氣相色譜－三重四極桿串聯質譜法測定白芍中99種農藥殘留

劉小勤， 佟 玲， 孟文婷， 孫國祥*

（1.沈陽藥科大學藥學院，遼寧沈陽110016；2.天士力控股集團研究院藥物分析所，天津300402）

我國是中藥材種植大國，然而我國在世界中藥資源市場上的占有額不高，由環(huán)境污染（如農藥殘留）引起的藥材質量問題是主要原因之一。隨著國際農藥殘留限量標準日趨嚴格，如歐盟針對植物藥中70類農藥（包括異構體及毒性代謝產物）進行了嚴格的限量規(guī)定［1］，對于沒有登記使用的農藥按照一律限量標準（0.01 mg／kg）執(zhí)行，而多數發(fā)展中國家的檢測技術難以達到這一水平，這無疑為中藥材出口增加了難度。因此，建立快速、簡便、靈敏度高的分析方法對中藥材中多種農藥殘留量進行監(jiān)測具有十分重要的現實意義。

白芍是我國常用的傳統(tǒng)中藥，為毛茛科植物，以根入藥。白芍在種植過程中易感染多種病蟲害且發(fā)病率高，濫用農藥造成了白芍的直接污染，此外，白芍生長周期長（一般3～4年［2］），土壤和空氣中殘留的農藥容易在植物組織中富集，又會對白芍產生間接污染［3］。然而，目前針對白芍中農藥多殘留缺乏系統(tǒng)性的研究，2010年Gao等［4］采用氣相色譜法測定了白芍中檢出率較高的20種農藥殘留，雖然方法靈敏度高，但電子捕獲檢測器缺乏選擇性，在實際樣品測定過程中容易產生假陽性；同年，林建［5］研究了多菌靈和三唑酮在杭白芍中的消解動態(tài)和殘留行為，但該研究僅涉及上述兩種農藥，應用性不強；2013年汪佳鳳等［6］采用氣相色譜-串聯質譜法測定了白芍中10種有機磷農藥殘留量，但檢測指標覆蓋不全，難以對白芍中多種農藥殘留進行全方位監(jiān)控。其他的文獻報道［7-9］也普遍存在以上問題。綜上，目前對白芍中多種農藥殘留量的監(jiān)控缺乏切實有效的分析方法，難以為白芍的臨床應用提供安全性保障。

本文根據歐盟對植物藥制定的農藥殘留檢測項目，針對白芍受農藥污染情況和其基質復雜的特點，利用NH2固相萃取凈化技術，同時結合三重四極桿質譜儀選擇性高、抗干擾能力強的特點，建立了99種農藥同時測定的分析方法。用基質匹配標準曲線內標法進行定量，對基質效應進行了補償。該方法靈敏度高、準確性好，滿足白芍中農藥殘留檢測的要求，同時也為其他根類藥材的多農藥殘留檢測提供借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

GCMS-TQ8030型氣相色譜-質譜聯用儀（日本SHIMADZU公司），配AOC-20i+s型自動進樣器；CF16RN型高速微量離心機（日本HITACHI公司）；R-215型旋轉蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；HZS-H型水浴振蕩器（哈爾濱市東聯電子技術開發(fā)有限公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國 Millipore公司）；XS105型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純（德國Merck公司）；實驗用水為Milli-Q超純水系統(tǒng)所制超純水；NH2固相萃取柱（500 mg／6 mL）、CARB／PSA 固相萃取柱（500 mg／500 mg／6 mL）和C18固相萃取柱（500 mg／6 mL）均為 DIKMA科技公司生產；無水硫酸鈉為優(yōu)級純（天津市光復精細化工研究所）；醋酸鈉為分析純（天津市化學試劑一廠）；99種農藥標準品購自農業(yè)部環(huán)境質量監(jiān)督檢驗測試中心和德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度大于95%；以丙酮配制成質量濃度為100～1 000 mg／L的各農藥標準儲備液，再準確量取一定體積的各農藥標準儲備液，用丙酮定容，得到質量濃度為2 mg／L的99種農藥混合標準溶液，于-18℃下避光保存。

白芍藥材購于亳州中藥材市場，產地：安徽。

1.2 樣品前處理

取白芍藥材，粉碎。取粉末4.0 g，精密稱定，置于50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入10 mL水浸潤30 min。用移液管準確加入20 mL乙酸乙酯，超聲處理30 min，向離心管中加入4 g無水硫酸鈉和1 g醋酸鈉，渦旋振搖2 min，以10 000 r／min的速度離心3 min，取上清液10 mL于150 mL圓底燒瓶中，于40℃水浴旋轉蒸發(fā)至近干，用2 mL二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）溶解，待凈化。

用3 mL 二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）預淋洗固相萃取小柱，將待凈化液轉移至柱中，用15 mL二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）分 3次淋洗小柱。流出液全部收集于100 mL雞心瓶中，于40℃水浴中旋轉濃縮至近干，用2 mL丙酮復溶，待 GC-MS／MS測定。

1.3 混合標準工作溶液的配制

向5 mL量瓶中加入適量氘代毒死蜱-D10（內標）溶液及混合標準溶液，用1.2節(jié)所述提取凈化后的空白樣品液定容至刻度。得到質量濃度分別為1、5、10、20、50、100、200、250 μg／L 基質匹配標準工作溶液，其中內標溶液的質量濃度均為50 μg／L。

1.4 GC－MS／MS 條件

GC條件 InertCap 5MS／HP氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm；日本 SHIMADZU 公司）；載氣：氦氣（純度≥99.999%），流速為 1.69 mL／min；進樣口溫度為 250 ℃；進樣量 1.0 μL，不分流進樣；升溫程序：50℃保持1 min，以25℃／min的速度升溫至125℃，再以10℃／min升溫至300℃，保持1.5 min，總運行時間為25 min。

MS條件 電子轟擊電離源（EI源）電壓為70 eV；離子源溫度200℃；接口溫度250℃；溶劑延遲時間2.8 min；碰撞氣：氬氣（純度≥99.999%）；島津GC Solution工作站。

1.5 基質效應的評價

按照美國臨床實驗室標準化委員會的定義，基質效應指樣品中除目標分析物以外的其他成分對待測物測定值的影響，即基質對分析方法準確測定分析物能力的干擾［10］?；|效應的存在能增強或抑制組分的信號響應值［11］。為了準確評價白芍基質對測定結果準確度的影響，本文同時選取兩組分別由溶劑和空白基質溶液配制的混合標準工作溶液，GC-MS／MS測定后，繪制標準工作曲線，按下式［12］計算基質效應（MF）：

其中，S溶劑指溶劑混合標準工作溶液的線性方程斜率；S基質指基質匹配標準工作溶液的線性方程斜率。

2 結果與討論

2.1 GC－MS／MS 分析參數的優(yōu)化

2.1.1 產物離子的選擇

在多農藥殘留分析中，一般判別樣品是否有農藥檢出需滿足兩個條件：首先是目標組分與對照品的保留時間相吻合；第二是在一定誤差允許范圍內，目標組分與對照品的離子比率值無顯著性差異。因此，在確定質譜參數時，定量離子和定性離子的選擇尤其重要。如果對照品中的產物離子受到背景信號的干擾將會嚴重影響定性、定量結果的準確性。如氯氟氰菊酯的兩個同分異構體中，當前體離子為m／z 197時，定性離子m／z 91受化學背景干擾大，噪聲明顯，而定性離子m／z 141的信號響應強，峰形正常，在掃描時間窗內無干擾信號（見圖1），因此將m／z 141作為氯氟氰菊酯的特征定性離子。

2.1.2 碰撞電壓的優(yōu)化

在三重四極桿串聯質譜測定過程中，一般選取m／z大、信號響應強的離子（如基峰）作為前體離子，產物離子則選擇前體離子裂解的特征性碎片，即第三個四極桿（Q3）允許通過的穩(wěn)態(tài)離子。本研究分別通過全掃描模式（Q3 scan）和碎片離子掃描模式確定目標組分的前體離子及特征產物離子，然后對前體離子生成產物離子過程中所必需的碰撞氣（CID，氬氣）的碰撞電壓（即產物離子獲得最高響應值時的碰撞能）進行優(yōu)化，以確定最終的MRM質譜參數。圖2表示在不同碰撞電壓的誘導解離作用下，敵敵畏和殺螟硫磷3組離子對的響應趨勢圖，各曲線的最高點所對應的橫坐標即代表產物離子響應最高時的作用電壓。各農藥組分質譜參數的優(yōu)化結果見表1。

圖1 氯氟氰菊酯異構體不同定性離子的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of different qualitative ions of cyhalothrin isomers

圖2 不同碰撞電壓下敵敵畏和殺螟硫磷3組產物離子的響應值Fig.2 Response values of three product ions of dichlorvos and fenitrothion under different collision voltages

表1 99種農藥及內標的保留時間及質譜分析參數Table 1 Retention times and GC－MS ／MS conditions of the 99 pesticides and internal standard

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

由于本研究選取的農藥種類多，極性相差較大，因此在考察提取溶劑時選取了3種極性適中的溶劑，分別為乙腈、乙酸乙酯和丙酮。在空白白芍基質中添加0.10 mg／kg的99種農藥及內標，按1.2節(jié)前處理步驟平行操作3份，對提取效率進行比對。實驗結果表明，當采用丙酮提取時，回收率較乙酸乙酯和乙腈低，但3組結果不存在顯著性差異，基本滿足回收率要求。樣品在提取前用水浸泡時間較長，此時農藥組分已基本從植物組織中釋放出來，因此乙腈和乙酸乙酯均能較好的提取目標組分，因乙腈毒性較大，綜合考慮，最終選取乙酸乙酯為提取溶劑。

2.2.2 SPE柱凈化效果的比較

白芍基質復雜，主要含有單萜及單萜苷類、鞣質和黃酮類等成分［13］，色素含量較少。在進行農藥殘留分析時，供試品溶液往往需要經過適當的方法凈化，否則難以獲得準確的分析結果。本研究選取3種常用的固相萃取小柱，分別為 NH2柱、CARB／PSA柱和C18柱，按1.2節(jié)下進行前處理操作，圖3為加標水平為0.05 mg／kg時各物質的回收率試驗結果（n=3）。99種物質經3種小柱凈化后回收率略有差異，其中NH2柱平均回收率為70%～120%的農藥比例最高，達 97.0%，CARB／PSA柱（85.9%）次之，C18柱（82.8%）最低。

圖3 3種固相萃取小柱的凈化效果比較Fig.3 Comparison of purification effects of three solid－phase extraction columns

NH2和CARB／PSA的凈化機理類似，其與雜質之間均存在極性相互作用和弱陰離子交換作用，對鞣酸和萜類等物質具有強吸附能力。雖然CARB／PSA中的石墨化碳還兼具吸附色素的功能，但是其特征性的正六元環(huán)結構，對平面型化合物如六六六、五氯硝基苯和四氯硝基苯等具有極強的親和力，導致這些物質的回收率普遍偏低。此外，抑菌靈和硫丹硫酸酯經過CARB／PSA柱凈化后，幾乎檢測不到其色譜峰。C18屬于非極性填料，甲胺磷極性較大，理論上不能被C18吸附，但在C18柱的流出液中并未檢測到該化合物。因此，綜合考慮方法性能，最終選擇NH2作為前處理凈化材料。

2.2.3 淋洗液及用量考察

圖4 99種農藥的基質效應Fig.4 Matrix effects of the 99 pesticides

參考農業(yè)標準NY／T 761-2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定》［14］，采用二氯甲烷以及不同比例的二氯甲烷-甲醇（體積比分別為 100∶1、100∶2、100∶3 和100∶4）混合溶劑分別淋洗氨基柱。以回收率為評價指標，結果表明，混合溶劑較單一溶劑效果好，可能是由于甲醇的加入能有效增強淋洗液的極性，使得極性較大的農藥（如有機磷類農藥）回收率顯著增加。由于不同配比的淋洗液效果相當，考慮到淋洗液極性增強，共流出雜質增多，因此最終選擇以二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）作為淋洗液。同時對淋洗液的用量進行了考察，當淋洗體積為15 mL時，各組分的回收率均滿足要求。最終確定采用15 mL二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）淋洗氨基柱。

2.3 基質效應

由基質引起的信號增強或減弱效應在農藥殘留氣相色譜分析中是非常常見的［15］，基質效應的存在對定量的準確性和重復性具有一定的影響［16，17］，白芍成分復雜，基質效應不可忽視。本文用溶劑和空白基質溶液配制的標準曲線的斜率比值來表征基質效應的大小，圖4為99種農藥在白芍基質中表現出的基質效應，當MF的值為正或者負時，代表基質增強或者抑制作用，當MF的值為0時，表示不存在基質效應。由圖4可知，各物質普遍表現為基質增強作用，抑菌靈的增強效應最大，為60%。環(huán)氧七氯A、高效氯氟氰菊酯和溴氰菊酯表現為基質抑制效應。值得注意的是，環(huán)氧七氯和氯氟氰菊酯均存在同分異構現象，各異構體在色譜柱中的保留行為不同，具體表現為保留時間的微小差異（＜0.21 min），但基質效應的趨勢卻完全相反，這一現象可能是由于基質效應與物質的化學結構及性質有關［18］。在99種農藥中，59%的農藥基質效應較小（MF介于±20%之間），97%的農藥表現為中等基質效應（MF介于±50%之間）。因此，在GC-MS／MS多農藥殘留分析中采用基質匹配標準溶液內標法對基質效應進行補償。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系和定量限

在質量濃度為0.001～0.25 mg／L范圍內，基質匹配標準工作溶液經GC-MS／MS測定后，以相對峰面積（A對照品／A內標）對相對質量濃度 C對照品／C內標作圖，繪制工作曲線，結果表明，響應值和濃度之間均顯示良好的線性關系，相關系數（r2）均大于0.99。

LOQ是指在可接受的準確性和精密度下，能夠定量測定樣品中待測成分的最低量或濃度［19］。本實驗通過向白芍空白基質中添加多個較低水平的農藥混合標準溶液分別進行基質加標試驗，每個添加水平各平行6次，所得溶液經GC-MS／MS分析，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD），回收率介于70%～120%及RSD小于20%的最低添加水平即為該物質的定量限。由表2可見，本方法的定量限范圍為0.001～0.050 mg／kg。除樂果、抑菌靈、順-氯丹、氧豐索磷砜、β-硫丹和倍硫磷氧亞砜外，其余農藥的定量限均不超過0.01 mg／kg，符合歐盟農藥殘留限量的要求。

2.4.2 回收率及重復性

本文采用標準加入法，向空白樣品中加入混合標準溶液和內標溶液，制備加標水平分別為0.05、0.10和0.20 mg／kg的樣品各6份，按上述優(yōu)化后的方法提取、凈化樣品，并進行GC-MS／MS分析，基質匹配內標法定量，計算平均回收率及精密度（RSD）。所有農藥的回收率均在66.7%～128.0%之間，RSD在2.1%～18.3%之間。

表2 99種農藥的線性范圍、檢出限、回收率及精密度（n＝6）Table 2 Linear ranges，limits of quantification （LOQ），spiked recoveries and precisions（RSDs）of the 99 pesticides（n＝6）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

2.5 樣品測定

按照所建立的方法，對來自亳州中藥材市場的13批白芍樣品進行了分析，其中4批樣品檢測到毒死蜱和p，p′-DDE這兩種農藥殘留，檢出率為31%。毒死蜱的最高殘留量為 0.023 3 mg／kg，p，p′-DDE的最高殘留量為0.015 9 mg／kg，均遠遠低于歐盟最大殘留限量0.2 mg／kg和1 mg／kg。

3 結論

本文采用氨基固相萃取凈化技術結合氣相色譜-串聯質譜聯用法建立了白芍藥材中99種農藥同時檢測的分析方法。采用基質匹配標準曲線內標法定量對基質效應進行了一定的補償。該方法準確可靠、靈敏度高，為白芍中多種農藥殘留的同時測定提供了一種有力的分析手段。

［1］ European Pharmacopoeia Commission.European Pharmacopoeia 8.0，VolumeⅠ.Strasbourg：European Directorate for the Quality of Medicines of European Council，2013：242

［2］ Yang B，Li X H，Guo C L.Modern Agricultural Science and Technology（楊斌，李憲紅，郭翠玲.現代農業(yè)科技），2013（13）：115

［3］ Wang L L，Xia H L.Chinese Traditional and Herbal Drugs（王麗麗，夏會龍.中草藥），2007，38（3）：471

［4］ Gao Q，Hua R M，Tang F，et al.Bull Environ Contam Toxicol，2010，84：779

［5］ Lin J.［MS Dissertation］.Hangzhou：Zhejiang University（林建.［碩士學位論文］.杭州：浙江大學），2010

［6］ Wang J F，Zhou S S，Wang P，et al.Chemical Analysis and Meterage（汪佳鳳，周雙生，王萍，等.化學分析計量），2013，22（2）：49

［7］ Gao Q，Hua R M，Tang F，et al.Agrochemicals（高倩，花日茂，湯鋒，等.農藥），2010，49（6）：439

［8］ Du X C，Xu Y M，Ji S，et al.Journal of Zhejiang University：Medical Sciences（杜雪純，徐毅敏，季申，等.浙江大學學報：醫(yī)學版），2012，41（1）：25

［9］ Liu Y，Gong J R，Mao X H，et al.Chinese Journal of Pesticide Science（劉銀，龔婧如，毛秀紅，等.農藥學學報），2011，13（5）：496

［10］ National Committee for Clinical Laboratory Standards.Evaluation of Matrix Effects；Approved Guideline.NCCLS document EP14-A，2001

［11］ Liu H M，Kong W J，Gong B.J Chromatogr B，2015，974：65

［12］ Gilbert-López B，García-Reyes J F，Ortega-Barrales P，et al.Rapid Commun Mass Spectrom，2007，21：2059

［13］ Ren M L.［MS Dissertation］.Shenyang：Shenyang Pharmaceutical University（任默蓮.［碩士學位論文］.沈陽：沈陽藥科大學），2009

［14］ NY／T 761-2008

［15］ Lozano A，Rajski L，Ucles S，et al.Talanta，2014，118：68

［16］ Wang D，Hou C J，Zhao E C，et al.Chinese Journal of Chromatography（王東，侯傳金，趙爾成，等.色譜），2015，33（1）：40

［17］ Ma Z L，Zhao W，Li L Y，et al.Chinese Journal of Chromatography（馬智玲，趙文，李凌云，等.色譜），2013，31（3）：228

［18］ Huang B Y，Ouyang X H，Pan C P.Chinese Journal of Pesticide Science（黃寶勇，歐陽喜輝，潘燦平.農藥學學報），2005，7（4）：299

［19］ Wang J H，Xu W Y，Sun L，et al.Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis（王京輝，許瑋儀，孫磊，等.藥物分析雜志），2012，32（9）：1704