海人酸致癇大鼠腦內白蛋白、S100B及GFAP動態(tài)表達的研究

覃維含 吳原 陳鎮(zhèn) 劉夕霞 黃逸青

既往研究表明，癲癇發(fā)作可導致血－腦脊液屏障功能紊亂及結構破壞，對白蛋白通透性增加［1］。腦組織中較高水平白蛋白可激活星形膠質細胞，使其細胞內S100B和膠質纖維酸性蛋白（GFAP）表達水平改變，且腦細胞損傷時，腦脊液及血清中S100B水平亦會增高［2］。S100B在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）炎性反應中起啟動和維持作用。GFAP表達量與血－腦脊液屏障的形成密切相關，GFAP缺乏可導致血－腦脊液屏障形成缺陷［3］。本研究采用ELISA及免疫組化染色方法檢測海人酸（kainic acid，KA）顳葉癲癇模型大鼠腦脊液白蛋白、S100B及腦組織內白蛋白、S100B及GFAP蛋白質表達的變化規(guī)律，為探討顳葉癲癇中血－腦脊液屏障的破壞及白蛋白、S100B和GFAP與顳葉癲癇的關系積累資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級健康雄性SD大鼠〔實驗動物的使用許可證為：SCXK（桂）2009－0002〕75只，體質量（250±15）g，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.1.2 主要試劑：白蛋白 ELISA 試劑盒（CSBE14410r，武漢華美生物工程有限公司），S100B蛋白ELISA試劑盒（CK－E30417R，蘇州卡爾文生物科技有限公司），白蛋白及S100B蛋白免疫組化一抗（分別為ab106582、ab52642，英國 Abcam 公司），GFAP一抗（BA0056，武漢博士德生物工程有限公司），免疫組化二抗（sp9000，北京中衫金橋生物技術有限公司）。奧林巴斯光學顯微鏡（Olympus Corporation，日本）。

1.2 方法 模型組于側腦室注射KA后6h、24 h、3d和7d，生理鹽水對照組（對照組）注射等量生理鹽水后6h，對動物進行觀察取材。動物按上述時間點隨機分為5組，每組各15只。

1.2.1 癲癇動物模型制備：參照Paxinos大鼠腦立體定位圖譜定位于大鼠右側側腦室，坐標為前囟往后0.8mm，中線旁開1.3mm，硬膜下3.7mm，以1μL微量注射器將KA溶液（2μg／kg）緩慢注入側腦室，控制注射速度為0.05μL／min。依據(jù)Racine分級標準將大鼠行為分為5級：Ⅰ級：面肌抽動，節(jié)律性咀嚼動作；Ⅱ 級：節(jié)律性點頭或“濕狗樣”抖動（wet dog shakes，WDS）；Ⅲ 級：一側前肢陣攣；Ⅳ 級：雙側前肢陣攣伴站立；Ⅴ級：跌倒、全身強直陣攣性發(fā)作。以Ⅳ～Ⅴ級發(fā)作的大鼠作為成功癲癇模型。4個模型組共有57只大鼠造模成功納入下一步實驗，其中模型組6h15只、模型組24h14只、模型組3d14只、模型組7d14只。對照組僅于側腦室注入等體積的生理鹽水。

1.2.2 腦脊液標本采集及石蠟切片制備：以開始側腦室注藥為起點，模型組大鼠分別在相應的時間點、對照組在注射生理鹽水后6h采用枕骨大孔直接穿刺法抽取腦脊液（被血液污染的腦脊液棄用），以4500r／min離心10min后取上清液儲存于－20℃冰箱保存?zhèn)錂z。將大鼠依次使用生理鹽水250mL及4%（質量分數(shù)）多聚甲醛溶液250 mL進行心臟灌注，斷頭取腦，在大腦腹側面的視交叉及下丘腦后區(qū)乳頭體兩處對其進行冠狀切片，將中間包含海馬部分的腦組織用4%（質量分數(shù)）多聚甲醛固定24h后，脫水透明浸蠟后用石蠟包埋、切片，片厚4μm。

1.2.3 腦脊液白蛋白及S100B濃度檢測：在采集腦脊液后第二天采用雙抗體夾心法（ELISA）測定腦脊液中白蛋白及S100B濃度，具體操作步驟嚴格參照試劑盒說明書進行。

1.2.4 腦組織白蛋白、S100B及GFAP水平檢測：采用免疫組織化學法對腦組織切片進行檢測，主要步驟如下：二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，檸檬酸修復液高壓修復，用3%（體積分數(shù)）過氧化氫覆蓋組織切片20min以消除內源性過氧化物酶，山羊血清封閉20min，分別加白蛋白（1∶40）、S100B蛋白（1∶450）、GFAP（1∶50）一抗于4℃過夜，之后置生物素化二抗工作液37℃恒溫箱20min，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液20min，DAB顯色3～10min。于200倍光學顯微鏡下采集圖片，觀察白蛋白（表達在側腦室室管膜、海馬CA3區(qū)及第一軀體感覺皮質區(qū)）、S100B及GFAP（后兩種物質表達在海馬區(qū)）表達情況，使用Image－Pro Plus軟件分別測量累計光密度值（integrated optical density，IOD）及陽性表達面積（area），計算平均光密度值（IOD／area比值）。平均光密度值高提示目標蛋白表達量高。DAB染色后三種目標蛋白表達均呈棕黃色。

1.2.5 HE染色了解海馬CA3區(qū)結構改變：對腦組織切片常規(guī)進行HE染色，于200倍光學顯微鏡下采集2張海馬CA3區(qū)圖片觀察其神經(jīng)元排列及結構改變。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（）表示。多組間比較采用one－way ANOVA法；若方差齊，組間兩兩比較采用LSD法，若方差不齊，則采用Welch檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腦脊液白蛋白、S100B檢測 結果見表1。模型組6h白蛋白水平高于對照組（P＜0.05），其余時間點與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組四個時間點白蛋白水平兩兩比較，模型組7d、模型組3d低于模型組6h（P＜0.05），其余時間點兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義。模型組4個時間點腦脊液S100B水平均高于對照組（P＜0.05）；模型組4個時間點S100B水平間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），其中以模型組3d時腦脊液S100B濃度最高。

2.2 腦組織白蛋白、S100B及GFAP檢測

2.2.1 側腦室室管膜、第一軀體感覺皮質區(qū)及海馬CA3區(qū)白蛋白表達：模型組及對照組大鼠側腦室室管膜邊緣均可以看到棕黃色白蛋白附著（圖1）；4個模型組均有個別大鼠第一軀體感覺皮質區(qū)可見白蛋白長條或塊狀表達（圖2）；模型組各時間點均有個別樣本中觀察到在CA3區(qū)有白蛋白表達，以模型組3d時最為明顯（圖3）。

白蛋白在海馬CA3區(qū)（模型組6h、24h、7d時各2只，3d時3只）及第一軀體感覺皮質區(qū)（模型組24h時1只，6h、3d及7d時各3只）表達的大鼠數(shù)非常少，故僅對側腦室室管膜白蛋白表達進行統(tǒng)計學分析。模型組4個時間點分別與對照組比較，模型組24h及模型組6h時側腦室室管膜白蛋白表達高于對照組（P＜0.05），3d及7d時與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組四個時間點白蛋白表達兩兩比較，3d、7d時均低于模型組6h（P＜0.05），模型組7d時亦低于其他2個模型組（均P＜0.05）（表1）。

2.2.2 海馬區(qū)S100B表達比較：模型組4個時間點海馬區(qū)S100B表達均高于對照組（P＜0.05）；模型組24h、3d和7d時S100B表達均高于模型組6h時（P＜0.05），且模型組7d時低于模型組3d時（P＜0.05）（圖3，表1）。各組大鼠海馬齒狀回均可見棕黃色S100B表達，其中模型組3dS100B表達最多，模型組7d次之（圖4）。

2.2.3 海馬區(qū)GFAP蛋白表達比較：模型組3d、7d時海馬區(qū)GFAP表達均高于對照組（均P＜0.05），其余時間點GFAP表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；模型組 3d、7d時GFAP表達均高于模型組24h與6h時（均P＜0.05），且7d時GFAP表達亦高于3d時（P＜0.05）（圖5，表1）。各組大鼠海馬齒狀回及門區(qū)均可見棕黃色GFAP表達，模型組4個時間點較對照組增多，模型組4組隨時間往后推移GFAP表達逐漸增多、染色加深（圖5）。

2.3 HE染色 對照組大鼠海馬CA3區(qū)細胞排列整齊，未見明顯異形細胞及細胞核深染、碎裂等（圖6A）。模型組6h時海馬CA3區(qū)即出現(xiàn)神經(jīng)元排列紊亂（圖6B中黑箭頭所示）、部分細胞核深染（圖6B中白箭頭所示）；模型組24h時細胞排列紊亂（圖6C中黑箭頭所示），由圓形改變?yōu)槎嘈涡愿淖儯▓D6C中白箭頭所示）；模型組3d時多數(shù)細胞形態(tài)多形性改變，細胞層次減少（圖6D中箭頭所示）；模型組7d時細胞排列分散、細胞壞死（圖6E中箭頭所示）。

表1 各組不同時間點腦脊液中白蛋白、S100B及腦組織白蛋白、S100B及GFAP表達比較 （）

表1 各組不同時間點腦脊液中白蛋白、S100B及腦組織白蛋白、S100B及GFAP表達比較 （）

注：表中n值為成功采集到腦脊液的大鼠；與對照組6h比較，＊P＜0.05；與模型組6h比較，＃P＜0.05；與模型組24h比較，▲P＜0.05；與模型組3d比較，△P＜0.05

）］模型組7d 9 138.52±31.16＃ 41.37±3.14＊＃▲△ 0.335±0.002?！?0.341±0.007＊＃△ 0.351±0.024＊?！鹘M別 n 腦脊液白蛋白（μg／mL） S100B（pg／mL） 腦組織（IOD／area）白蛋白［lg（1／trans）］ S100B［lg（1／trans）］ GFAP［lg（1／trans模型組3d 7 150.42±39.71＃ 68.50±5.63＊?！?0.345±0.003＃ 0.366±0.015＊＃ 0.306±0.026＊＃▲模型組24h 8 153.19±34.80 49.08±2.79＊＃ 0.350±0.005＊ 0.353±0.025＊＃ 0.243±0.011模型組6h 8 188.75±42.87＊ 36.60±2.77＊ 0.352±0.004＊ 0.304±0.023＊ 0.232±0.009對照組6h 10 127.45±28.32 31.60±3.55 0.338±0.009 0.268±0.013 0.231±0.012 F值0.007 0.000 0.000 0.000 0.0 4.12 121.58 10.24 44.49 60.82 P值

圖1 各組大鼠側腦室白蛋白（圖中箭頭所示）表達（免疫組化×200）圖2 各組大鼠第一軀體感覺皮質區(qū)白蛋白（圖中箭頭所示）表達（免疫組化×200）

圖3 各模型組大鼠海馬CA3區(qū)白蛋白（圖中箭頭所示）表達（免疫組化×200）

圖4 各組大鼠海馬齒狀回S100B（圖中箭頭所示）表達（免疫組化×200）圖5 各組大鼠海馬齒狀回及門區(qū)GFAP（箭頭所示）表達（免疫組化×200）圖6 各組大鼠海馬CA3區(qū)形態(tài)改變（HE×200）：神經(jīng)元排列紊亂（圖B中黑箭頭所示）、部分細胞核深染（圖B中白箭頭所示）；模型組24h細胞排列紊亂（圖C中黑箭頭所示），由圓形改變?yōu)槎嘈涡愿淖儯▓DC中白箭頭所示）；模型組3d時多數(shù)細胞形態(tài)多形性改變，細胞層次減少（圖D中箭頭所示）；模型組7d時細胞排列分散、細胞壞死（圖E中箭頭所示）

3 討論

正常情況下，血－腦脊液屏障對白蛋白的通透性很小。癲癇發(fā)作可導致血－腦脊液屏障損傷，使其對白蛋白的通透性增高，損傷程度與癲癇發(fā)作形式及疾病分期密切相關，癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）及癲癇急性期血－腦脊液屏障損傷更加嚴重，白蛋白在海馬等腦區(qū)的表達更多、分布更廣泛［4］。

腦內白蛋白可通過轉化生長因子β（TGF－β）信號傳導通路激活星形膠質細胞，并激活腦內先天性免疫系統(tǒng)，干擾細胞外鉀離子及谷氨酸平衡，使神經(jīng)元興奮性增高、神經(jīng)網(wǎng)絡改變［5］。Ivens等［6］曾報道將腦組織直接暴露在白蛋白中也可誘導癲癇發(fā)作。另有研究顯示，在癲癇相關性神經(jīng)節(jié)細胞膠質瘤的膠質細胞中可觀察到大量白蛋白被攝取，而病灶周圍星形膠質細胞對白蛋白的攝取非常少［6］，提示血－腦脊液屏障功能障礙和白蛋白在星形膠質細胞中累積可能是癲癇新的致癇機制。在本研究中，模型組6h時癲癇大鼠腦脊液白蛋白高于對照組，白蛋白在各模型組個別大鼠第一軀體感覺皮質及海馬CA3區(qū)異常沉積，CA3區(qū)神經(jīng)元結構及排列改變、壞死等，也提示癲癇發(fā)作可以造成血－腦脊液屏障損傷，腦內白蛋白異常出現(xiàn)對神經(jīng)元有一定損傷作用。模型組6h、模型組24h腦脊液及腦組織中白蛋白均高于對照組，之后白蛋白表達逐漸減少，3d、7d時與對照組差異無統(tǒng)計學意義，提示首次癲癇發(fā)作對血－腦脊液屏障的結構和功能造成的損傷可能是一過性的。

在CNS中S100B主要由血管外周的成熟星形膠質細胞分泌，當細胞損傷及血－腦脊液屏障損害時，腦脊液及血清中S100B水平增高，前者尤為顯著［2］，且血清、腦脊液中S100B水平可先于腦內壓、神經(jīng)影像以及神經(jīng)病理改變前發(fā)生變化。Zongo等［7］通過比較分析頭部輕微創(chuàng)傷患者的CT掃描結果和血清S100B水平發(fā)現(xiàn)，血清S100B＜0.12ng／mL的患者腦內出現(xiàn)明顯影像學改變或者嚴重后遺癥的風險很小。癲癇發(fā)作時星形膠質細胞可加倍合成S100B蛋白，高水平S100B具有高度神經(jīng)膠質激活和促進神經(jīng)炎性反應損傷的作用，刺激自身及小膠質細胞產(chǎn)生大量的炎性因子及一氧化氮（NO），導致神經(jīng)元功能障礙。蜂肽毒可通過與S100B分子內部參與鈣離子結合的氨基酸殘基的相互作用干擾S100B在癲癇發(fā)作中的作用，被作為治療癲癇的藥物之一［8］。本研究中，模型組四個時間點癲癇大鼠腦脊液及海馬區(qū)S100B表達均高于對照組，海馬CA3區(qū)神經(jīng)元變性、壞死且數(shù)量減少，提示癲癇發(fā)作可能導致腦損傷，高水平S100B可能通過促進炎性反應加重了神經(jīng)元損傷，其可能原因為癲癇發(fā)作不僅可以激活星形膠質細胞，而且可以破壞星形膠質細胞及血－腦脊液屏障，使腦脊液及腦組織S100B含量增高。

GFAP是星形膠質細胞的骨架蛋白及特異性標志物。有實驗研究表明，GFAP缺如條件下小鼠對腦缺血損傷具有更高的敏感性，同時誘導血－腦脊液屏障形成過程存在缺陷［3］，提示GFAP對腦損傷具有保護作用，且對血－腦脊液屏障完整性形成具有重要作用。GFAP＋／＋星形膠質細胞可以誘導非神經(jīng)源性內皮細胞對K＋（鉀離子）、14C蔗糖及8磺茶堿（8－SPT）選擇性通透［9］。在 GFAP－／－小鼠，脊髓和視神經(jīng)的血－腦脊液屏障結構單薄，血管數(shù)目減少、發(fā)育不良，對125碘－（125I－）標記的白蛋白的通透性明顯增加［10］。本研究中，模型組3d及7 d時癲癇大鼠海馬區(qū)GFAP水平高于對照組，提示癲癇發(fā)作后星形膠質細胞可能通過上調GFAP表達水平降低腦對缺血缺氧的敏感性及對損傷的血－腦脊液屏障進行修復。癲癇發(fā)作后大鼠海馬區(qū)GFAP表達隨著時間的推移逐漸增多，提示癲癇發(fā)作后星形膠質細胞活化、增生程度增強。

綜上可見，癲癇發(fā)作后大鼠腦組織中白蛋白、S100B及GFAP表達異常增高。白蛋白為腦外源性物質，在血－腦脊液屏障損傷時即可通過血－腦脊液屏障，故腦脊液及腦組織中白蛋白水平變化快，而S100B及GFAP由星形膠質細胞產(chǎn)生及分泌，兩者的半衰期不同，因此在腦脊液或腦組織中水平增高時間點不同。但白蛋白、S100B及GFAP在癲癇發(fā)病機制中的具體作用亟待進一步研究。

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