自動(dòng)真空液相色譜裝置的研制及其在五味子成分分離中的應(yīng)用

朱靖博， 劉寶月， 單世波， 丁 燕，， 寇自農(nóng)，3， 蕭 偉

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034；2.大連工業(yè)大學(xué)植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所，遼寧大連116034；3.大連工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器中心，遼寧大連116034；4.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港222001）

制備色譜是中藥分離純化過程的通用工具［1］，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、精細(xì)化工等行業(yè)，但因自身存在的成本高、周期長(zhǎng)、系統(tǒng)性及可重復(fù)性差等問題［2，3］，往往花費(fèi)大量時(shí)間、人力才能得到少量毫克級(jí)的純品［4］。因此，在現(xiàn)有色譜分離理論及技術(shù)的基礎(chǔ)上，研制自動(dòng)的制備色譜裝置以滿足中藥組分高效率分離制備需求，完成復(fù)雜藥材組分到簡(jiǎn)單組分、單一化合物的系統(tǒng)分離，可能是解決中藥研究中關(guān)鍵問題的有效方法［5，6］。

真空液相色譜（vacuum liquid chromatography，VLC）于 1979 年由 Targett等［7］命名，它利用柱后減壓，使洗脫劑迅速通過固定相，從而很好地分離樣品［8］。VLC實(shí)質(zhì)上是柱色譜，與傳統(tǒng)的柱色譜法相比，VLC具有設(shè)備簡(jiǎn)單、溶劑消耗少、回收率高、分離容量大、分離效果好，可以用薄層色譜（TLC）摸索分離條件，可以進(jìn)行梯度洗脫等優(yōu)點(diǎn)［9］，目前已成功用于萜類、木脂素、生物堿等活性天然產(chǎn)物的分離［10，11］。然而，VLC 作為一種價(jià)廉高效、簡(jiǎn)便快捷的分離技術(shù)還存在諸多不足之處，如色譜柱填料裝填不緊密導(dǎo)致柱床穩(wěn)定性較差、理論塔板數(shù)低、色譜柱效不可控；每收集一個(gè)組分便要停止減壓一次，使操作不連續(xù)［12］；供液、真空洗脫等步驟以及梯度循環(huán)過程需要人工進(jìn)行，消耗了大量的時(shí)間和人力。因此，保持柱床穩(wěn)定，最大限度減少人工操作，實(shí)現(xiàn)VLC自動(dòng)化分離，顯著提升VLC分離的優(yōu)越性是VLC研究的方向。目前尚未見有關(guān)于自動(dòng)VLC的研制并應(yīng)用于中藥組分分離的報(bào)道。

本文研制了基于動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜柱的自動(dòng)真空液相色譜（AUTO-VLC）裝置，采用可編程邏輯控制器（PLC）實(shí)現(xiàn)了分離過程的自動(dòng)控制及監(jiān)測(cè)；采用該裝置對(duì)五味子石油醚萃取物進(jìn)行分離，取得了良好的結(jié)果。AUTO-VLC的研制及其應(yīng)用對(duì)于中藥成分自動(dòng)和快速分離具有重要價(jià)值。

1 自動(dòng)真空液相色譜的研制

圖1 自動(dòng)真空液相色譜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及控制原理圖Fig.1 Structure and control principle of automatic vacuum liquid chromatographic system

1.1 設(shè)計(jì)思想

采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜柱解決了傳統(tǒng)VLC柱效不高、柱床不穩(wěn)定和變化的問題，以S7-200 PLC對(duì)分離過程的不同比例流動(dòng)相切換、不同規(guī)格色譜柱選擇、分離時(shí)間設(shè)定及餾分收集、動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜柱的自動(dòng)控制及監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)VLC對(duì)天然藥物分離純化的快速、有效、智能操控。

1.2 裝置結(jié)構(gòu)與控制

自動(dòng)VLC系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及控制原理見圖1。

AUTO-VLC由流動(dòng)相儲(chǔ)液系統(tǒng)、自動(dòng)化控制系統(tǒng)、動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜分離柱系統(tǒng)和餾分收集系統(tǒng)等4部分組成，其中流動(dòng)相儲(chǔ)液系統(tǒng)有10個(gè)1 000 mL的玻璃或不銹鋼容器，經(jīng)支管連接至10進(jìn)1出的氣動(dòng)控制閥，再經(jīng)過1進(jìn)3出的氣動(dòng)控制閥選擇性進(jìn)入3支長(zhǎng)度均為280 mm，直徑分別為80、100、150 mm的動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜柱上，以滿足不同重量植物提取物分離的需求。不同色譜柱經(jīng)過VLC分離的餾分經(jīng)過3進(jìn)1出和1進(jìn)10出的氣動(dòng)控制閥進(jìn)入由10個(gè)具有標(biāo)準(zhǔn)接口的玻璃餾分收集器，裝置中的各種氣動(dòng)控制閥均采用自主設(shè)計(jì)的電磁開關(guān)控制氣體驅(qū)動(dòng)閥。電氣自動(dòng)化控制系統(tǒng)在面板上設(shè)有信號(hào)燈、人機(jī)界面（HMI）和控制按鈕，在箱體內(nèi)設(shè)有西門子S7-200 PLC、電磁閥、動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜柱的氣驅(qū)液壓系統(tǒng)。3個(gè)動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜柱采用液壓油缸驅(qū)動(dòng)柱中活塞完成柱床裝填、壓緊、穩(wěn)定和卸填料。10個(gè)1 000 mL的具有標(biāo)準(zhǔn)接口的玻璃瓶與真空泵相連構(gòu)成餾分收集系統(tǒng)。

自動(dòng)控制系統(tǒng)中采用的西門子S7-200 PLC包括一個(gè)中央處理器（CPU）及5個(gè)擴(kuò)展模塊（控制按鈕信息模塊EM1、閥位置信息與控制模塊EM2、閥通-斷轉(zhuǎn)換模塊AM1、油缸控制模塊AM2和信號(hào)控制模塊AM3）。CPU負(fù)責(zé)執(zhí)行邏輯運(yùn)算和存儲(chǔ)數(shù)據(jù)，S7-200 PLC的用戶程序中包括閥位置邏輯控制、計(jì)數(shù)器、定時(shí)器、復(fù)雜數(shù)學(xué)運(yùn)算以及與其他智能模塊通訊等指令內(nèi)容，從而使它能夠監(jiān)視輸入狀態(tài)，改變輸出狀態(tài)以達(dá)到控制目的。控制程序使用STEP 7-Micro／WIN編程軟件作為用戶開發(fā)、編輯和監(jiān)控的應(yīng)用程序。HMI輸入和輸出是系統(tǒng)的控制點(diǎn)，輸入部分負(fù)責(zé)外部檢測(cè)裝置采集開關(guān)等狀態(tài)信號(hào)，由CPU進(jìn)行數(shù)學(xué)和邏輯運(yùn)算，其結(jié)果由輸出模件輸出，通過驅(qū)動(dòng)輸出單元控制電磁閥氣缸以及油缸運(yùn)動(dòng)方向，即可實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)中每個(gè)氣動(dòng)控制閥按照分離要求進(jìn)行通-斷轉(zhuǎn)換，完成分離過程的不同比例流動(dòng)相切換、不同規(guī)格色譜柱選擇、分離時(shí)間設(shè)定及餾分收集的自動(dòng)控制及監(jiān)測(cè)。EM1采集按鈕信息，EM2采集閥組合的位置信息，AM1負(fù)責(zé)閥的切換，AM2控制動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜柱，AM3控制信號(hào)燈，如系統(tǒng)出現(xiàn)故障時(shí)蜂鳴器就會(huì)發(fā)出聲光報(bào)警。本裝置中的氣動(dòng)控制閥為多個(gè)截止閥組成的組合閥。切換指令為時(shí)間指令，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜藶樵O(shè)定。

1.3 操作流程

當(dāng)分離樣品時(shí)，選擇相應(yīng)色譜柱上樣并在儲(chǔ)液罐內(nèi)注入不同比例的流動(dòng)相，設(shè)定抽真空時(shí)間后選擇自動(dòng)運(yùn)行方式，觸摸HMI上啟動(dòng)按鈕（或操作面板上的按鈕），設(shè)備開始運(yùn)行。閥組合按照設(shè)定時(shí)間自動(dòng)切換，流動(dòng)相連續(xù)流入到色譜柱內(nèi)，分離后的流出液進(jìn)入餾分收集器，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分離。操作人員通過HMI可知當(dāng)前的進(jìn)展過程及狀態(tài)。

2 自動(dòng)真空液相色譜的分離應(yīng)用

2.1 儀器、試劑與材料

儀器：自動(dòng)真空液相色譜（自主研制）；UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司）；HGTZF-1三用紫外分析儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；BS2245電子天平（北京賽多利斯儀器公司）；R502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

試劑：工業(yè)級(jí)乙酸乙酯、石油醚購自天津大茂化學(xué)試劑廠；分析級(jí)甲醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲酸購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；色譜級(jí)乙腈、甲醇購自美國(guó)Tedia公司。

材料：北五味子，產(chǎn)地為黑龍江。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm；大連博邁科技發(fā)展有限公司）；流動(dòng)相：乙腈（A）和0.1% （v／v）甲酸水溶液（B）；梯度洗脫程序：0 ～10 min，50%A～55%A；10～30 min，55%A ～60%A；30～52 min，60%A ～70%A；52～60 min，70%A～90%A。流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 組分樣品的分離

取1 kg五味子藥材經(jīng)乙醇80℃加熱回流提取得到 SCB-crude，經(jīng)石油醚萃取、濃縮、干燥得到SCB-ext。通過 TLC 法篩選填料、流動(dòng)相［13］，確定硅膠為分離介質(zhì)。取2 000 g硅膠（300～400目）填充至150 mm×280 mm色譜柱管內(nèi)，稱取100 g SCB-ext與200 g硅膠干法混合樣品，以石油醚／乙酸乙酯溶劑體系進(jìn)行粗分離，不同比例流動(dòng)相每份洗脫 1／6的柱體積（bed volume，BV），柱壓為 -0.6 MPa，每一份流動(dòng)相抽真空時(shí)間設(shè)為30 min，自動(dòng)收集樣品。利用TLC和HPLC檢測(cè)后合并得到S1～S6共6份樣品。

2.2.3 AUTO-VLC分離條件篩選與分離驗(yàn)證

取樣品S5用乙酸乙酯溶解，配制成質(zhì)量濃度為10 g／L的溶液并進(jìn)行薄層制備，操作條件：使用200 mm×200 mm的薄層制備板，吸附劑厚度0.4～0.6 mm，條帶點(diǎn)樣，展開劑為石油醚-乙酸乙酯（70∶30，v／v），展開至距上沿2 cm處取出，在紫外燈下標(biāo)注后刮取斑點(diǎn)I～R（見圖2），刮取的斑點(diǎn)組分用乙酸乙酯-甲醇（1∶1，v／v）溶解并過實(shí)驗(yàn)室自制的固相萃取柱（直徑1 cm，長(zhǎng)度20 cm）去除硅膠，將乙酸乙酯-甲醇（1∶1，v／v）蒸干后加入四氫呋喃溶解，并進(jìn)行HPLC分析。取薄層制備得到的樣品I～R，以石油醚-乙酸乙酯為展開劑，調(diào)整其展開劑比例使化合物在薄層板上連續(xù)多次展開，紫外燈下觀察并記錄各點(diǎn)的比移值（Rf）和相鄰斑點(diǎn)的分離度（R）［2，14］，確定樣品 S5 的梯度洗脫條件。

圖2 樣品S5及其經(jīng)自動(dòng)VLC分離后各樣品的TLC譜圖Fig.2 TLC chromatograms of sample S5 and all the samples from sample S5 after the separation by automatic vacuum liquid chromatography

應(yīng)用上述得到的梯度洗脫條件，采用80 mm×280 mm真空制備色譜柱對(duì)2.2.2節(jié)中分離得到的樣品S5進(jìn)行分離，填料為700 g 200～300目硅膠，分離操作條件同2.2.2節(jié)（樣品S5的質(zhì)量即上樣量）。利用TLC、HPLC逐一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，合并相同樣品，得到各組分或化合物。

3 結(jié)果與討論

3.1 五味子提取物的HPLC分析

根據(jù)文獻(xiàn)［15］確定反相C18色譜柱為分析柱，乙腈（A）與0.1% （v／v）甲酸水溶液（B）為流動(dòng)相，并在文獻(xiàn)［15］的色譜條件基礎(chǔ)上對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行了調(diào)整，使五味子提取物達(dá)到了較好的分離（見圖3）。

圖3 五味子乙醇提取物的HPLC譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of Schisandra chinensis（Turcz）Baill.extract with ethanol

3.2 組分樣品的分離

SCB-crude經(jīng)石油醚萃取濃縮干燥得到SCB-ext。通過TLC篩選，確定分離填料為硅膠，洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯，兩者的體積比例按極性由小到大依次為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60、35∶65、30∶70、25∶75、20∶80、15∶85、10∶90、5∶95、0∶100。100 g SCB-ext經(jīng)自動(dòng) VLC分離及 TLC、HPLC檢測(cè)后合并相同組分，共得到6個(gè)樣品S1～S6（見圖4），其質(zhì)量分別為1.12、64.86、14.24、1.7、5.71、11.5 g?？芍詣?dòng)VLC對(duì)五味子萃取物復(fù)雜組分能夠起到快速集中分段的作用，同時(shí)證明PLC對(duì)本裝置的自動(dòng)控制及監(jiān)測(cè)是有效的。

圖 4 SCB－ext及6個(gè)樣品（S1～S6）的HPLC譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of SCB－ext and the six samples（S1－S6）

3.3 AUTO－VLC分離條件篩選與分離驗(yàn)證

VLC在進(jìn)行溶劑洗脫時(shí)與制備薄層色譜的多次展開極為相似［7］，故選定 TLC多次展開作為AUTO-VLC分離條件的篩選方法。一般認(rèn)為被分離物質(zhì)對(duì)分離度較大且化合物Rf值為0.3［16］時(shí)的洗脫強(qiáng)度適合于色譜柱分離，選擇石油醚與乙酸乙酯的體積比分別為 85∶15、83∶17、81∶19、77∶23、72∶28、65∶35、55∶45 對(duì)樣品 S5 進(jìn)行連續(xù)多次展開，得到展開次數(shù)與Rf的線性函數(shù)斜率（k）的變化趨勢(shì)。由圖5可知，當(dāng)洗脫溶劑比例不斷變化時(shí)，在0＜Rf＜0.45范圍內(nèi)，k呈上升趨勢(shì)；在0.45＜Rf＜0.6時(shí)，k開始下降；0.6＜Rf＜0.8時(shí)，k下降趨勢(shì)減慢；Rf＞0.8后，k下降趨勢(shì)加快。在此基礎(chǔ)上確定了將待分離全部目標(biāo)化合物展開至Rf為0～0.45的初始展開劑為起始洗脫溶劑比例。

為有效實(shí)現(xiàn)樣品中各個(gè)化合物的分離，采用同一溶劑比例多次洗脫，洗脫次數(shù)n由TLC上Rf最小的目標(biāo)化合物（即移動(dòng)速率最慢的化合物）在此條件下的線性函數(shù)依照計(jì)算公式n≈ΔRf／k確定（假定化合物Rf與展開次數(shù)呈線性相關(guān)；ΔRf為化合物多次展開的Rf值之差）。在Rf＞0.45時(shí)，則增加極性溶劑比例，且增加趨勢(shì)不斷加大。每次洗脫體積為1／4 BV。以樣品S5為AUTO-VLC分離的樣品，以不同體積比的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，最終確定了其洗脫程序，即起始洗脫劑的比例選擇85∶15，洗脫次數(shù)由公式n≈ΔRf／k計(jì)算為12次。斜率k值依據(jù)不同比例多次展開時(shí)其變化趨勢(shì)及TLC多次展開篩選條件時(shí)不同比例洗脫劑下的k值進(jìn)行估算，從而計(jì)算梯度洗脫的次數(shù)。當(dāng)0.45 ＜Rf＜0.6 時(shí)，選擇83∶17 的洗脫劑洗脫2次，81∶19的洗脫劑洗脫2次；當(dāng)0.6＜Rf＜0.8 時(shí)，選擇77∶23 的洗脫劑洗脫3 次，72∶28 的洗脫劑洗脫4次；當(dāng)0.8＜Rf＜1時(shí)，選擇65∶35和55∶45的洗脫劑分別洗脫6次和5次（見圖5）。

圖5 斜率k的變化趨勢(shì)及石油醚－乙酸乙酯梯度洗脫的比例與體積分?jǐn)?shù)Fig.5 Variation trend of the slope k and the ratio and volume fractions of gradient elution consisting of petroleum ether－ethyl acetate

樣品S5經(jīng)AUTO-VLC分離得到34個(gè)組分（V1～V34），耗時(shí)約17 h。合并相似組分得到17個(gè)樣品，極性由小到大依次命名為1～17。在254 nm波長(zhǎng)下觀察 TLC 分離結(jié)果（見圖2），化合物 I、J、L、Q、R均得到了分離。HPLC檢測(cè)結(jié)果見圖6，其中化合物I、L、Q、R的純度大于85%，且 Q、R 的純度大于90%?？梢夾UTO-VLC分離快速且效果理想。

圖6 樣品S5中分離得到的5個(gè)化合物的HPLC譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of the five compounds from sample S5

4 結(jié)論

本文研制了AUTO-VLC裝置并用于五味子石油醚萃取物的分離。該裝置由自主設(shè)計(jì)的流動(dòng)相儲(chǔ)備系統(tǒng)、10通分流切換閥、3通切換閥、3個(gè)不同規(guī)格動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜柱、10通餾分收集閥和餾分收集器組成，采用S7-200 PLC實(shí)現(xiàn)了分離過程的不同比例流動(dòng)相切換、不同規(guī)格色譜柱選擇、分離時(shí)間設(shè)定及餾分收集的自動(dòng)控制及監(jiān)測(cè)。建立了多次TLC展開篩選VLC分離條件的方法并進(jìn)行了分離驗(yàn)證。AUTO-VLC裝置的研制實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜樣品的快速、有效、自動(dòng)化分離，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

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