氣相色譜－負(fù)化學(xué)電離源質(zhì)譜法測定魚油中16種多氯聯(lián)苯

王 麗， 李書書， 張 展， 王守林， 李 磊*

魚油含有豐富的二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA），具有抗炎和抗氧化特性，可以預(yù)防和治療動脈粥樣硬化、降低癌癥發(fā)病率等。近些年的研究還顯示，DHA和EPA在嬰兒生長發(fā)育等方面也有重要作用［1，2］。但兩者在人體內(nèi)均不能被合成，只能通過食物攝取，因此補充魚油在預(yù)防疾病等方面具有一定作用。

但是在持久性環(huán)境污染物（POPs）全球遷移及生物富集的情況下，魚油的品質(zhì)也受到影響［3，4］。多氯聯(lián)苯（PCBs）是斯德哥爾摩公約中優(yōu)先控制的12類持久性有機污染物之一，生物體攝食后在體內(nèi)蓄積，不易降解［5-8］。PCBs理論上有209種同系物異構(gòu)體，其中共平面多氯聯(lián)苯（co-PCBs）／二惡英類多氯聯(lián)苯有12種，其在結(jié)構(gòu)上具有共平面特性，包括 4個非鄰位取代 PCBs（non-ortho PCBs，PCB77、PCB81、PCB126 和 PCB169）和8 個單鄰位取代 PCBs（mono-ortho PCBs，PCB105、PCB114、PCB118、PCB123、PCB156、PCB157、PCB167 和PCB189）。其毒理機制與二惡英類似，有較強的致癌和內(nèi)分泌干擾作用，人體長期低劑量接觸會導(dǎo)致癌癥、雌性化、胎兒畸形等疾?。?，10］，國際癌癥研究機構(gòu)將其歸為2A類致癌物（致癌可能性較大）。另外，全球環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng)／食品規(guī)劃部分（GEMS／FOOD）［11］中 規(guī) 定，以 PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153 和 PCB180 作為多氯聯(lián)苯污染狀況的指示性多氯聯(lián)苯（indicator PCBs）來替代所有多氯聯(lián)苯同系物異構(gòu)體進(jìn)行監(jiān)測。

魚油中存在多種PCBs殘留［12］，研究同時測定魚油中多種PCBs（尤其是毒性較大、含量極低的co-PCBs，以及常見的、含量相對較高的 indicator PCBs）的方法對保障人類健康具有重要的意義。本文重點檢測了魚油中12種co-PCBs、部分indicator PCBs（PCB118、PCB153、PCB180）和 PCB170。

目前，PCBs的檢測方法主要有氣相色譜-電子捕獲檢測器法（GC-ECD）［13-15］、氣相色譜-電子轟擊源質(zhì)譜法（GC-EI-MS）［16］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS／MS）［17］以及氣 相色譜-高分辨 質(zhì)譜法（GC-HRMS）［18，19］。GC-ECD 對樣品前處理的要求較高，且只能依靠保留時間定性；GC-EI-MS雖然可通過選擇特定離子篩除部分干擾，但EI對共流出物具有普遍響應(yīng)，特異性較差；GC-MS／MS、GC-HRMS具有較好的定性和抗干擾能力、檢出限低，但其儀器購買費用和維護(hù)費用昂貴，較難在實際應(yīng)用中推廣?；瘜W(xué)電離源（CI源）作為GC-MS的另一種電離源，其負(fù)離子模式（NCI）對含有強電負(fù)性元素的化合物具有更高的選擇性和靈敏度，并且對樣品基質(zhì)中所含的脂肪、色素等雜質(zhì)也大多沒有響應(yīng)，兼具了質(zhì)譜特定離子選擇的特性，適用于含電負(fù)性元素化合物的測定。目前，GC-NCI-MS方法多應(yīng)用在多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）的檢測中［20］，對 PCBs的檢測應(yīng)用尚不多見。

魚油中PCBs的前處理方法主要為凝膠滲透色譜法（GPC），但難于一次性去除所有的油脂，需再使用不同填料填充的固相萃取小柱進(jìn)一步除去剩余的油脂和雜質(zhì)［21-23］，操作耗時長，溶劑使用量大，成本高。GB 5009.19-2014［11］中規(guī)定的食品中 indicator PCBs含量測定的第二法為GC-ECD，其前處理采用濃硫酸凈化，再結(jié)合堿性氧化鋁小柱凈化。本研究前處理與其不同之處在于：GB 5009.190-2014中使用濃硫酸凈化時，只要求上層液體無色即可，其進(jìn)一步的凈化可通過后續(xù)的固相萃取方法；而本文通過少量、多次加入濃硫酸來凈化魚油樣品，直至上、下層溶液均接近無色。整個過程有機溶劑使用量少、操作簡單、成本低。盡管前處理沒有進(jìn)一步使用固相萃取小柱凈化，但結(jié)合GC-NCI-MS的檢測特點，獲得了較好的抗基質(zhì)干擾能力以及較高的靈敏度，適用于魚油樣品中多種痕量PCBs的同時快速檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜儀（DSQ）配AS3000自動進(jìn)樣器、TR-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）（美國 Thermo 公司）。

正己烷（色譜純，德國CNW公司）；濃硫酸（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）；16種多氯聯(lián)苯（PCBs）標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為 2 mg／L，純度≥99.99%，百靈威公司）分別為：PCB77、PCB81、PCB123、PCB118、PCB114、PCB153、PCB105、PCB138、PCB126、PCB167、PCB156、PCB157、PCB180、PCB169、PCB170 和 PCB189。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)溶液用正己烷稀釋成1 μg／L和20 μg／L 的儲備液。再用正己烷將 1 μg／L 的儲備液稀釋成 0.01、0.025、0.05、0.1 μg／L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液；將 20 μg／L 的儲備液稀釋成 0.25、0.5、1、2.5、5、10 μg／L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

稱取0.3 g魚油樣品于玻璃離心管（1號管）中，加入5 mL正己烷，渦旋混勻。邊輕輕搖晃離心管邊加入1 mL濃硫酸，以3 000 r／min的速度離心8 min，吸取上清液至2號管。在2號管中加入1 mL濃硫酸，以3 000 r／min的速度離心8 min，吸取上清液至3號管。在3號管中加入1 mL濃硫酸，以3 000 r／min的速度離心8 min，取上清液，經(jīng)氮吹儀吹干，用100 μL正己烷復(fù)溶待測。

1.4 儀器條件

色譜條件：初始溫度為70℃，保持1 min；以20℃／min的速率升溫至150℃，保持2 min；以20℃／min的速率升溫至300℃，保持5 min；溶劑延遲時間為6.00 min；載氣（氦氣）流速為1 mL／min；輔助氣流速（甲烷）為1.2 mL／min；進(jìn)樣口溫度為270℃；不分流進(jìn)樣，不分流時間為1 min，進(jìn)樣量為1 μL。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度為280℃；離子源為CI，負(fù)離子模式，溫度為200℃；電子轟擊能量為70 eV；發(fā)射電流為100 μA；預(yù)四極桿電壓為 -7.8 V；選擇離子監(jiān)測模式。采用外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

魚油中大部分為脂肪，而多氯聯(lián)苯易蓄積在脂肪中，如何有效地從脂肪中提取多氯聯(lián)苯是試驗的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的方法在采用凝膠滲透色譜凈化后，還需進(jìn)一步利用弗羅里硅土小柱［15］或者堿性氧化鋁小柱［11］去除殘余的脂肪等雜質(zhì)，但處理過程耗時長、溶劑使用量大，且一些實驗室使用的自動凝膠凈化系統(tǒng)價格也較貴。因多氯聯(lián)苯化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，本實驗采用分量、多次加入濃硫酸來凈化魚油樣品，發(fā)現(xiàn)其對脂肪等雜質(zhì)的去除效果明顯，不影響待測組分的檢測。結(jié)果表明，在0.3 g魚油中加入5 mL正己烷混勻后，邊輕輕搖晃試管邊緩緩加入1 mL濃硫酸，離心后吸取上清液，再將上清液重復(fù)上述凈化過程2～3次即可得到上層以及下層均較干凈的澄清液體（見圖1）。上層提取液經(jīng)氮氣吹干后，立即加入100 μL正己烷復(fù)溶，即可上機測定。整個過程操作簡單，無需復(fù)雜的固相萃取步驟，且成本低廉、有機溶劑使用量少，適用于批量樣品的快速處理。

為比較濃硫酸凈化與其他方法在基質(zhì)干擾上的差別，樣品分別經(jīng)濃硫酸凈化、濃硫酸-弗羅里硅土凈化和濃硫酸-堿性氧化鋁凈化后，均用GC-ECD、GC-NCI-MS和GC-EI-MS 3種方法測定。

添加標(biāo)準(zhǔn)化合物（終質(zhì)量濃度為5 μg／L）的魚油樣品經(jīng)過不同的前處理凈化后在GC-ECD上的檢測效果如圖2所示，單獨濃硫酸凈化的魚油樣品譜圖基線較高，目標(biāo)化合物出峰前有較多雜峰，而經(jīng)過弗羅里硅土或堿性氧化鋁進(jìn)一步凈化后的譜圖基線降低明顯，雜峰也較少。因此在采用GC-ECD檢測時，濃硫酸處理后的魚油樣品需要進(jìn)一步的凈化。此法即為GB 5009.190-2014中的第二種方法。

GC-NCI-MS的檢測效果如圖3所示，單獨使用濃硫酸凈化樣品的譜圖與其他兩種凈化方法的效果一致，基線水平低且平穩(wěn)，雜峰比其他兩種少。王建華等［24］利用濃硫酸凈化、GC-NCI-MS測定動物源性食品中的多氯聯(lián)苯時也獲得了同樣的效果。

圖1 濃硫酸處理魚油樣品的凈化效果Fig.1 Clean－up effect of the fish oil with the treatment of sulfuric acid

圖2 添加標(biāo)準(zhǔn)化合物（終質(zhì)量濃度5 μg／L）的魚油樣品經(jīng)不同方法前處理后的GC－ECD譜圖Fig.2 Clean－up effects for the fish oil（spiked with the standards，final concentration of 5 μg／L）with different pre－treatments followed by GC－ECD

此外，還比較了只經(jīng)濃硫酸處理的樣品在GCMS兩種不同離子源（EI和NCI）上的檢測效果。如圖4所示，經(jīng)GC-EI-MS檢測的譜圖中基線約在目標(biāo)化合物開始出峰時逐漸提高，且大部分檢測到的PCBs靈敏度明顯低于GC-NCI-MS檢測結(jié)果，可見NCI源比EI源優(yōu)勢明顯。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

圖3 添加標(biāo)準(zhǔn)化合物（終質(zhì)量濃度5 μg／L）的魚油樣品經(jīng)不同方法前處理后的GC－NCI－MS譜圖Fig.3 Clean－up effects for the fish oil（spiked with the standards，final concentration of 5 μg／L）with different pre－treatments followed by GC－NCI－MS

GC-ECD對電負(fù)性物質(zhì)有選擇性響應(yīng)，具有一定的抗干擾能力，但在檢測時僅依靠保留時間進(jìn)行定性檢測；GC-EI-MS雖然可以通過選擇離子及保留時間定性，但EI響應(yīng)的選擇性較差。GC-NCIMS兼具了兩者的優(yōu)點，不僅對電負(fù)性物質(zhì)的響應(yīng)高，對大多數(shù)脂肪、色素等雜質(zhì)不響應(yīng)，而且可以通過特征離子、保留時間定性。本文通過優(yōu)化GCNCI-MS中的輔助氣流量和離子源溫度，使檢測條件達(dá)到最佳，通過不同濃度水平基質(zhì)重復(fù)加標(biāo)試驗驗證方法的可靠性及穩(wěn)定性。

2.2.1 輔助氣流速選擇

魚油中PCBs的殘留含量大多在ppt～ppb級，對儀器的檢測靈敏度要求較高。本文比較了不同輔助氣（甲烷）流速對PCBs響應(yīng)的影響。如圖5所示，PCB77、PCB81、PCB123／118、PCB114、PCB153、PCB105和PCB138（對應(yīng)圖2中1～8號色譜峰）在1.2 mL／min流速時響應(yīng)最高，而圖 5中的PCB126、PCB167、PCB156、PCB157、PCB180、PCB169、PCB170和PCB189（對應(yīng)圖2中9～16號色譜峰）在 1.5 mL／min流速時響應(yīng)最高，1.2 mL／min時的響應(yīng)次之。綜合考慮同濃度條件下低氯代、相對分子質(zhì)量相對較小的PCB77～PCB138（峰號1～8）檢測靈敏度明顯低于高氯代、相對分子質(zhì)量相對較大的PCB126～PCB189（峰號9～16），最后確定甲烷流速為1.2 mL／min。

圖4 添加標(biāo)準(zhǔn)化合物（終質(zhì)量濃度5 μg／L）的魚油樣品經(jīng)硫酸凈化后在不同離子源的GC－MS檢測效果Fig.4 Chromatograms of clean－up effects for fish oil（spiked with the standards，final concentration of 5 μg／L）with sulfuric acid pre－treatment followed by GC－MS with different ion sources

圖5 不同輔助氣（甲烷）流量對PCBs響應(yīng)影響Fig.5 Detection effect of the flow of methane（CH4）on the response of PCBs

2.2.2 離子源溫度選擇

考察了在 200、210、220、230、240 和 250 ℃不同離子源溫度下多氯聯(lián)苯的響應(yīng)，試驗結(jié)果表明：大部分多氯聯(lián)苯在200℃時響應(yīng)最高；PCB180和PCB170在210℃時響應(yīng)最高，PCB169和PCB189在250℃時響應(yīng)最高?？紤]到儀器離子源溫度依靠加熱板控溫，提高離子源溫度會縮短加熱板的使用壽命，并且16種PCBs中檢測靈敏度相對較低的低氯代多氯聯(lián)苯均在200℃時響應(yīng)最高，所以將離子源溫度設(shè)為200℃。

在優(yōu)化后的條件下，16種PCBs中除PCB123與PCB118未得到很好的分離外，其余均分離良好（見圖6）。表1中列出了16種多氯聯(lián)苯的特征離子及保留時間。

圖6 多氯聯(lián)苯（PCBs）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的GC－NCI－MS SIM譜圖Fig.6 GC－NCI－MS chromatogram of PCBs standard solution in SIM mode

2.3 線性關(guān)系、回收率、精密度和定量限

對PCBs標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行全掃描，可確定每種待測物質(zhì)的3個特征離子（見表1）及相對豐度比。樣品測定時，檢出物質(zhì)的保留時間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)化合物一致，并且出現(xiàn)的特征離子相對豐度比偏差應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)。試驗中選擇的特征離子相對強度均大于50%，相對偏差在20%以內(nèi)。

樣品中不同PCBs殘留水平差異較大，外標(biāo)法定量時采用分段標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的PCBs殘留量。16種PCBs的線性范圍為0.01～10 μg／L。各化合物分段標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好。本次所檢測的樣品中PCBs的濃度基本被包含在上述濃度范圍內(nèi)，具體的分段標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。

表1 16種PCBs的保留時間、定性離子和定量離子Table 1 Retention times，qualitative ions and quantitative ions of the 16 PCBs

在魚油中添加PCBs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其終質(zhì)量濃度分別為 0.5 μg／L 和 5 μg／L，按建立的方法進(jìn)行檢測。如表3所示，16種PCBs的基質(zhì)加標(biāo)平均回收率在62.3%～121.8%之間，平行樣（n=3）之間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.0%～11.8%之間，穩(wěn)定性較好。

以S／N=10時各化合物的濃度作為該PCB的定量限。16種PCBs的定量限在3～67 pg／g之間。以S／N=3時各化合物的濃度為檢出限，16種PCBs的檢出限在1.3～20 pg／g之間，與馬召輝等［25］的研究一致。與GC-ECD和GC-EI-MS測定結(jié)果相比，除PCB71、PCB81的檢出限相當(dāng)外，其余PCBs的檢出限均明顯低于其他兩種方法。

2.4 實際樣品測定

按本方法對魚油樣品中的PCBs進(jìn)行檢測。除檢 出 指 示 性 多 氯 聯(lián) 苯 PCB123／118、PCB153、PCB138和PCB180外，還檢出了共平面多氯聯(lián)苯PCB105，含量在0.3 ～4 μg／kg 之間。

表2 16種PCBs的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients （r），LODs and LOQs of the 16 PCBs

表3 16種PCBs基質(zhì)加標(biāo)回收率及精密度（n＝3）Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of the 16 PCBs（n ＝3）

3 結(jié)論

建立了魚油中16種PCBs的GC-NCI-MS測定方法。該方法前處理簡單、快速、靈敏度高、穩(wěn)定性好，對儀器設(shè)備要求不高，易于實際應(yīng)用推廣適用于魚油樣品中PCBs殘留的日常測定。

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