分子印跡固相萃?。咝б合嗌V－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中5種β2－受體激動(dòng)劑殘留

張學(xué)亮， 羅云敬*， 姜 潔， 路 勇， 馮 楠

（1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124；2.北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京100041）

β2-受體激動(dòng)劑（β2-agonists）是一類(lèi)人工合成的苯乙醇胺類(lèi)藥物，主要包含克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等，這類(lèi)物質(zhì)的作用包括顯著提高動(dòng)物胴體的瘦肉率、增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率［1，2］，但對(duì)人體有毒害作用。因而，我國(guó)農(nóng)業(yè)部等公告［3-6］規(guī)定嚴(yán)禁在動(dòng)物飼料和飲用水等中使用此類(lèi)藥物，在動(dòng)物源食品中不得檢出此類(lèi)藥物，同時(shí)給出了部分藥物的檢測(cè)方法。歐盟等西方國(guó)家也對(duì)食品中部分β2-受體激動(dòng)劑殘留限量做出了規(guī)定［7］。

食品中β2-受體激動(dòng)劑殘留的常用檢測(cè)方法有高效液相色譜法［8，9］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［10］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［11］、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［12-16］等。分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）是人工合成的聚合物，是根據(jù)印跡分子定做的，具有特殊的分子結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)，能選擇性地識(shí)別印跡分子。所以以分子印跡聚合物為固相萃取吸附劑可提高萃取選擇性。分子印跡固相萃取也逐漸得到很好的應(yīng)用［15，16］，但是目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)采用分子印跡固相萃取結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)β2-受體激動(dòng)劑殘留的報(bào)道。本研究以豬肉為樣品基質(zhì)，在55℃酶解2 h后進(jìn)行分子印跡固相萃取凈化，內(nèi)標(biāo)法定量，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)5種β2-受體激動(dòng)劑殘留的方法。本方法通過(guò)減少酶解時(shí)間提高了實(shí)驗(yàn)效率，而且采用內(nèi)標(biāo)法定量和分子印跡固相萃取柱進(jìn)行凈化，進(jìn)一步提高了方法的準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC-TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）；Milli-Q純水儀（美國(guó)Millipore公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

苯乙醇胺 A（phenethylamine A）、沙丁胺醇（salbutamol）、沙美特羅（salmeterol）、克倫特羅（clenbuterol）、萊克多巴胺（ractopamine）、d6-沙丁胺醇（d6-salbutamol）、d5-萊克多巴胺（d5-ractopamine）、d6-克倫特羅（d6-clenbuterol）、d3-沙美特羅（d3-salmeterol）、d3-苯乙醇胺 A（d3-phenethylamine A）均購(gòu)自 Dr.Ehrenstorfer GmbH；純度均高于98.0%。β-鹽酸葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶（30 ku／60 ku）購(gòu)自默克公司；MIP Beta-Receptors固相萃取柱（25 mg／10 mL）購(gòu)自美國(guó) SUPELCO

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取25 mg的上述標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解在25 mL容量瓶中，配制成1 000 μg／kg的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃保存。

乙酸-乙酸鈉緩沖液的配制：稱(chēng)取43.0 g乙酸鈉，加入22 mL乙酸，用水溶解并定容到1 000 mL，用乙酸調(diào)節(jié)pH到5.2。

1.2 樣品制備

樣品的酶解：準(zhǔn)確量取動(dòng)物性食品樣品2 g，置于離心管內(nèi)，加入1 mg／L的同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，渦旋混勻，加入 10 mL 0.2 mol／L 乙酸銨緩沖液（pH 5.2）和 100 μL β-葡萄糖醛酸酶／芳基硫酸酯酶，于55℃酶解2 h。酶解液放至室溫后，用0.1 mol／L的NaOH溶液調(diào)pH至7.0左右，渦旋后于0℃、10 000 r／min下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，待凈化。

樣品的凈化：MIP柱依次用6 mL乙腈、1 mL水活化，然后提取液上MIP柱，棄去流出液；用3 mL水淋洗，抽真空使柱中的溶液全部流出；再用1 mL乙腈、3 mL 60% （v／v）乙腈水溶液淋洗，抽真空使柱中的溶液全部流出；用2 mL 1%（v／v）甲酸乙腈溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮至近干，以流動(dòng)相復(fù)溶后過(guò)0.22 μm的有機(jī)濾膜，待LC-MS測(cè)定。

1.3 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS C18（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1% （v／v）甲酸水溶液（B）／甲醇（A）。梯度洗脫：0～7.0 min，15%A～50%A；7.0～10 min，50%A～99%A；10～13 min，99%A；13.1～16 min，15%A。恒定流速：0.30 mL／min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子（ESI+）模式；毛細(xì)管電壓：2.59 kV；離子源溫度：150℃；去溶劑氣溫度：350℃；去溶劑氣流量：800 L／h；錐孔氣流量：150 L／h；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。10種β2-受體激動(dòng)劑的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜分別對(duì)5種β2-受體激動(dòng)劑進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描，以?xún)蓪?duì)母離子-子離子、保留時(shí)間等對(duì)這些化合物進(jìn)行定性、定量。

由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液狀態(tài)下的電保留時(shí)間和峰形外，還會(huì)影響分析物的離子化效率，從而影響目標(biāo)化合物的檢測(cè)靈敏度。本實(shí)驗(yàn)分別采用甲醇、乙腈、甲醇-0.1% （v／v）甲酸水溶液、乙腈-0.1%（v／v）甲酸水溶液作為流動(dòng)相，考察了流動(dòng)相組成對(duì)各化合物響應(yīng)值的影響，結(jié)果表明甲醇-0.1%（v／v）甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)的峰形明顯改善，因此以甲醇-0.1%（v／v）甲酸水溶液為流動(dòng)相。最終得到的5種β2-受體激動(dòng)劑的總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）（見(jiàn)圖1）。

表1 10種化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for the ten compounds

圖1 5種化合物的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms（TIC）of the five compounds

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

食品中β2-受體激動(dòng)劑檢測(cè)中前處理方法的關(guān)鍵是選擇提取效率好的提取溶劑，以及合理的凈化方案，減少目標(biāo)化合物在樣品前處理過(guò)程中的損失。王培龍等［10］、胡艷云等［16］已經(jīng)對(duì)提取溶液進(jìn)行了很好的研究，本文就酶解條件、凈化方式等條件進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2.1 酶解條件的選擇

β2-受體激動(dòng)劑在動(dòng)物體內(nèi)代謝過(guò)程中，多數(shù)會(huì)與硫酸酯蛋白和葡萄糖醛酸作用，最終以硫酸軛合物和葡萄糖醛酸軛合物等結(jié)合態(tài)形式存在，需要將其轉(zhuǎn)化為游離態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，因此采用β-葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶對(duì)樣品進(jìn)行酶解。參考Damasceno 等［17］、楊光等［18］對(duì) β-葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶的活性研究，本文比較了55℃下酶解2 h和37℃下酶解16 h的效果。結(jié)果如圖2所示，因此選擇55℃下酶解2 h。在保證效率和回收率的前提下，本方法與王培龍等［10］、胡艷云等［16］方法以及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［6］等酶解方法相比，提高了工作效率。

圖2 酶解條件對(duì)5種β2－受體激動(dòng)劑回收率的影響Fig.2 Effect of enzyme conditions on the recoveries of the five β2 －agonists

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，直接用提取劑提取而不凈化時(shí)，提取溶液中樣品基質(zhì)干擾物質(zhì)多，基質(zhì)效應(yīng)比較強(qiáng)，同時(shí)對(duì)色譜柱和儀器的損壞較大。樣品基質(zhì)中主要是大分子蛋白質(zhì)和脂肪，另外也有小分子的碳水化合物等。實(shí)驗(yàn)比較了HLB柱（Waters，6 mL／150 mg，30 μm）、MCX 柱（Waters，6 mL／150 mg，30 μm）、MIP 柱和 DisQuE 凈化管 （Waters，15 mL，150 mg PSA、150 mg C18、900 mg MgSO4），以回收率評(píng)價(jià)提取效果。如圖3所示，對(duì)于DisQuE凈化管、MCX柱、C18柱，由于目標(biāo)化合物的種類(lèi)多，極性差異比較大，化合物的保留效果差，損失較大，凈化效果不理想；MIP柱作為相對(duì)比較專(zhuān)一的交換柱，能夠特異性地保留目標(biāo)化合物，采用低溫環(huán)境凈化（-4℃）和強(qiáng)酸條件也能起到沉淀蛋白質(zhì)和脂肪的凈化作用。所以選擇MIP固相萃取柱。

圖3 不同凈化條件下5種β2－受體激動(dòng)劑的平均回收率Fig.3 Average recoveries under different purification conditions for the five β2－agonists

2.3 方法的驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

用陰性樣品基質(zhì)配制 0、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 μg／kg等不同含量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)加入10 μL 1 mg／L的內(nèi)標(biāo)物混合液，進(jìn)行樣品前處理和測(cè)定。以5種β2-受體激動(dòng)劑和內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)比值為縱坐標(biāo)，化合物的含量（單位為μg／kg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比為3確定方法檢出限（LOD），信噪比為10確定定量限（LOQ）。5種β2-受體激動(dòng)劑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見(jiàn)表2。

表2 5種β2－受體激動(dòng)劑的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r2）、檢出限和定量限Table 2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients （r2），LODs and LOQs of the five β2－agonists

2.3.2 回收率和精密度

如表3所示，在陰性豬肉空白樣品中添加低、中、高3 個(gè)水平（0.25、1.0、5 μg／kg）的5 種 β2-受體激動(dòng)劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品前處理后測(cè)定目標(biāo)化合物，每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行6次試驗(yàn)。

表3 豬肉加標(biāo)樣品中5種β2－受體激動(dòng)劑的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Average recoveries and relative standard deviations ofthe five β2－agonists in spiked pork sample

按照實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范，當(dāng)空白樣品中加標(biāo)水平低于0.1 mg／kg時(shí)，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求分別為60%～120%和0～20%。從表3的結(jié)果中可以看出，5種β2-受體激動(dòng)劑的平均回收率為80.4% ～92.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2% ～6.3%，完全符合要求，方法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度良好，較為可靠。

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

利用上述方法對(duì)不同地區(qū)大型超市和市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的50份豬肉進(jìn)行分析，只檢出一份豬肉樣品中含有0.13 μg／kg 克倫特羅（見(jiàn)圖4）。

圖4 陽(yáng)性樣品的色譜圖Fig.4 Chromatogram of a positive sample

3 結(jié)論

本研究采用分子印跡固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜技術(shù)建立了豬肉中5種β2-受體激動(dòng)劑殘留的同時(shí)定量方法。該方法檢出限低、回收率高，快速、靈敏、準(zhǔn)確，提高了實(shí)驗(yàn)效率和準(zhǔn)確性，適合同時(shí)進(jìn)行多種β2-受體激動(dòng)劑殘留的測(cè)定。

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