兩種帕金森體外模型的構(gòu)建及相關(guān)研究

王可心，李煦照，徐紅英，張 寧，劉樹民

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院中藥毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院細(xì)胞生物學(xué)研究室，哈爾濱150040;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，哈爾濱150040)

帕金森病是一種中老年人常見的運(yùn)動障礙疾病，臨床上表現(xiàn)為靜止性震顫，運(yùn)動遲緩，肌強(qiáng)直和姿勢步態(tài)異常等.PD的主要病理學(xué)特征是中腦黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元的選擇性變性、死亡，以及在殘存的神經(jīng)元胞漿中出現(xiàn)嗜酸性的淀粉樣蛋白包涵體—Lewy小體，Lewy是PD的診斷特征.雖然目前對于a－Synuclein與帕金森的關(guān)系尚未完全清楚，但SNCA(Synuclein，alpha)基因編碼的a－Synuclein在病理狀態(tài)下聚集與Lewy的形成和多巴胺能神經(jīng)元的死亡乃至PD的發(fā)生有密切的關(guān)系[1].

a－Synuclein是一種含有140個氨基酸的神經(jīng)突觸前末端蛋白[2]，有研究發(fā)現(xiàn)PD中發(fā)現(xiàn)a－Synuclein基因有兩個罕見的錯義突變(A30P和A53T)后[3－4]，a－Synuclein 引起了廣泛的關(guān)注，過表達(dá)野生型或突變型a－Synuclein的轉(zhuǎn)基因動物均可產(chǎn)生類似PD的癥狀[5]，但是a－Synuclein的異常聚集及l(fā)ewy小體的形成機(jī)制尚不明確.

由于PD的病理特征是中腦多巴胺能神經(jīng)元的損失，而SH－SY5Y細(xì)胞系恰恰具有許多多巴胺能神經(jīng)元的特點(diǎn)，如:SH－SY5Y細(xì)胞具有合成多巴胺和去甲腎上腺素的能力;SH－SY5Y細(xì)胞能表達(dá)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DAT)等，同時SH－SY5Y細(xì)胞容易獲取，培養(yǎng)簡便，所以近些年被用來多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞模型，但是該細(xì)胞作為宿主細(xì)胞能否表達(dá)a－Synuclein還需要進(jìn)一步研究.因此針對該問題本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建人野生型和A53T突變型a－Synuclein載體質(zhì)粒，并以慢病毒介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)染SH－SY5Y細(xì)胞，并對融合在該細(xì)胞里面的目的基因及其所表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定，為今后a－Synuclein基因體外模型建立及帕金森等神經(jīng)退行性疾病的研究奠定了基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料

Xmn I、Xho I、DrdI、SpeI、NdeI、Nsp V 等限制性內(nèi)切酶、慢病毒包裝試劑盒均購自廣州復(fù)能基因公司;pEGFP－SNCA－WT和pEGFP－SNCA－A53T質(zhì)粒廣州復(fù)能基因公司合成;Polybrene購自Sigma公司;293T細(xì)胞為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)提供;SHSY5Y細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保存委員會細(xì)胞庫;TOP10感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存;PBS、血清(FBS)、胰酶、DMEM、DMEM/F12、Opti－MEMI、Puromycin均購自Thermo公司;兔抗人Anti－Alpha－Synuclei購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司、羊抗兔二抗北京中杉金橋有限公司.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 pEGFP－SNCA －WT、pEGFP－SNCA －A53T突變型基因表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

2.1.1 pEGFP－SNCA－WT基因表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中基因序列設(shè)計(jì)引物;WT上游引物:5'－ATCCACGCTGTTTTGACC －3'，含 Xmn I內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引物:5'－CCGGACACGCTGAACTTGT－3'含Xho I內(nèi)切酶位點(diǎn);以WT型a－Synuclein基因?yàn)槟０?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，30 個循環(huán)，72℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng).以Xmn I、Xho I酶切PCR產(chǎn)物獲得423bp的DNA片段，將得到的DNA片段通過T4－DNA連接酶插入到pEZ－Lv122載體質(zhì)粒中，獲得pEGFP－SNCA－WT基因表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng).

以SNCA－WT為模板，在A53T所需的突變點(diǎn)位進(jìn)行定點(diǎn)突變，將獲得的DNA片段連入pReceiver－Lv122載體質(zhì)粒中，將獲得的 SpEGFPSNCA－A53質(zhì)粒同樣轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中.

2.1.2 酶切鑒定

將pEGFP－SNCA－WT基因表達(dá)質(zhì)粒分別用DrdI、SpeI內(nèi)切酶酶切;pEGFP－SNCA －A53T基因表達(dá)質(zhì)粒分別用Xmn I、NdeI酶切，對所得到酶切產(chǎn)物進(jìn)行鑒定.

2.2 慢病毒包裝、濃縮和儲存

2.2.1 293T 細(xì)胞的培養(yǎng)

293T細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(培養(yǎng)基為:10%的FBS+1%的青鏈霉素雙抗+DMEM，培養(yǎng)條件:37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2)，待細(xì)胞貼壁后，每2天換液，細(xì)胞80%融合后傳代繼續(xù)培養(yǎng).

2.2.2 慢病毒的包裝、濃縮

將1.3～1.5 ×106個293T 細(xì)胞平鋪于 10 cm培養(yǎng)皿中，待融合度達(dá)到70% ～80%后，按照說明書提供的慢病毒包裝方法，在293T中生產(chǎn)慢病毒，并收集病毒上清液，將收集的慢病上清液用0.45 μm的PVDF膜過濾除去細(xì)胞碎片，過濾后的上清在4℃，5 000 g條件下離心120 min，將沉淀用1 mLPBS重懸，混勻后置于－80℃保存?zhèn)溆?

2.3 WT和A53T型a－Synuclein穩(wěn)定表達(dá)的SH－SY5Y細(xì)胞系的建立

2.3.1 轉(zhuǎn)染SH－SY5Y細(xì)胞

在感染病毒的24 h前，將細(xì)胞鋪于24孔板，每孔加入2～10×104個細(xì)胞.之后每孔填充0.5 mL含有5%熱滅活的胎牛血清和青鏈霉素雙抗的DMEM/F12.37℃，5%CO2孵育過夜.對于每個孔，用0.5 mL含有慢病毒顆粒的完全培養(yǎng)基替換舊的培養(yǎng)基，并加入 Polybrene，使其終質(zhì)量濃度為8 μg/mL，先將培養(yǎng)板在4～8℃下放置2 h，然后再在37℃，5%CO2下繼續(xù)孵育，直至總轉(zhuǎn)染時間達(dá)到72 h.

2.3.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的藥物篩選

移除慢病毒介導(dǎo)后的SH－SY5Y細(xì)胞中的培養(yǎng)液，用PBS充分漂洗，以10%FBS+DMEM/F12+Puromycin(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)作為選擇性培養(yǎng)液對轉(zhuǎn)染完成后的細(xì)胞進(jìn)行陽性篩選，篩選4周后在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況.并提取目的DNA進(jìn)行測序.

2.4 western blot法檢測SH－SY5Y－WT和SHSY5Y－A53T細(xì)胞系中a－Synuclein表達(dá)情況

SH－SY5Y－WT和SH－SY5Y－A53T細(xì)胞培養(yǎng)至80%融合后消化收集細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后加蛋白裂解液超聲裂解，將裂解物以13 000 r/min 4℃離心30 min，收集上清，取適量樣品用BCA蛋白定量試劑盒定量，等量蛋白樣品經(jīng)10%SDSPAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，常規(guī)方法經(jīng)一抗及二抗孵育后用ECL發(fā)光液顯影.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 基因表達(dá)載體酶切結(jié)果鑒定

凝膠電泳顯示 pEGFP－SNCA－WT質(zhì)粒經(jīng)DrdI酶切后得到和預(yù)期大小相同的兩個條帶(1 882 bp和6 552 bp)，而經(jīng)過SpeI酶切后所得的兩個條帶6 371 bp和2 063 bp也與預(yù)期的大小一致，見圖1 A.證明pEGFP－SNCA－WT質(zhì)粒構(gòu)建成功.pEGFP－SNCA－A53T質(zhì)粒經(jīng)Xmn I酶切后所得到的2 596、1 877、3 959 bp 三個條帶，和 NdeI酶切后得到的6 371、2 044 bp條帶都與預(yù)期的一致，見圖1 B.證明pEGFP－SNCA－A53T質(zhì)粒構(gòu)建成功.

圖1 基因表達(dá)載體酶切結(jié)果鑒定

3.2 倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)

轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)Puromycin篩選4周后獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系，在倒置熒光顯微鏡下觀察其表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)篩選后，任何視野下熒光表達(dá)率均在90%，見圖2的A1和B1.并且400倍顯微觀察發(fā)現(xiàn)很多陽性細(xì)胞突起出現(xiàn)熒光表達(dá)，見圖2的A2，B2.證明慢病毒轉(zhuǎn)染成功，SH－SY5Y細(xì)胞能夠表達(dá)目的基因.

3.3 目的DNA測序

提取SH－SY5Y－WT和SH－SY5Y－A53T細(xì)胞基因組，然后用PCR方法擴(kuò)增目的基因片段，純化后進(jìn)行測序，結(jié)果顯示:SH－SY5Y－WT目的片段序列與 GeneBank中的序列一致，而 SHSY5Y－A53T目的片段序列中的第157位的鳥嘌呤(G)被腺嘌呤(A)取代，見圖3，氨基酸密碼子從GCA變?yōu)锳CA，編碼氨基酸從丙氨酸(Ala)變?yōu)樘K氨酸(Thr)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[3].說明我們所要的目的基因已經(jīng)成功的整合到SH－SY5Y細(xì)胞基因組中.

圖2 SH－SY5Y－WT和SH－SY5Y－A53T細(xì)胞中pEGFP的表達(dá)

圖3 目的DNA的測序結(jié)果

3.4 Western blot法檢測a－Synuclein蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示SH－SY5Y、SH－SY5Y－WT、SH－SY5Y－A53T三種細(xì)胞在分子質(zhì)量大約18 ku處均出現(xiàn)a－Synuclein蛋白條帶，但是SH－SY5Y－WT和SH－SY5Y－A53T細(xì)胞在18 kd處的蛋白表達(dá)明顯高于SH－SY5Y細(xì)胞，見圖4.這可能是因?yàn)閍－Synuclein在SH－SY5Y細(xì)胞中表達(dá)量過低，而三種細(xì)胞在40 ku處均出現(xiàn)GAPDH的明顯表達(dá)，說明轉(zhuǎn)染后的SH－SY5Y細(xì)胞能夠過表達(dá)a－Synuclein蛋白.

圖4 Synuclein在SH－SY5Y、SH－SY5Y－WT及SH－SY5Y－A53T細(xì)胞中的表達(dá)

4 討論

PD是威脅人類健康的重要性疾病，對它的機(jī)制的研究迫在眉睫，PD模型的建立為研究提供了很好的平臺.目前PD模型以動物模型居多，同時隨著人們對PD的深入研究，從基因和分子水平的層面上研究PD的發(fā)病機(jī)制受到越來越多學(xué)者的關(guān)注.a－Synuclein與PD有著密切的關(guān)系，a－Synuclein的過表達(dá)、錯誤修飾與折疊、原纖維及纖維形成參與了多巴胺能神經(jīng)元的損傷過程[6－7].但是對a－Synuclein的生理功能上不明確，為了進(jìn)一步探索a－Synuclein及其突變體在多巴胺神經(jīng)能中的致病機(jī)制，建立一個合理的PD體外模型變得尤為重要.

目前廣泛應(yīng)用的PD細(xì)胞模型主要包括以下三種:1)非神經(jīng)元性腫瘤細(xì)胞系.以大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞為代表;2)神經(jīng)元性腫瘤細(xì)胞系.以神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH－SY5Y等為代表;3)原代中腦細(xì)胞;SH－SY5Y細(xì)胞是由SK－N－SH細(xì)胞系衍生而來(SK－N－SH→SH－SY→SH－SY5→SH－SY5Y)，該細(xì)胞能夠支持質(zhì)粒的復(fù)制，進(jìn)行轉(zhuǎn)染DNA的高度擴(kuò)增，使克隆的基因片段得到高效的表達(dá)，并可表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志性物質(zhì)如:多巴胺－β－羥化酶、神經(jīng)絲蛋白、阿片受體和神經(jīng)生長因子受體等[8]，其細(xì)胞形態(tài)及某些生理功能與正常神經(jīng)元有相似之處，是目前國際上研究神經(jīng)細(xì)胞功能較為理想的一種細(xì)胞模型[9].

運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型是研究帕金森病發(fā)病機(jī)制的重要途徑，目前將基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法有非病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染和病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染兩大類[10].病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染通過病毒攜帶目的基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，病毒憑借自身的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，將攜帶的基因穩(wěn)定整合至靶細(xì)胞基因組中，使目的基因得以長期穩(wěn)定表達(dá)，因此慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)在分子生物領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用.

為了進(jìn)一步研究a－Synuclein在SH－SY5Y細(xì)胞中的表達(dá)及a－Synuclein與PD的發(fā)病機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以慢病毒為載體，將人野生型和A53T突變型a－Synuclein基因轉(zhuǎn)入SH－SY5Y細(xì)胞內(nèi)，在宿主細(xì)胞內(nèi)成功的檢測到人野生型和A53T突變型a－Synuclein蛋白的表達(dá)，并通過嘌呤霉素的篩選獲得長期穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，這對以后PD發(fā)病機(jī)制的研究、新藥物作用靶點(diǎn)、目標(biāo)藥物設(shè)計(jì)和有效化合物的篩選具有重要意義.

[1]KHANDELWAL P J，DUMANIS S B，F(xiàn)ENG L R，et al.Parkinson－related parkin reduces alpha－Synuclein phosphorylation in a gene transfer model[J].Mol Neurodegener，2010，5(1):47.

[2]GALVIN J E，LEE V M，TROJANOWSKI J Q.Synucleinopathies:clinical and pathological implications[J].Arch Neurol，2001，58:186－ 190.

[3]POLYMEROPOULOS M H，LAVEDAN C，LEROY E，et al.Mutation in the a－synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease[J].Science，1997，276:2045 －2047.

[4]KRUGER R，KUHN W，MULLER T，et al.Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha－synuclein in Parkinson’s disease[J].Nature Genet，1998，18:106 －1081.

[5]FEANY M B，BENDER W W.A drosophilamodel of Parkinson’s disease[J].Nature，2000，404:394 －398.

[6]FUJIWARA H，HASEGAWA M，DOHMAE N，et al.a－Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions[J].Nat Cell Biol，2002，4(2):160－ 164.

[7]MASLIAH E，ROCKENSTEIN E，VEINBERGS I，et al.Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha－synuclein mice:implications for neurodegenerative disorders[J].Science，2000，287:1265－1269

[8]CICCARONE V，SPENGLER B A，MEYERS M B，et al.Phenotypic diversification in human neruoblastoma cell:expression of distinct neural crest lineages[J].Cancer Res，1989，49(1):219－225

[9]GHATAN S，LARNER S，KINOSHITA Y，et al.P38 MAP Kinase mediated bax translocation in nitric oxide induced apoptosis in neurons[J].The Journal of Cell Biology，2000，150(2):335－347.

[10]蘭丹梅，鄔劍軍，蘇雅茹，等.人野生型和A53T突變型A－突觸核蛋白慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及在PC12細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2009，25(3):289 －294.