假酸漿多糖提取純化工藝的研究

姜 盼，王 遂，齊欣欣

(哈爾濱師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，哈爾濱150025)

假酸漿籽又稱為木瓜籽，為茄科植物假酸漿的成熟籽種.該植物主要分布于云南、貴州、廣西等地區(qū)，生長(zhǎng)于田邊、荒地和房屋周圍，有野生也有種植.其全草可以入藥，具有鎮(zhèn)靜、祛痰、清熱、解毒等功效，其籽種也具有清熱、退火、利尿等功能，在民間廣泛用來(lái)制作冷飲食品“冰木瓜”或稱“冰涼粉”“冰粉”等，其外觀為一淺黃色凝膠狀物，加人輔料和冰等制成一種老少皆宜的解暑、止渴的小吃[1].

植物多糖是由許多相同或不同的單糖以α－或β－糖苷鍵所組成的化合物，普遍存在于自然界植物體中.多糖是一切有機(jī)體必不可少的成分，它與維持生命的種種生理機(jī)能有著密切的聯(lián)系.有些植物多糖在降血糖、抗腫瘤、抗衰老等方面具有獨(dú)特的生理活性且具有無(wú)毒、副作用小的優(yōu)點(diǎn)[2－4].本實(shí)驗(yàn)比較了熱水浸提法、超聲波提取法、微波提取法在提取假酸漿多糖方面的差異，確定了最佳的提取條件.對(duì)多糖濃縮液進(jìn)行純化，得到了最佳的純化條件.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

假酸漿籽(景東銀生農(nóng)副產(chǎn)品有限公司);苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇、鹽酸、三氯乙酸(TCA)、氯仿、正丁醇、磷酸、氫氧化鈉、過(guò)氧化氫(均為分析醇);葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G－250.

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

752－紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)、HC－2064離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)、R－250旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝生物有限公司)、SHB－IIIA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、植物組織搗碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)、KQ2200－DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、WD900型微波爐(順德市格蘭仕電器實(shí)業(yè)有限公司)、SHA－C水浴恒溫震蕩器(上海醫(yī)療器械五廠).

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制苯酚－硫酸法[5]

應(yīng)用苯酚－硫酸法測(cè)定多糖的含量，葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品.以牛血清蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示.

1.2.2 假酸漿多糖的提取

1)提取工藝流程[6]

提取工藝:假酸漿籽→粉碎→配成一定液固比→提取(熱水浸提、超聲波提取、微波提取)→抽濾→得到多糖溶液

2)熱水浸提法的單因素試驗(yàn)[7－8]和正交試驗(yàn)

分別稱取1 g粉碎好的假酸漿6份，放入6只燒杯中，按固液比1∶25，90℃水浴加熱1 h，然后進(jìn)行真空抽濾.固定其他條件，分別考察料液比(1∶15～1∶65)、提取時(shí)間(0.5 ～5.5 h)、提取溫度(50～100℃)對(duì)多糖得率的影響.

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料液比、提取時(shí)間、提取溫度等進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平(見表1).

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

3)超聲波提取法的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)

分別稱取1 g粉碎好的假酸漿5份[9－11]，放入5只燒杯中，按固液比1∶50，超聲波功率70 W，超聲溫度60℃，超聲處理30 min，然后進(jìn)行真空抽濾.固定其他條件，分別考察料液比(1∶20～1∶66)、超聲波功率(50～90 W)、超聲溫度(50～70℃)、超聲時(shí)間(10～50 min)對(duì)多糖得率的影響.

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料液比、超聲波功率、超聲時(shí)間、超聲溫度等進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平(見表2).

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

4)微波提取法的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)

分別稱取 1 g粉碎好的假酸漿 5 份[12－13]，放入5只燒杯中，按固液比1∶30，微波功率中低火，微波處理2 min，然后進(jìn)行真空抽濾.固定其他條件，分別考察料液比(1∶20～1∶60)、微波功率(低火～高火)、微波時(shí)間(1～5 min)對(duì)多糖得率的影響.

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料液比、微波功率、微波時(shí)間等進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平(見表3).

表3 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.3 假酸漿多糖的純化

1)乙醇沉淀工藝

取提取所得的多糖濃縮液 10 mL[14]，加入無(wú)水乙醇，攪拌均勻后靜置，沉淀物經(jīng)抽濾干燥后稱重.固定其他條件不變分別考察乙醇沉淀時(shí)間(1～7 h)、無(wú)水乙醇用量(30% ～80%)對(duì)多糖得率的影響.

2)脫蛋白工藝

(A)TCA法

在多糖水提液中滴加與多糖水提液等體積的三氯乙酸(三氯乙酸的體積分?jǐn)?shù)一般控制在5% ～10%)混勻后靜置過(guò)夜，離心.除去膠狀沉淀重復(fù)以上操作直至溶液不再混濁為止[15－16].得到無(wú)蛋白的多糖.

(B)鹽酸法

往多糖濃縮液中加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至3.0，靜置過(guò)夜.3 500 r/min，15 min去除部分沉淀得脫蛋白液.

(C)Sevag法

將氯仿按濃縮液1/5體積加入，隨之再加入氯仿體積1/5的正丁醇，混合物劇烈振蕩20 min.分出水層和有幾層交界處的變性蛋白質(zhì).重復(fù)上述操作，直至無(wú)變性蛋白質(zhì)出現(xiàn).測(cè)定上清液多糖質(zhì)量濃度和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度.

3)過(guò)氧化氫脫色單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)

從100 mL 多糖溶液中吸取 8 mL[17－18]，滴加2～6滴氨水，將pH值調(diào)至8～9，加入1 mL30%的過(guò)氧化氫，50℃下脫色4 h，過(guò)濾并定容至10 mL.分別考察溫度(30～60)、脫色時(shí)間(1～6 h)、過(guò)氧化氫加入量(1～5 mL)對(duì)假酸漿多糖脫色效果的影響[19].

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料液比、超聲波功率、超聲時(shí)間、超聲溫度等進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平(見表4).

表4 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果

不同的提取方法正交試驗(yàn)結(jié)果見表5.

表5 不同的提取方法正交試驗(yàn)結(jié)果以及分析表

續(xù)表

通過(guò)分析可知，三種不同的提取方法(熱水浸提法、超聲波提取法、微波提取法)提取假酸漿多糖的得率是不同的.由單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了最優(yōu)的提取方法是熱水浸提法，提取條件為料液比1∶55、溫度80℃、時(shí)間3 h、提取2次，在此條件下提取率可達(dá)6.18%.熱水浸提法得到的多糖質(zhì)量濃度高但是該方法操作時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)廢料.超聲波提取法提取率比熱水浸提法低，這可能是超聲波有較強(qiáng)的剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間的作用會(huì)使大分子的多糖化學(xué)鍵斷裂，從而在后處理的過(guò)程中使損失增大而影響多糖的得率.微波法提取假酸漿多糖的得率最低，這可能是因?yàn)槲⒉ㄔ谔幚頃r(shí)導(dǎo)致假酸漿多糖降解.

2.2 乙醇沉淀假酸漿多糖單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇沉淀靜置時(shí)間對(duì)假酸漿多糖得率的影響

如圖3，通過(guò)分析可知，乙醇沉淀靜置時(shí)間越長(zhǎng)，多糖的得率先是逐漸增大，到4 h時(shí)達(dá)到最大值，超過(guò)4 h后多糖的得率反而下降.這可能是由于多糖組成中有多羥基的醛和酮，當(dāng)沉淀靜置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，其分子中的羥基會(huì)與乙醇分子中的羥基形成互溶體系，從而使得多糖的沉淀質(zhì)量有所減少.

圖3 乙醇沉淀靜置時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

2.2.2 無(wú)水乙醇加入量對(duì)假酸漿多糖得率的影響

通過(guò)分析圖4可知，隨著無(wú)水乙醇加入量的逐漸升高，多糖的得率逐漸增大.這可能是因?yàn)樵诘腕w積分?jǐn)?shù)乙醇溶液中相對(duì)分子質(zhì)量較小的多糖不能被沉淀下來(lái)，隨著無(wú)水乙醇用量的增多，多糖的沉淀質(zhì)量逐漸增加.

由單因素試驗(yàn)確定的最佳的醇沉條件為無(wú)水乙醇加入量為80%，醇沉?xí)r間為4 h，在此條件下對(duì)假酸漿多糖進(jìn)行醇沉試驗(yàn)，醇沉后的多糖體積分?jǐn)?shù)可達(dá)44.5%.

圖4 無(wú)水乙醇加入量對(duì)多糖得率的影響

2.3 脫蛋白質(zhì)的方法比較

由圖5可知，三種方法對(duì)多糖提取液脫蛋白的效率存在著明顯的差異.三種方法蛋白質(zhì)脫除率由大到小的是Sevag＞TCA法＞鹽酸法.三種方法中多糖損失率由低到高的是TCA法＞Sevag法＞鹽酸法.由此可見鹽酸法脫蛋白的效果最差，而且多糖的損失率高.這可能是因?yàn)辂}酸為強(qiáng)酸，試驗(yàn)條件不好控制，若試驗(yàn)條件控制不當(dāng)，則多糖的損失率嚴(yán)重.TCA法相對(duì)于鹽酸法脫蛋白的效果好，而且多糖的損失率也比鹽酸法小.Sevag法脫蛋白的效果最好，

但是多糖的損失率相對(duì)TCA法要大.根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的條件，以及時(shí)間、經(jīng)濟(jì)的考慮最后確定TCA法為去除假酸漿多糖蛋白質(zhì)的最佳方法.在此條件下脫蛋白率可達(dá)70.8%.

圖5 脫蛋白質(zhì)的方法比較

2.4 過(guò)氧化氫脫色的結(jié)果

過(guò)氧化氫脫色的正交試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見表6.

表6 過(guò)氧化氫脫色的正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)表6分析可知最佳的脫色工藝為溫度50℃、時(shí)間2 h、過(guò)氧化氫加入量為2 mL，在此條件下下脫色率可達(dá)91.0%.

3 結(jié)論

1)本研究比較了熱水浸提法、超聲波提取法、微波提取法對(duì)提取假酸漿多糖得率的影響.確定了最佳的提取工藝為水提法，在此條件下提取率可達(dá)6.18%.超聲波提取法用于假酸漿多糖的提取方面雖然多糖得率不如熱水浸提法高，但是超聲波法有著時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，適合用于工業(yè)生產(chǎn).

2)本研究對(duì)假酸漿多糖進(jìn)行了醇沉工藝、去蛋白工藝、過(guò)氧化氫脫色工藝.確定了最佳的純化條件.在最佳的純化條件下，醇沉后的多糖含量可達(dá)80.5%，蛋白質(zhì)脫除率可達(dá)70.8%.脫色率可達(dá)91.0%.

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