構(gòu)建M23－AQP4穩(wěn)定表達(dá)的HEK293細(xì)胞應(yīng)用于血清抗AQP4抗體檢測(cè)的研究

吳曉牧 符青青 劉詩(shī)英 項(xiàng)正兵 熊英瓊 張昆南

視神經(jīng)脊髓炎（NMO）是主要累及視神經(jīng)和脊髓的嚴(yán)重自身免疫性脫髓鞘性疾病。2004年Lennon等［1］首次在NMO患者血清中發(fā)現(xiàn)NMOIgG抗體，即抗AQP4抗體［2］，從而為認(rèn)識(shí)NMO為有別于MS的獨(dú)立性疾病提供了依據(jù)。目前已將血清抗AQP4抗體作為支持條件納入NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。血清抗AQP4抗體的檢測(cè)方法主要有鼠腦間接免疫熒光法（IIF）和細(xì)胞間接免疫熒光法（CBA），以CBA 敏感性較高［4－5］，尤其以表達(dá) M23－AQP4亞型的細(xì)胞作為底物的CBA，其抗AQP4抗體檢出率可高達(dá)97%［6］。由于CBA技術(shù)要求高且耗時(shí)，難以推廣使用。本文擬構(gòu)建 M23－AQP4穩(wěn)定的HEK293細(xì)胞（HEK293－M23－AQP4）用于血清抗AQP4抗體的檢測(cè)，并探討本研究方法檢測(cè)血清抗AQP4抗體對(duì)NMO的診斷敏感性和臨床實(shí)用性。

1.1 觀察對(duì)象 收集2012－04－2014－04作者醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的52例脫髓鞘性疾病患者，其中NMO符合 Wingerchuck診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，MS符合McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)，其他脫髓鞘疾病均為結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像、腦脊液、肌電圖等檢查確診病例。其中NMO 6例、多發(fā)性硬化（MS）16例、其他脫髓鞘疾病患者30例〔包括視神經(jīng)炎6例、脊髓炎14例、吉蘭－巴雷綜合征9例、急性播散性腦脊髓炎1例〕。以同期神經(jīng)內(nèi)科住院的10例非脫髓鞘性疾病患者（腦梗死3例、腦出血3例、重癥肌無力2例，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染2例）為對(duì)照。標(biāo)本采集均征得患者同意。

1.2 主要試劑 HEK293細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫(kù)），pEGFP－N1－M23－AQP4質(zhì)粒及pEGFP－N1質(zhì)粒30%甘油菌（Invitrogen公司），無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取 試 劑 〔Endo－free Plasmid Mini Kit Ⅱ （50），OMEGA公司〕，磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑、正常山羊血清工作液（碧云天生物技術(shù)公司），DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司），胎牛血清、胰酶（Transgen公司），G418、7～15萬(wàn)單位多聚賴氨酸、4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）多聚甲醛（Solarbio公司），兔源抗人AQP4多克隆抗體、Cy3標(biāo)記的羊抗人二抗（Abcam公司），TRITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（EarthOx公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：用促凝管采集患者清晨空腹靜脈血3mL，2000r／min離心10min，收集血清，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 HEK293－M23－AQP4的構(gòu)建：接種含有pEGFP－N1－M－23AQP4質(zhì)粒的甘油菌于含硫酸卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基擴(kuò)增并純化質(zhì)粒，用Endo－free Plasmid Mini KitⅡ（50）抽提質(zhì)粒（按說明書操作）。構(gòu)建方法參考文獻(xiàn)［8］，將HEK293細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%覆蓋孔底時(shí)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染pEGFPN1－M23－AQP4質(zhì)粒（按說明書操作），轉(zhuǎn)染24h后，在熒光顯微鏡下觀察，藍(lán)光激發(fā)下觀察到綠色熒光表明轉(zhuǎn)染成功，將轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞按1∶10傳代，用含G418（終濃度400μg／mL）培養(yǎng)基篩選，每3d更換G418篩選培養(yǎng)基，2周后挑選單克隆，用含G418（200μg／mL）培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，獲得綠色熒光較強(qiáng)且持續(xù)的細(xì)胞。用CBA法進(jìn)行鑒定，將獲得的細(xì)胞接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（1×105個(gè)／孔），置37℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2培養(yǎng)24h，PBS浸洗2min×5次，4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）多聚甲醛固定30min，PBS浸洗2min×5次，設(shè)3個(gè)平行孔，正常山羊血清工作液（50μL／孔）室溫封閉1h，去除封閉液，兔源抗人AQP4多克隆抗體（1∶100稀釋，50μL／孔）4℃孵育過夜，PBS浸洗2min×5次，TRITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶200稀釋，50μL／孔）室溫孵育1h，PBS浸洗2min×5次，50%（體積分?jǐn)?shù)）甘油－0.5 mol／L pH 9.0～9.5碳酸鹽緩沖液封閉，熒光顯微鏡下觀察，藍(lán)光（420～490nm）激發(fā)下的綠色熒光區(qū)域，經(jīng)綠光（535～550nm）激發(fā)后觀察到紅色熒光則表明有 M23－AQP4 表 達(dá)，HEK293－M23－AQP4構(gòu)建成功。同樣的方法構(gòu)建 HEK293－pEGFP－N1細(xì)胞，熒光顯微鏡下藍(lán)光激發(fā)時(shí)出現(xiàn)持續(xù)可見綠色熒光表明構(gòu)建成功；采用CBA法進(jìn)行鑒定，若顯微鏡下觀察到紅色熒光則表明HEK293－pEGFP－N1細(xì)胞能與抗 AQP4抗體結(jié)合，若不能觀察到紅色熒光則表明HEK293－pEGFP－N1細(xì)胞不能與抗 AQP4抗體結(jié)合，作為HEK293－M23－AQP4細(xì)胞的對(duì)照。

1.3.3 4組患者的抗AQP4抗體檢測(cè)：HEK293－M23－AQP4接種并固定于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，PBS浸洗2min×5次，正常山羊血清工作液（50μL／孔）室溫封閉1h，去除封閉液，血清標(biāo)本（1∶50稀釋，50μL／孔，每個(gè)標(biāo)本設(shè)3個(gè)孔）4℃孵育過夜，PBS浸洗2min×5次，Cy3標(biāo)記的羊抗人二抗（1∶500稀釋，50μL／孔）室溫孵育1h，PBS浸洗2 min×5 次，50% （體積分?jǐn)?shù)）甘油－0.5mol／L pH9.0～9.5碳酸鹽緩沖液封閉，熒光顯微鏡下觀察，藍(lán)光激發(fā)下的綠色熒光區(qū)域，經(jīng)綠光激發(fā)后觀察到紅色熒光為陽(yáng)性，無紅色熒光為陰性。將檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的血清標(biāo)本用倍比稀釋法稀釋為1∶50～1∶1638400檢測(cè)抗AQP4抗體，以不能觀察到紅色熒光的最小稀釋比例的前一比例作為該標(biāo)本的抗AQP4抗體滴度。記錄并比較4組患者抗AQP4抗體陽(yáng)性率，計(jì)算抗AQP4抗體診斷NMO的敏感性和特異性。陽(yáng)性率＝抗體陽(yáng)性例數(shù)／相應(yīng)組中患者總例數(shù)；敏感性＝NMO組中抗體檢測(cè)陽(yáng)性例數(shù)／NMO組總例數(shù)×100%，特異性＝對(duì)照組陰性例數(shù)／對(duì)照組總例數(shù)×100%。

1.3.4 HEK293－M23－AQP4的穩(wěn)定性檢測(cè)：HEK293－M23－AQP4接種并固定于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將上述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板分別于室溫、4℃、－20℃下保存4周后作為底物，用1.3.3方法檢測(cè)經(jīng)首次檢測(cè)為陽(yáng)性的標(biāo)本及隨機(jī)選取的5例陰性標(biāo)本的抗AQP4抗體及滴度，比較各保存溫度下所測(cè)得的抗AQP4抗體陽(yáng)性率及其滴度與首次檢測(cè)結(jié)果的差異，以觀察HEK293－M23－AQP4的穩(wěn)定性。

1.3.5 抗AQP4抗體穩(wěn)定性檢測(cè)：上述經(jīng)首次檢測(cè)抗AQP4抗體為陽(yáng)性的標(biāo)本及隨機(jī)選取的5例陰性標(biāo)本反復(fù)3次凍融后分裝3份（10μL／Ep管），分別于室溫、4℃、－20℃下保存1周后檢測(cè)抗AQP4抗體及其滴度，比較各保存溫度下所測(cè)得的抗AQP4抗體陽(yáng)性率及其滴度與首次檢測(cè)結(jié)果的差異，以觀察血清抗AQP4抗體的穩(wěn)定性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，4組血清抗AQP4抗體陽(yáng)性率比較采用Fisher確切概率法，本研究中測(cè)得的血清抗AQP4抗體滴度經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化（Lg），采用Wilcoxon帶符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HEK293－M23－AQP4構(gòu)建 經(jīng) G418篩選獲得的細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可見藍(lán)光激發(fā)下所發(fā)出綠色熒光定位在細(xì)胞膜（圖1A），經(jīng)CBA法檢測(cè)顯示TRITC紅色熒光標(biāo)記主要在細(xì)胞膜區(qū)域（圖1B），表明 HEK293－M23－AQP4構(gòu)建成功，M23－AQP4主要表達(dá)在細(xì)胞膜。G418篩選獲得的HEK293－pEGFP－N1細(xì)胞持續(xù)表達(dá)綠色熒光，且綠色熒光充滿整個(gè)細(xì)胞（圖1D），CBA法未觀察到紅色熒光，顯示FRITC羊抗兔二抗未結(jié)合（圖1E），對(duì)照表明 HEK293－M23－AQP4細(xì)胞表達(dá)M23－AQP4。

2.2 4組患者抗AQP4抗體檢測(cè) 以HEK293－M23－AQP4細(xì)胞為底物的CBA法檢測(cè)顯示，與抗AQP4抗體陽(yáng)性血清標(biāo)本結(jié)合時(shí)，熒光顯微鏡下經(jīng)綠光激發(fā)可觀察到紅色熒光（圖2B），且紅色熒光與綠色熒光重疊（圖2C），而與抗AQP4抗體陰性血清標(biāo)本結(jié)合則不能觀察到紅色熒光（圖2E），以HEK293－pEGFP－N1細(xì)胞為底物亦不能觀察到紅色熒光（圖2F）。6例NMO患者血清抗AQP4抗體陽(yáng)性率為83.3%（5／6），顯著高于 MS患者陽(yáng)性率〔6.3%（1／16），P＝0.001〕、其他脫髓鞘性疾病〔3.3%（1／30），P＜0.001〕和非脫髓鞘性疾病患者〔0.0%（0／10），P＝0.001〕；MS患者和其他脫髓鞘性疾病的陽(yáng)性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.58）；非NMO脫髓鞘疾病患者和非脫髓鞘性疾病患者抗AQP4抗體陽(yáng)性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.82）；抗AQP4抗體診斷NMO的敏感性為83.3%（5／6），以 MS作為對(duì)照時(shí)，其特異性為93.8%（15／16），以其他脫髓鞘性疾病和非NMO的脫髓鞘疾病作為對(duì)照時(shí)，其特異性分別為96.7%（29／30）、95.6%（44／46），以非脫髓鞘疾病作對(duì)照時(shí)，其診斷NMO 特異性為100% （10／10）。陽(yáng)性標(biāo)本抗AQP4抗體滴度在1∶400～1∶120 400之間（表1）。

2.3 HEK293－M23－AQP4穩(wěn)定性檢測(cè) 7例陽(yáng)性標(biāo)本均仍為陽(yáng)性，5例陰性標(biāo)本也均仍為陰性，其陽(yáng)性結(jié)果未發(fā)生改變（P＝1.0）；7例陽(yáng)性標(biāo)本的抗AQP4抗體滴度與首次檢測(cè)結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（z＝0，P＝1.0，表2）。

2.4 抗AQP4抗體穩(wěn)定性檢測(cè) 血清標(biāo)本經(jīng)4℃和－20℃保存后抗AQP4抗體及其滴度與首次檢測(cè)結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝1.0，表1），室溫保存其抗AQP4抗體檢測(cè)結(jié)果與首次檢測(cè)結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝1.0），但抗AQP4抗體滴度顯著下降（z＝－2.64，P＜0.01）（表2）。

圖1 HEK293－M23－AQP4鑒定：M23－AQP4主要在細(xì)胞膜表達(dá)，抗AQP4抗體結(jié)合在細(xì)胞膜區(qū)域（CBA法，熒光顯微鏡，標(biāo)尺50 μm）

表1 不同保存條件下抗AQP4抗體陽(yáng)性標(biāo)本抗體滴度比較

圖2 抗AQP4抗體檢測(cè)（CBA法，熒光顯微鏡，標(biāo)尺50μm）

表2 不同溫度保存4周后的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本抗AQP4抗體滴度

3 討論

本研究采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑將M23－AQP4基因轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞，經(jīng)G418篩選、挑取單克隆擴(kuò)增并經(jīng)CBA法鑒定，最終成功構(gòu)建HEK293－M23－AQP4細(xì)胞，與國(guó)內(nèi)外使用較多的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑相比較，磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染時(shí)不需要去除培養(yǎng)液中的血清，能減輕轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的毒性，保持轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活性以利于后續(xù)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的篩選。此外，磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑價(jià)格低廉且易于獲得也是本研究方法的優(yōu)勢(shì)之一。

本研究采用以HEK293－M23－AQP4為底物的CBA法檢測(cè)血清抗AQP4抗體，結(jié)果顯示NMO患者血清抗 AQP4抗體陽(yáng)性率〔83.3%（5／6）〕顯著高于其他3組（6.3%、3.3%、0.0%），這與國(guó)內(nèi)外研究［4，6－7］結(jié)果一致，表明抗 AQP4抗體是 NMO的重要生物學(xué)標(biāo)記，有助于NMO與MS和脫髓鞘性疾病的鑒別診斷，也支持 Wingerchuk等［3］將抗AQP4抗體納入NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究方法檢測(cè)抗AQP4抗體對(duì)診斷NMO的敏感性高于Lennon等［1］IIF的73%和基于 M1－AQP4亞型 CBA的70%［6］，但低于基于 M23－AQP4亞型CBA法的97%［9］，特異性高于IIF 的91%［1］，出現(xiàn)這些差異的可能原因?yàn)椋海?）IIF存在種屬差異，鼠AQP4與人AQP4可能存在抗原表位差異［8］，進(jìn)而影響抗原抗體反應(yīng)，降低了檢測(cè)敏感性，本研究采用人M23－AQP4不存在種屬差異的影響；（2）IIF采用鼠腦組織作為底物，由于存在組織AQP4表達(dá)量的差異以及AQP4抗原暴露程度的差異，組織的選取和處理對(duì)檢測(cè)敏感性造成影響，本研究以穩(wěn)定表達(dá)M23－AQP4的細(xì)胞為底物，AQP4表達(dá)量充足；（3）研究表明，主要由 M23－AQP4形成的正交陣列顆粒（OAPs）是抗AQP4抗體的主要識(shí)別靶點(diǎn)［6］，這可能是本研究敏感性高于M1－AQP4亞型CBA（70%）的原因之一；（4）樣本量小可能是造成本研究敏感性低于同樣基于M23－AQP4檢測(cè)方法（97%）的原因；（5）IIF由于底物組織存在 AQP4之外的其他抗原，可造成抗AQP4抗體與組織的非特異性結(jié)合，從而降低特異性，本研究采用特異性表達(dá)M23－AQP4的細(xì)胞為底物，可減少非特異性結(jié)合，提高特異性。

本研究經(jīng)4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）多聚甲醛固定HEK293－M23－AQP4的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板于室溫、4℃和－20℃保存4周后檢測(cè)血清抗AQP4抗體，結(jié)果顯示抗體陽(yáng)性率和滴度與首次檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明經(jīng)4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）多聚甲醛固定HEK293－M23－AQP4穩(wěn)定性好，可以保存?zhèn)溆?，這意味著本研究方法可不需要臨時(shí)培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染以制備AQP4抗原表達(dá)細(xì)胞，可簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟、顯著縮短檢測(cè)耗時(shí)、降低對(duì)檢測(cè)技術(shù)的要求，為不具備細(xì)胞培養(yǎng)和熒光顯微鏡等技術(shù)設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)血清抗AQP4抗體提供可能。此外，反復(fù)凍融3次的血清標(biāo)本置于室溫、4℃和－20℃保存1周后用于檢測(cè)血清抗AQP4抗體，結(jié)果顯示陽(yáng)性率以及4℃以下保存標(biāo)本的抗體滴度與首次檢測(cè)結(jié)果無差異，但室溫保存的標(biāo)本抗體滴度顯著低于首次檢測(cè)（P＜0.01），表明室溫會(huì)加速抗AQP4抗體降解，延長(zhǎng)保存時(shí)間可能會(huì)影響檢測(cè)陽(yáng)性率。反復(fù)凍融和4℃以下保存不影響檢測(cè)結(jié)果，抗AQP4抗體穩(wěn)定性較好，這意味著本研究方法對(duì)送檢標(biāo)本質(zhì)量的要求較低，使得跨實(shí)驗(yàn)室、地區(qū)檢測(cè)成為可能，為抗AQP4抗體檢測(cè)的臨床推廣提供可能。

綜上，本研究結(jié)果顯示，以 HEK293－M23－AQP4為底物的CBA法檢測(cè)抗AQP4抗體對(duì)診斷NMO的敏感性、特異性較高，且簡(jiǎn)便易行，有利于臨床用于NMO的診斷和鑒別診斷。由于本研究樣本量小，標(biāo)本保存時(shí)間相對(duì)較短，今后研究將增加樣本量，延長(zhǎng)標(biāo)本保存時(shí)間，探索更加合適的保存條件進(jìn)一步驗(yàn)證，以便更好地解決臨床脫髓鞘性疾病診斷和鑒別困難的難題。

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