任亮 于淼 黃林 王鵬非 金素鈺 鄭玉才

摘要：采用毛細(xì)管電泳（CE）測(cè)定不同年齡的九龍牦牛背最長(zhǎng)肌中肌苷酸（IMP）含量，以闡明九龍牦牛肉中IMP隨年齡的變化規(guī)律。高氯酸法提取3歲、5歲和7歲公牦牛以及12歲母牦牛背最長(zhǎng)肌中的IMP，然后用CE測(cè)定。結(jié)果表明，樣品中IMP能在15 min內(nèi)獲得有效分離，且線性關(guān)系良好。3歲公牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量（1.46±0.14） mg/g分別極顯著和顯著高于5歲、7歲的公牦牛；12歲母牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量（1.18±0.36） mg/g顯著低于3歲公牦牛（P<0.05），與5歲、7歲的公牦牛相比差異不顯著。牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量與年齡有關(guān)，并為確定九龍牦牛肉最佳屠宰年齡提供了一定的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：牦牛肉；毛細(xì)管電泳；肌苷酸

中圖分類號(hào)：TS251.5+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）10-2480-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.047

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原特有牛種，其肉具有高蛋白、低脂肪、風(fēng)味獨(dú)特等特點(diǎn)，屬于優(yōu)質(zhì)綠色肉類資源。肌苷酸（IMP）又名次黃嘌呤核苷酸，是肉中重要的鮮味物質(zhì)之一。準(zhǔn)確測(cè)定牦牛肉中的IMP含量對(duì)于了解牦牛肉的風(fēng)味具有實(shí)際價(jià)值。目前，測(cè)定肉中肌苷酸主要采用高效液相色譜法（HPLC）[1]。毛細(xì)管電泳（CE）是近幾十年發(fā)展起來(lái)的新分析方法，具有快速、靈敏、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，較之HPLC操作步驟更簡(jiǎn)單，成本更低。目前，國(guó)內(nèi)外已有CE分析核苷酸的報(bào)道[2，3]。CE分析核苷酸含量容易受pH、緩沖液濃度等因素的影響。本研究建立并優(yōu)化了CE分析牦牛肌肉中IMP含量的方法，通過(guò)檢測(cè)不同年齡九龍牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量，闡明九龍牦牛肉中IMP隨年齡變化的規(guī)律，為確定九龍牦牛產(chǎn)肉的最佳屠宰年齡提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇四川省甘孜州天然放牧的3歲、5歲和7歲九龍牦牛公牛，以及12歲九龍牦牛母牛各8頭，屠宰時(shí)采集背最長(zhǎng)肌，-80 ℃保存待用。

肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司）；磷酸二氫鉀（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；四硼酸鈉（分析純，西安化學(xué)試劑廠）。

1.2 儀器

P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀（美國(guó)Beckman公司），配有二極管陣列檢測(cè)器；Z323K高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)HermLe公司）；DELEA 320 pH計(jì)（瑞士METTLER TOLEDO公司）；SB-5200DTD超聲波清洗機(jī)（寧波新芝科器研究所）；WH-3微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠） ；WPA Biowave II 分光光度計(jì)（英國(guó)Biochrom公司）；OMNI-GLH電動(dòng)勻漿器（美國(guó)OMNI公司）。

1.3 方法

1.3.1 前處理 采用高氯酸法[1]，準(zhǔn)確稱取0.100 g背最長(zhǎng)肌，加入0.6 mol/L高氯酸2 mL，用電動(dòng)勻漿器勻漿2次，每次15 s，冰上放置5 min后以12 000 r/min離心5 min。取上清液1 mL，加入423 μL的1 mol/L KOH溶液，混合后以10 000 r/min于4 ℃離心10 min。上清液用0.45 μm水性膜過(guò)濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的配制 稱取肌苷酸0.010 0 g溶于10 mL去離子水中，滴入少許1 mol/L KOH溶液助溶，其準(zhǔn)確濃度采用分光光度法測(cè)定[4]。采用pH 5.5（磷酸調(diào)節(jié)）緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至10～160 μg/mL系列梯度，并用0.45 μm水性膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.3 分析條件 電泳條件主要參照文獻(xiàn)[5]，并做部分調(diào)整[6-9]：毛細(xì)管柱為Beckman非涂層毛細(xì)管（57 cm×50 cm，75 μm）。緩沖液為50 mmol/L KH2PO4與50 mmol/L Na2B4O7等體積混勻，磷酸調(diào)節(jié)至pH 6.5，0.45 μm水性膜過(guò)濾，4 ℃保存?zhèn)溆?。使用前超聲脫?0 min。參數(shù)設(shè)定：柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)249 nm。毛細(xì)管在每次進(jìn)樣前分別用0.1 mol/L的NaOH和去離子水沖洗5 min，再用運(yùn)行緩沖液沖洗10 min，檢測(cè)完成后再用去離子水沖洗10 min，組分定性參照標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間。

1.3.4 精密度檢驗(yàn) 將同一樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算保留時(shí)間與峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌苷酸（IMP）標(biāo)準(zhǔn)品的毛細(xì)管電泳分析

標(biāo)準(zhǔn)品IMP的保留時(shí)間約為13 min（圖1），峰形良好，峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間具有較好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1 227.9x-2 136.5，在10～160 μg/ mL范圍內(nèi)R2為 0.997 6；最小檢出限（S/N=3）為1 μg/mL；分析方法具有良好的精密度，IMP保留時(shí)間RSD為1.3%，峰面積RSD為2.4%。

2.2 牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量

樣品的色譜圖見(jiàn)圖2，色譜峰對(duì)稱性好。分析表明，3歲公牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量分別極顯著和顯著高于5歲、7歲的公牦牛，而5歲與7歲牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP的含量差異不顯著（表1）；12歲母牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量為（1.18±0.36） mg/g，顯著低于3歲公牦牛（P<0.05），與5、7歲的公牦牛相比差異不顯著。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果中不同年齡公牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量（表1）均低于魏雅萍等[10]、付永等[11]用HPLC測(cè)定的1.5歲公牦牛肋骨間最長(zhǎng)?。↙D）中IMP的含量分別為2.06 mg/g和2.38 mg/g。有研究報(bào)道，海門公山羊同一個(gè)體中不同部位的肌肉中IMP含量差異不顯著[12]。因此，牦牛肉中肌苷酸含量的差異可能主要源于試驗(yàn)牦牛的年齡不同[13]。另外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相同飼養(yǎng)條件下，3歲公牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量（1.46 mg/g）極顯著高于5歲公牦牛（1.03 mg/g），說(shuō)明牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量與年齡有關(guān)。由于動(dòng)物肌肉中IMP含量還受飼養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)和品種等多種因素的影響[13-16]，因此，牦牛肉中肌苷酸含量還可能受到牧草的季節(jié)性變化等因素的影響。本研究中12歲母牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量與5歲和7歲公牦牛接近，提示在該年齡階段，母牦牛肉仍保持較好的鮮味。馬旺等[6]、趙國(guó)芬等[17]測(cè)定了不同畜禽肌肉中的肌苷酸含量，豬肉（1.55 mg/g）、牛肉（1.2 mg/g）、雞肉（1.81 mg/g）、鴨肉（1.26 mg/g）、山羊（1.74 mg/g）。同各畜禽相比，3歲九龍牦牛肉中IMP含量（表1）高于鴨肉和普通牛肉，而5歲九龍牦牛肉中IMP含量（表1）低于其他肉類。因此，就IMP對(duì)肉鮮味的貢獻(xiàn)而言，九龍牦牛肉與普通牛肉大致相當(dāng)。

本試驗(yàn)采用HPLC法的肌肉樣品前處理技術(shù)，通過(guò)優(yōu)化CE分析條件，建立了牦牛肉中IMP方法的CE分析方法。由于CE法中的毛細(xì)管成本低于HPLC色譜柱，且進(jìn)樣量少、操作簡(jiǎn)單，結(jié)果重現(xiàn)性好，線性范圍廣，表明該方法具有具有較大的應(yīng)用潛力。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量與其年齡有關(guān)，該結(jié)果可對(duì)牦牛最佳屠宰年齡提供參考。

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