(zhuǎn)膜儀（北京六一）；a85-1x磁力攪拌器（金壇榮華儀器有限公司）。

1.3動(dòng)物分組及造模

50只大鼠隨機(jī)抽取10只為空白組。其余40只大鼠用200%的大黃濃縮液4℃灌胃，1 mL/100 g體質(zhì)量，每天2次，連續(xù)14 d，建立脾虛模型。大黃灌胃第14天，大鼠禁食24 h后，用灌胃針將無(wú)水乙醇注入大鼠胃腔內(nèi)，注入劑量為0.6 mL/100 g體質(zhì)量，建立胃潰瘍模型。模型成立后，再按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、艾灸穴位組（下稱艾灸組）、艾灸非穴位組（下稱非穴組）和四君子湯組，每組10只。1.4施治方法

1.4.1穴位定位動(dòng)物穴位定位法及擬人對(duì)照法定位參照林文注主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［8］，以胸鎖聯(lián)合和恥骨聯(lián)合連線下1/4與上3/4交點(diǎn)為肚臍。足三里：膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處；中脘：臍與胸骨劍突連線中點(diǎn)，約臍上20 mm處；脾俞：第十二胸椎下，旁開5 mm；胃俞：第十三胸椎下，旁開5 mm。足三里非穴對(duì)照點(diǎn)：膝關(guān)節(jié)后內(nèi)側(cè)，在脛骨內(nèi)側(cè)髁約5 mm處；中脘非穴對(duì)照點(diǎn)：中脘旁開1 cm；脾俞、胃俞非穴對(duì)照點(diǎn)：與脾俞、胃俞平行后正中線旁開1 cm。

1.4.2實(shí)驗(yàn)步驟除空白組外，大鼠造模結(jié)束后給予大黃濃縮液致虛，同時(shí)各組給予相應(yīng)的處理：所有大鼠捆縛于鼠板，空白組、模型組、四君子湯大鼠不予施灸；艾灸組、非穴組分別大鼠捆縛固定于鼠板上施灸，將艾柱黏于穴位或?qū)φ拯c(diǎn)施灸，選穴如下：（1）艾灸組：①足三里（雙）、中脘；②脾俞（雙）、胃俞（雙）。（2）非穴組：①足三里對(duì)照點(diǎn)（雙）、中脘對(duì)照點(diǎn)；②脾俞對(duì)照點(diǎn)（雙）、胃俞對(duì)照點(diǎn)（雙）。兩組每天取1組穴位施灸5壯（約30 min，①、②交替進(jìn)行），連續(xù)8 d。四君子湯組每天每只予以四君子湯8 mL/kg灌胃，其余組則分別灌服同等換算體表面積的生理鹽水，每天2次，連續(xù)8 d。

1.5取材及檢測(cè)方法

實(shí)驗(yàn)治療結(jié)束后，用20%烏拉坦以10 mL/kg腹腔注射麻醉，剖腹后，將胃的幽門部和賁門部用止血鉗結(jié)扎，快速用一次性負(fù)壓采血針從腹主動(dòng)脈采血5 mL置于37℃恒溫水浴箱30 min，4℃低溫離心，3 000 r/min，離心15 min，離心后取上清液置于-20℃冰箱保存，釆用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)血清TFF1、TFF2的含量。在兩結(jié)扎線的兩端切斷食道及十二指腸，摘下全胃。沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗，取胃組織損傷明顯處一小塊（5 mm×10 mm），然后放入40 g/L多聚甲醛中4℃固定24 h后，用免疫組化法測(cè)胃組織中PCNA的表達(dá)。另取一小塊（10 mm×10 mm）入液氮冷凍存于-80°冰箱保存，用Western Blot法檢測(cè)胃組織中磷酸化ERK1/2的蛋白表達(dá)。其中TFF1、TFF2、p-ERK1/2由長(zhǎng)沙高新開發(fā)區(qū)原點(diǎn)生物技術(shù)部檢測(cè)，PCNA由湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)組胚實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，詳細(xì)步驟均按試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格操作。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理。所有測(cè)量數(shù)據(jù)用“x±s”表示，資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)：符合正態(tài)分布者，多組計(jì)量資料采用單因素方差分析，方差齊者用LSD和SNK法，方差不齊者用Tamhane’s T2或Dunnett’s T3法；不符合正態(tài)分布者采用多組資料的秩和檢驗(yàn)（H檢驗(yàn)）。

2　結(jié)果

2.1艾灸對(duì)脾虛胃潰瘍大鼠TFF1、TFF2的影響

與空白組相比，其他各組大鼠血清TFF1、TFF2明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，四君子湯組、非穴組、艾灸組大鼠血清TFF1、TFF2明顯提高（P＜0.01）；與非穴組相比，艾灸組、四君子湯組大鼠血清TFF1、TFF2明顯升高（P＜0.01）；艾灸組與四君子湯組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1　各組大鼠TFF1和TFF2的比較（±s，n=10）

表1　各組大鼠TFF1和TFF2的比較（±s，n=10）

注：與空白組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與艾灸非穴組比較☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。下表同。

組別空白組模型組四君子湯組非穴組艾灸組TFF1（ng/mL）3.52±0.19 4.20±0.24△△7.67±0.20△△▲▲☆☆4.74±0.14△△▲▲7.80±0.22△△▲▲☆☆TFF2（pg/mL）52.89±2.14 67.27±2.71△△129.50±3.03△△▲▲☆☆78.94±2.97△△▲▲131.10±4.37△△▲▲☆☆

2.2艾灸對(duì)脾虛胃潰瘍大鼠ERK1/2及PCNA的影響

與空白組相比，其他各組大鼠胃黏膜ERK1/2 及PCNA含量提高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，四君子湯組、非穴組、艾灸組大鼠胃黏膜ERK1/2 及PCNA含量升高（P＜0.05或P＜0.01）；而與非穴組相比，艾灸組、四君子湯組大鼠胃黏膜ERK1/2及PCNA含量明顯提高（P＜0.05或P＜0.01）；艾灸組與四君子湯組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2及圖1～2（圖2見封三彩圖）。

表2　各組大鼠ERK1/2及PCNA的比較（±s，n=10）

表2　各組大鼠ERK1/2及PCNA的比較（±s，n=10）

組別空白組模型組四君子湯組非穴組艾灸組ERK1/2 0.383±0.073 0.444±0.063△0.656±0.111△△▲▲☆☆0.539±0.079△△▲▲0.698±0.121△△▲▲☆☆PCNA（平均光密度）0.160±0.041 0.222±0.037△0.355±0.064△△▲▲☆0.283±0.091△△▲0.365±0.083△△▲▲☆☆

圖1　各組大鼠p-ERK1/2蛋白磷酸化水平凝膠電泳圖

3　討論

TFF1主要在胃體及胃竇黏膜上皮表面細(xì)胞分泌表達(dá)；研究發(fā)現(xiàn)TFF1與細(xì)胞遷移、增殖、分化、血管形成等密切相關(guān)［9］。TFF2主要在胃體、胃竇和十二指腸下段特異性表達(dá)，張紹榮等［10］利用PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)hTFF2能促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性大鼠胃潰瘍黏膜上皮細(xì)胞增殖和潰瘍底部血管生成。ERK是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家庭的重要成員之一，有ERK1和ERK2兩種亞型，磷酸化的ERK是ERK的活性形式，能激活轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂及細(xì)胞間的功能同步等多種生理過(guò)程，對(duì)于細(xì)胞周期的運(yùn)行和基因表達(dá)具有重要的調(diào)控作用［11］。劉曉玲等［12］研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣湯通過(guò)上調(diào)TFF1、EGFR的表達(dá)來(lái)激活MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖或分化。國(guó)外新近研究發(fā)現(xiàn)，TFF2能通過(guò)EGFR/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)刺激膽管癌細(xì)胞的增殖［13］。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，PCNA的出現(xiàn)與細(xì)胞增殖周期密切相關(guān)，G1期PCNA逐漸增多，S期達(dá)高峰，它能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和狀態(tài)［14］。胃黏膜PCNA的表達(dá)能較準(zhǔn)確的反映胃黏膜損傷和修復(fù)過(guò)程中胃黏膜細(xì)胞的增殖活性。在國(guó)外有學(xué)者揭示了TFF與PCNA之間的緊密的聯(lián)系，Amaguchi H等［15］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠胃黏膜損傷后胃黏膜肌層的TFF2陽(yáng)性細(xì)胞會(huì)伴有細(xì)胞核增殖抗原（PCNA）陽(yáng)性。這與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致：大鼠胃黏膜損傷后，其胃黏膜PCNA上升，且上升趨勢(shì)與TFF1、TFF2及ERK1/2一致，說(shuō)明大鼠胃黏膜損傷后有一定的自行愈合修復(fù)功能，并啟動(dòng)了細(xì)胞增殖活動(dòng)。

研究發(fā)現(xiàn)四君子湯對(duì)胃潰瘍模型大鼠有顯著的防治作用，其能加強(qiáng)胃黏膜損傷大鼠后的黏膜增值修復(fù)已從表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）等途徑被證實(shí)［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)四君子湯與艾灸均能明顯上調(diào)TFF1、TFF2、ERK1/2及PCNA的表達(dá)水平，提示艾灸、四君子湯對(duì)胃黏膜損傷大鼠后胃黏膜增殖修復(fù)有較好的調(diào)控：?jiǎn)?dòng)黏膜修復(fù)機(jī)制，增強(qiáng)ERK1/2蛋白磷酸化，從而使胃黏膜PCNA的含量上升，進(jìn)而到達(dá)加強(qiáng)黏膜損傷后增殖修復(fù)的效應(yīng)。且艾灸穴位的綜合效應(yīng)優(yōu)于艾灸非穴對(duì)照點(diǎn)，表明足三里、中脘等穴具有一定的腧穴特異性。而艾灸穴位的綜合效應(yīng)與四君子湯雖無(wú)明顯差異，但艾灸組TFF1、TFF2、ERK1/2及PCNA表達(dá)的趨勢(shì)均略高于四君子湯組。臨床中艾灸能避免四君子湯煎煮的繁瑣，方便易行，且艾灸的溫?zé)嵝?yīng)能給病人帶來(lái)舒適感，故值得臨床大力推廣。

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（本文編輯匡靜之）

Effect of Moxibustion on Serum TFF and Gastric Mucosa ERK1/2 and PCNA in Gastric Ulcer Model Rats with Spleen Deficiency Symptom

LI Tielang1，SU Yanmei2，QI Fang1，NI Wei1，ZHANG Hong1*，ZHANG Yuchen3，GUO Hua1
（1.College of Acumox and Tuina，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2.Department of Rehabilitation，Loudi Central Hospital，Loudi，Hunan 417000，China；3.Department of Pain and Physiotherapy，Hunan Hospital of TCM，Changsha，Hunan 410005）

R245.81

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.02.017.049.04

2014-11-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173327）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13JJ6060）；湖南省教育廳創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目（11K047）。

李鐵浪，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：針灸治病機(jī)制的研究。

*張泓，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zh5381271@sina.com。