治療痛風性關節(jié)炎的四妙散活性成分靶基因篩選及生物學功能分析

章曉云，顧兵，李華南，陳鋒，甘斌，李松

1江西中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，南昌330004；2廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院骨科；3江西科技師范大學藥學院

痛風性關節(jié)炎（GA）是臨床上常見的一種治療復雜，容易復發(fā)，遷延難愈的炎性疾?。?］。臨床以秋水仙堿、非甾體類抗炎藥和糖皮質激素等藥物治療為主，但存在不良反應多、停藥易復發(fā)、遠期療效有限等弊端［2］。中醫(yī)藥在GA的防治中有確切的療效，且不良反應小，復發(fā)率低，且價格低廉。四妙散具有清熱利濕、舒筋活絡之功效，中醫(yī)臨床一直將其作為治療GA的首選方?，F(xiàn)代藥理研究［3］表明，四妙散可通過降低血尿酸水平及炎癥因子釋放改善患者的臨床癥狀。盡管四妙散已得到現(xiàn)代中醫(yī)臨床的認可，但多數文獻仍然以療效報道和化學成分分析為主，鮮有四妙散藥效物質基礎及分子作用機制的研究報道。大量文獻［4］證實，運用網絡藥理學及分子對接技術可成功預測中藥復方中的活性成分、作用靶基因及作用機制，具有節(jié)約藥物開發(fā)成本的獨到優(yōu)勢。本研究遵循網絡藥理學的理論和方法，借助分子對接技術篩選治療GA的四妙散活性成分靶基因，并分析作用基因的生物學功能，旨在為開展以四妙散為基礎方加減的中藥藥理學研究尋找理論依據。

1 材料與方法

1.1 四妙散活性成分、調控靶基因篩選 依托中藥系統(tǒng)藥理學數據庫（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），輸入組成四妙散的四味中藥名蒼術、黃柏、牛膝、薏苡仁，搜索得到各自的成分；根據ADME參數設置口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，得到符合條件的活性成分，確定四妙散活性成分的集合。再從TCMSP數據庫中收集活性成分調控的靶基因，并通過UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org）查詢各靶基因對應的靶基因名。將得到的靶基因名進行合并及刪除重復項后，所得結果即為四妙散活性成分所調控的靶基因。

1.2 GA發(fā)病的相關靶基因篩選 以“痛風性關節(jié)炎”英文名“Gouty arthritis”為關鍵詞，在Gene Cards（https：//www.genecards.org）、OMIM（https：//omim.org/）和DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）數據庫中查找GA發(fā)病的相關靶基因，并參考Uniprot數據庫統(tǒng)一靶基因命名。整合3個數據庫的查找結果并刪除重復項后，所得靶基因即為GA發(fā)病過程已知靶基因。

1.3 治療GA的四妙散靶基因的預測 運用Venny平臺（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）將四妙散活性成分調控靶基因與GA相關靶基因進行映射取交集，得到四妙散治療GA的作用靶基因。

1.4“單味藥—活性成分—作用靶基因”網絡構建 先分別建立每種單味藥的活性成分、活性成分作用靶基因間的相互關系，再導入到Cyto?scape3.7.2軟件中，利用該軟件的“merge”工具將4種單味藥的網絡進行合并，構建四妙散治療GA的“單味藥—活性成分—作用靶基因”網絡，并根據度值大小篩選出關鍵活性成分。

1.5 蛋白相互作用（PPI）網絡構建及關鍵靶基因篩選 為進一步研究四妙散治療GA的作用機制，將作用靶基因導入STRING數據庫（https：//string-db.org/）中，限定研究物種為人類，并設置連接評分>0.4，其他默認設置，獲得蛋白互作關系。將所得結果導入Cytoscape3.7.2軟件中，利用“Bisogenet”和“CytoN?CA”插件，設置DC>61和BC>200，篩選富集程度高的蛋白互作關系，構建PPI核心網絡，并根據拓撲參數，篩選出四妙散作用的關鍵靶基因。

1.6 基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將作用靶基因導入DAVID數據庫（http：//david.ncifcrf.gov.），物種限定為人類，進行GO功能富集分析，研究四妙散治療GA的生物功能；進行KEGG通路富集分析，研究四妙散治療GA的信號通路。保存結果以P<0.05為標準篩選其生物過程及信號通路，分析四妙散可能的分子作用機制。

1.7 關鍵活性成分與關鍵靶基因分子對接驗證 取四妙散關鍵活性成分和關鍵靶基因，用AutoDock1.5.6軟件進行分子對接實驗，驗證其相互作用活性。利用ChemOffice軟件制作四妙散關鍵活性成分的3D結構，再從PDB數據庫下載關鍵靶基因的3D結構，利用PyMOL軟件對蛋白質進行去水、去磷酸根等操作，利用Auto Dock1.5.6軟件將化合物及核心蛋白基因pdb格式轉為pdbqt格式并尋找活性口袋，最后運行Vina進行對接。根據分子與靶基因的結合能評估兩者的結合活性，選取結合能≤-5.0 kJ/mol的活性成分作為四妙散治療GA靶基因的篩選依據，以評價網絡分析預測的可靠性。

2 結果

2.1 四妙散活性成分及調控靶基因篩選結果 通過TCMSP數據庫檢索共獲得四妙散化學成分528個，其中蒼術64個、黃柏185個、牛膝231個、薏苡仁48個，以OB≥30%和DL≥0.18為條件進行篩選，得到蒼術活性成分9個，黃柏活性成分37個，牛膝活性成分20個，薏苡仁活性成分9個，去重后復方中共獲得65個活性成分。再利用TCMSP和Uniprot數據庫查詢65個活性成分，共得到197個活性成分靶基因。

2.2 GA發(fā)病的相關靶基因合集 Gene Cards、OMIM和DrugBank數據庫中分別獲得GA相關靶基因179個、13個、129個，并參考Uniprot數據庫統(tǒng)一靶基因命名，合并后刪除重復項，共得到211個基因名作為本研究的疾病靶基因數據庫。

2.3 治療GA的四妙散靶基因預測結果 將四妙散的197活性成分靶基因和GA的211個相關基因靶基因上傳至Venny平臺進行映射取交集，共得到23個四妙散治療GA的作用靶基因。

2.4“單味藥—活性成分—作用靶基因”網絡及關鍵活性成分篩選結果 四妙散“單味藥—活性成分—作用靶基因”網絡共包括47個節(jié)點（25個活性成分和22個作用靶基因）和93條邊，該網絡中度值排名前5位的活性成分分別是槲皮黃素、吳茱萸次堿、漢黃芩素、山柰酚、黃芩素，分別能與18、9、8、6、4個靶基因連接，為該網絡的關鍵活性成分，對治療GA具有重要的意義。

2.5 PPI網絡構建及關鍵靶基因篩選結果 利用Cytoscape軟件中的“Bisogenet”和“CytoNCA”插件構建PPI網絡，并根據度值篩選出排名前5的蛋白基因為泛素連接酶CUL7蛋白（CUL7）、β-微管蛋白（TUBB）、生長因子受體結合蛋白2（GRB2）、核因子κB1（NF-κB1）、重組人泛素結合酶E2I（UBE2I）。這些蛋白基因在整個網絡中發(fā)揮著關鍵的作用，在四妙散治療GA過程中具有重要地位，可能是四妙散治療GA的關鍵靶基因。

2.6 GO功能富集與KEGGG通路富集分析結果 利用DAVID數據庫對作用靶基因進行GO功能富集分析，共確定了936個條目，其中888條代表生物過程，主要涉及脂多糖的細胞反應、對細菌來源分子的反應、細胞對生物刺激的反應、氧化應激反應、炎癥反應的調節(jié)、對活性氧的反應等；15條代表細胞成分，主要涉及質膜穴樣內陷、質膜筏、膜反應器等；33條代表分子功能，主要涉及血紅素結合、四吡咯結合、絲氨酸型內肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性、磷酸酶結合、絲氨酸水解酶活性、銨離子結合、MAP激酶活性、細胞因子活性、激活轉錄因子結合等。GO分析結果表明生物過程、細胞成分及分子功能與GA的發(fā)生發(fā)展過程密切相關。KEGG通路富集分析共得到82條通路，結果表明四妙散治療GA可能的作用機制主要通過調控IL-17通路、TNF通路、AGE-RAGE通路、NOD樣受體通路、C型凝集素受體通路、NF-κB通路、Toll樣受體通路等。

2.7 關鍵活性成分與關鍵靶基因分子對接結果 將關鍵活性成分槲皮黃素、吳茱萸次堿、漢黃芩素、山柰酚、黃芩素分別與關鍵靶基因CUL7、TUBB、GRB2、NF-κB1、UBE2I進行分子對接驗證，結果顯示四妙散的關鍵活性成分與關鍵靶基因對接的親和力遠小于-5.0 kJ/mol，由此表明預測的四妙散關鍵活性成分與治療GA的關鍵作用靶基因具有較好的結合活性，證明該研究的預測較為可靠。分子對接實驗結果見表1。

表1 關鍵活性成分與關鍵靶基因分子對接驗證結果

3 討論

GA是最常見的炎癥性關節(jié)炎，在全球范圍內的患病率為2%～4%，主要發(fā)生在40歲以上的男性中，尤其是那些患有肥胖、高血壓、冠狀動脈疾病、糖尿病或代謝疾病等潛在合并癥的患者［5］。歷代醫(yī)家常對四妙散進行加減化裁以治療GA，且臨床療效顯著，其首見于清·張秉成《成方便讀》，方由黃柏、蒼術、牛膝、薏苡仁4味中藥組成。方中蒼術與黃柏配伍以達清熱燥濕之功，使?jié)袢ザ鵁岢?；牛膝補肝腎、強筋健骨，引蒼術、黃柏入下焦而清熱祛濕；外加能獨入陽明之薏苡仁，以淡滲利濕，清熱除痹；諸藥相合，共奏清熱利濕、舒筋壯骨之功，以治療下焦?jié)駸嶂达L［6］。四妙散治療效果的具體作用機制尚未明確，因此本研究借助網絡藥理學和分子對接的技術，從微觀角度分析四妙散治療GA的分子機制，以期為下一步研究GA的現(xiàn)代經驗方的基礎藥理學指明方向。

本研究通過篩選初步獲得四妙散中共65個潛在活性成分，作用于23個核心靶基因對GA發(fā)揮治療效果，其中槲皮黃素、吳茱萸次堿、漢黃芩素、山柰酚、黃芩素能匹配較多的靶基因，可能是四妙散治療GA的關鍵有效成分。研究［7］表明，槲皮黃素可抑制尿酸鈉鹽誘導的機械性痛感、白細胞聚集、TNFα和IL-1β產生及超氧陰離子產生，從而達到鎮(zhèn)痛和抗炎的作用。而吳茱萸次堿能抑制炎癥相關通路的表達以降低血清中IL-6、TNF-α等炎癥因子的水平［8］，從而改善炎癥情況。漢黃芩素及山柰酚可通過調節(jié)腸道菌群及微生物的新陳代謝來改善關節(jié)炎的癥狀，可用于治療許多急、慢性炎癥引起的疾?。?］。PPI網絡結果顯示，四妙散治療GA的核心靶基因主要有CUL7、TUBB、GRB2、NF-κB1和UBE2I，其中GRB2與NF-κB1可通過調節(jié)炎癥細胞因子水平減少局部組織的炎性浸潤，減輕GA的炎癥反應［10-11］，CUL7與UBE2I可以通過調節(jié)細胞凋亡延緩GA的關節(jié)退變以減輕關節(jié)疼痛［12-13］，而TUBB參與多種細胞過程，如細胞信號傳導、細胞運動、細胞分裂等［14］。分子對接結果顯示，關鍵靶基因與關鍵活性成分之間存在良好的結合活性，證明該研究的預測較為可靠。因此，筆者認為四妙散中各有效成分不僅對GA具有不同程度的抗炎止痛作用，而且各有效成分之間還存在緊密的協(xié)同作用，協(xié)同調控的靶基因也在GA的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著不同作用，這可能是四妙散治療GA的關鍵。

GO分析結果顯示，四妙散參與對脂多糖的反應，對細菌來源分子的反應，對活性氧的反應及細胞對生物刺激的反應、氧化應激反應、炎癥反應的調節(jié)，這些過程均與GA的形成與發(fā)展有著密切聯(lián)系。KEGG通路富集結果顯示，四妙散治療GA的信號通路主要包括調控IL?17通路、TNF通路、AGE-RAGE通路、NOD樣受體通路、C型凝集素受體通路、NF-κB通路、Toll樣受體通路等。研究［15］證實，IL-17通路在GA的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關鍵作用。TNF通路介導嗜酸性粒細胞、淋巴細胞在炎癥部位聚集，從而產生IL-1、IL-6等炎癥因子，導致機體發(fā)生持續(xù)的炎癥反應［16］。AGE-RAGE通路主要涉及MAPK磷酸化水平的上調，TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子表達的增多及NF-κB因子活化的增多［17］，與炎癥的發(fā)生有著密切聯(lián)系。NOD樣受體和Toll樣受體在體內水平與IL-1、TNF-α等炎癥細胞因子呈正相關，兩者參與的信號通路與炎性疾病有著緊密的聯(lián)系［18-19］。C型凝集素受體C型凝集素受體通路在機體被感染時激活并參與炎癥反應，在炎性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮著關鍵作用［20］，并能通過激活NF-κB通路，誘發(fā)炎癥反應釋放IL-12、IL-23、IL-1β［21］。因此，四妙散可能調控機體免疫系統(tǒng)調控GA急性發(fā)作過程中產生的一系列關鍵分子，以促進炎癥自行消散，最終控制低濃度尿酸鈉鹽晶體長期刺激所觸發(fā)的慢性炎癥狀態(tài)。富集結果還顯示，網絡集群中還覆蓋了恰加斯病（美洲錐蟲?。?、人巨細胞病毒感染、百日咳、利什曼病、耶爾森菌感染、類風濕性關節(jié)炎、前列腺癌等信號通路，說明除了直接作用于上述主要信號通路，四妙散還可能通過體內多條代謝途徑的靶基因對GA患者發(fā)揮治療效果。多種多樣的相互作用關系提示，在臨床治療GA過程中，除了對關鍵通路進行干預，還要結合疾病病因，患者所處環(huán)境等進行多因素，多靶點干預，這與中醫(yī)藥辨證論治，治病求本的特點相符?？傊?，四妙散各有效成分與其作用的靶基因之間不僅存在密切的協(xié)同關系、良好的結合活性，而且從側面反映出經方治療疾病具有多成分、多靶點、多信號通路的特色。預測到參與調控免疫—炎癥反應、軟骨細胞增殖分化與凋亡、機體抗氧化應激反應的分子機制為后續(xù)開展GA現(xiàn)代經驗方的基礎藥理學研究提供理論指導。