2個產(chǎn)地續(xù)隨子種子油體提取及其脂肪酸成分的比較分析

劉金香　姚正穎　張衛(wèi)明等

摘要：油體是植物種子貯脂的細胞器，通過分離油體來提取脂類為研究植物脂類提供了方便快捷的方法。首次建立了能源植物續(xù)隨子種子油體的提取方法，提取了江蘇海安和河南朱集2個產(chǎn)地的續(xù)隨子種子油體，并通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術，分別測定油體脂肪酸的組成與含量。結(jié)果表明，2個產(chǎn)地的續(xù)隨子種子油體脂肪酸都以油酸為主，含量分別為83.32%、73.99%，其中含量較多的脂肪酸還有棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸等；2種種子中的脂肪酸以油酸（82.04%、75.63%）和棕櫚酸（6.00%、11.75%）為主，相對含量差異顯著，且油酸含量與棕櫚酸含量呈負相關，即油酸含量高的種子的棕櫚酸含量較低。

關鍵詞：能源植物；油體；提?。粴庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用技術；脂肪酸

中圖分類號：S216.2；TQ646 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0256-03

油體是植物種子貯脂的細胞器，化學組分含量因植物種類而異，且與植物生長的環(huán)境和營養(yǎng)條件有關，一般為直徑0.5～2.0 μm的彈性球體或橢球體[1-3]。油體的主要成分為中性脂（主要為三酰甘油，簡寫為TAG）、油體蛋白和磷脂（PL），其內(nèi)部為疏水的液態(tài)TAG核心，外層是由磷脂單分子層及鑲嵌的油體蛋白形成的半單位膜，油體表面具有親水特性[4]。磷脂和蛋白通過空間位阻和靜電排斥作用賦予油體顯著的物化穩(wěn)定性（抗機械攪拌、抗凍融、抗氧化等），從而阻止油體相互融合，這一特性使得油體可用離心的方法分離純化[5-6]。大戟科植物續(xù)隨子（Euphorbia lathyris）是一種優(yōu)良能源植物，其種子油脂肪酸成分以C16、C18脂肪酸為主，且油酸（只含1個不飽和雙鍵）含量高達83%[7]，與理想柴油替代品的分子組成類似。有研究表明，理想的生物柴油替代品結(jié)構特點是單不飽和脂肪酸含量高、多不飽和脂肪酸含量低、飽和脂肪酸含量適中[8]，其分子式可表示為 C19H36O2。通過離心分離續(xù)隨子種子油體，從而提取脂肪酸，再通過甲酯化制備生物柴油，可降低生物柴油制備成本。然而到目前為止，還無有關續(xù)隨子油體的報道。本研究提取續(xù)隨子種子油體，并通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術，分析了江蘇海安和河南朱集2個產(chǎn)地的續(xù)隨子種子油體脂肪酸的成分與含量，為續(xù)隨子種子油體及脂肪酸研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

將分別來源于江蘇海安和河南朱集2個產(chǎn)地的續(xù)隨子種子，于2013年10月種植于南京野生植物綜合利用研究院試驗田中，按相同的方法進行栽培管理，翌年7月成熟后收獲，收獲的種子即為本研究所用種子，簡稱為海安種子、朱集種子。

1.1.2 主要儀器 7820A氣相串聯(lián)5975質(zhì)譜檢測器，安捷倫科技有限公司；Hitachi 20PR-52D 高速冷凍離心機，日本日立工機株式會社。

1.2 方法

1.2.1 油體的提取

參考Katavic等的方法[9]并作適當改動。分別取5 g朱集種子和海安種子，在20 mL GMI（1 mmol/L EDTA、10 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、2 mmol/L DTT（雙對氯苯基三氯乙烷）、0.6 mol/L 蔗糖、0.15 mol/L Tricine-KOH，pH值7.5）中研磨成勻漿，3層紗布過濾，再加20 mL FMI（除蔗糖由0.6 mol/L換成0.4 mol/L外，其他成分與GMI相同）后，12 000 g離心20 min，上層即為粗油體層；取上層油層重懸于20 mL GMI，再加15 mL正己烷，12 000 g離心20 min；取上層油層重懸于 20 mL 的GMI中，再加15 mL FMI，12 000 g 離心20 min；最終油體層懸浮于5 mL GMI中（GMI和FMI均于4 ℃預冷）。

1.2.2 油體極性脂與中性脂的分離與提取

參考Katavic等的方法[9]并作適當改動。向分離得到的油體中加入等體積的石油醚，渦旋振蕩，12 000 g離心10 min；收集上層富含中性脂（即TAG）的石油醚相，重復上述石油醚萃取過程3次，將每次收集的上層混合，氮氣吹干。剩余部分與1.5倍體積的三氯甲烷-甲醇（體積比2 ∶1）混合，振蕩，收集下層三氯甲烷相，用1 mL甲醇-水（體積比1 ∶1）清洗2次，氮氣吹干，即得到極性脂（即PL）。將收集的油成分進行GC-MS分析。

1.2.3 脂肪酸成分的測定與分析

1.2.3.1 脂肪酸甲酯化

采用硫酸-甲醇法，對提取的油體進行脂肪酸甲酯化，其過程如下：10 μL樣品與10 μL（即 6 μg）的十七烷酸（C17 ∶0）混合作為內(nèi)標，移入帶塞玻璃試管中，在試管中加入1.5 mL硫酸甲醇溶液（5%硫酸+95%甲醇），充氮氣后密封；將試管在85 ℃下水浴1 h，冷卻，加入15 mL正己烷和1 mL水終止甲基化反應，振蕩后于 2 500 r/min 離心10 min，收集上清液，氮氣吹干后加入20 mL正己烷，取2 μL樣進行GC-MS分析。將種子研磨后，采用上述方法，對種子直接甲酯化，并進行GC-MS分析。

1.2.3.2 GC-MS 檢測條件

（1）氣相色譜條件。Agilent HP-5MS （30 m ×250 μm ×0.25 μm）毛細管色譜柱，程序升溫，初始柱溫120 ℃保持2 min，以5 ℃/min 升溫到260 ℃保持10 min；載氣為99.999%氦氣，流速1 mL/min，進樣口溫度230 ℃，接口溫度230 ℃；進樣量為2 μL，分流比30 ∶1。（2）質(zhì)譜條件。EI 離子源，離子源溫度230 ℃，MS四極桿溫度150 ℃，掃描范圍50～550 amu，溶劑延遲3.0 min。檢索標準譜庫NIST11.L，利用峰面積歸一法計算各組分相對含量。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 種子油體的提取

由圖1可知，收獲的海安種子、朱集種子外觀基本一致，千粒質(zhì)量分別為41.394、44.102 g，二者差異不顯著（P<005）。種子中的磷脂和蛋白由于空間位阻和靜電排斥作用，賦予了油體穩(wěn)定性，主要體現(xiàn)在油體的互不相溶性，這使得油體可以用離心的方法分離。在提取油體過程中，海安種子的研磨液顏色較朱集種子的研磨液黃，而最終提取的2種種子油體顏色均為乳白色，這是油體乳化的結(jié)果?？梢?，提取時的研磨過程并沒有破壞油體的結(jié)構，即在提取過程中，油體保持了表面親水、內(nèi)部疏水的基本特征，同時也顯示了油體顯著的穩(wěn)定性，這與其他植物種子油體的性質(zhì)相同[3，10]。

2.2 種子和油體的脂肪酸組成分析

海安種子、朱集種子經(jīng)GC-MS分析后共檢測出7種主要脂肪酸，其中飽和脂肪酸有4種，包括月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸和二十四烷酸；不飽和脂肪酸有3種，包括亞油酸、油酸和二十碳烯酸。種子油體經(jīng)GC-MS分析后共檢測出4種主要脂肪酸，即油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸，脂肪酸總離子流圖見圖2。從表1可知，在所檢測到的油體脂肪酸中油酸含量最高，海安種子、朱集種子油體中的油酸含量分別為8332%、73.99%，且差異顯著（P<0.05）；其次是棕櫚酸，海安種子的含量（10.56%）顯著低于朱集種子（15.97%）。2種種子油體中的亞油酸和硬脂酸含量基本相同，且差異不顯著。上述4種脂肪酸在2種種子中的含量分布情況與油體種子中的相對含量情況基本相似，均以油酸含量最高，其中海安種子的油酸含量為82.04%，顯著高于朱集種子的7563%。海安種子、朱集種子中棕櫚酸的含量在分別為600%、1175%，差異顯著（P<0.05）。

在提取油體過程中，加入正己烷是為了去除結(jié)構不完整的油體，因此得到的正己烷相含有油體破碎時產(chǎn)生的脂肪酸。GC-MS分析結(jié)果（表1）顯示，正己烷相中的脂肪酸同樣是油酸占絕大部分（海安種子為67.72%，朱集種子為7782%），其次是棕櫚酸（海安種子為26.07%，朱集種子為1609%），還有少量的亞油酸和硬脂酸。綜上所述，2種種子和油體中的脂肪酸以油酸和棕櫚酸為主，且相對含量差異顯著。種子脂肪酸中的油酸含量與棕櫚酸含量呈現(xiàn)負相關關系，即油酸含量高的種子（海安種子的82.04%>朱集種子的75.63%），則棕櫚酸含量較低（海安種子的6.00%<朱集種子的11.75%），這為能源植物續(xù)隨子的高油育種研究提供了新視角。油體中4種脂肪酸的組成比例與種子中的情況類似，這可能是因為種子中的脂肪酸大部分儲存在油體中。另外，在種子中檢測到了二十四烷酸，而油體和正己烷相中均未檢出，這可能是由于在油體的提取過程中，二十四烷酸并沒有被富集在油體提取液中。

2.3 油體極性脂與中性脂的脂肪酸組成分析

將油體中的極性脂和中性脂分離后，分別進行GC-MS檢測，分析其脂肪酸組成，結(jié)果見表2。由表2可知，油體極性脂和中性脂的主要脂肪酸均以十八碳烯酸（油酸，含1個不飽和雙鍵）為主，其次是十六烷酸。值得注意的是，在種子來源不同（海安種子和朱集種子）的中性脂中，主要的脂肪酸相對含量相似；而在極性脂中，主要的脂肪酸相對含量有較大差異，尤其是十八碳烯酸（海安種子65.64%和朱集種子7257%）和十六烷酸（海安種子21.02%和朱集種子1337%）。這種十八碳烯酸與十六烷酸呈負相關的脂肪酸組成形式與油體中脂肪酸組成形式是一致的。在油體形成過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的磷脂酰膽堿（一種極性脂）能被用于細胞膜脂和TAG（中性脂）的合成，可見極性脂與中性脂之間存在轉(zhuǎn)化關系[9]。十八碳烯酸與生物柴油的理想分子相近[8]，因此在續(xù)隨子的定向育種中可以考慮十八碳烯酸與十六烷酸的負相關關系，即提高十八碳烯酸含量，降低十六烷酸含量。在油體的結(jié)構組成中，中性脂（TAG）占據(jù)了絕大部分空間，而極性脂（磷脂）只存在于油體的表面，因此中性脂含量比極性脂含量多很多；另外，在中性脂中還檢測到了二十碳烯酸，而極性脂中檢測到了十二碳烷酸。

3 結(jié)論

本研究建立了能源植物續(xù)隨子種子油體的提取方法，提取了來源于江蘇海安和河南朱集2個產(chǎn)地的續(xù)隨子種子油體。結(jié)果顯示，海安種子和朱集種子油體的脂肪酸以油酸（83.32%和73.99%）和棕櫚酸（10.56%和15.97%）為主；種子中的脂肪酸以油酸（82.04%和75.63%）和棕櫚酸（600%和1175%）為主，且油酸含量與棕櫚酸含量呈負相關。

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