多倍體川貝母脫毒苗的誘導

江明殊　王躍華　劉濤等

摘要：以有效組分含量高的多倍體川貝母鱗莖芽為研究對象，開展快速獲得脫毒苗的培養(yǎng)研究。結(jié)果表明，對多倍體川貝母鱗莖芽誘導不定根選取在35 ℃高溫預(yù)脫毒處理后，選取生長狀況好的不定根，切取其長度為0.4 mm的生長點區(qū)域進行培養(yǎng)，不僅愈傷組織誘導率高（57.89%），而且經(jīng)檢測其脫毒效果也最好（脫毒率為92.87%）。最佳多倍體脫毒鱗莖芽誘導培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA，培養(yǎng)40 d后出芽率達到77.31%；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA，培養(yǎng)30 d后生根率為8917%。

關(guān)鍵詞：川貝母；多倍體；脫毒苗；誘導；愈傷組織

中圖分類號： Q945.39 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0041-02

川貝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）是百合科多年生草本植物，具有清熱潤肺、化痰止咳之功效，是稀有的治療咳嗽等的良藥[1]，由于川貝母價格昂貴，加上近年來無計劃盲目地采挖，使其自然資源日趨枯竭[2-3]，這種狀況預(yù)計在近幾十年內(nèi)也難以緩解。川貝母植物的繁殖常采用以種子進行的有性生殖和以鱗莖進行的無性繁殖2種方式。無論是哪種方式，對于多年生的川貝母植物都會因各種環(huán)境因素而使其染上病毒，而且經(jīng)過長期繁殖，這些病毒會在細胞體內(nèi)不斷累積，從而嚴重抑制其生長，此外其性狀、產(chǎn)量等也會受到影響，最終造成川貝母藥材的品質(zhì)和產(chǎn)量大大地下降。

無論是適應(yīng)性還是生活力，多倍體植物與二倍體植物相比都有許多優(yōu)勢。例如，多倍體植物因基因數(shù)目增多、基因活性及酶的差異性增強，其生態(tài)適應(yīng)性和對逆境的抗耐性較高[4]；隨著藥用植物基因倍性的增加，通常還能導致次生代謝產(chǎn)物含量的變化，從而得到有效含量較高的產(chǎn)物。已有報道表明，藥用植物多倍體可大幅度提高藥材的產(chǎn)量[5-7]，而且筆者所在課題組也在前期研究中發(fā)現(xiàn)多倍體川貝母的有效含量比自然野生二倍體川貝母高得多。將川貝母植物的脫毒苗培育技術(shù)和多倍體誘導技術(shù)進行有機結(jié)合，能培育出品質(zhì)優(yōu)良、生長速度快、有效組分含量高和抗逆性強的多倍體川貝母脫毒苗，有利于川貝母大規(guī)模生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗材料來自成都大學組培實驗室培育的多倍體川貝母鱗莖。

1.2 試驗方法

1.2.1 多倍體不定根的獲得 將多倍體川貝母組培鱗莖先接種于1/2MS+0.2 mg/L IBA的培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為 21 ℃、光照時間6 h/d且光照度為1 000 lx的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，獲得形狀粗大的不定根。

1.2.2 多倍體脫毒愈傷組織的誘導培養(yǎng) 將多倍體不定根從根基部切下后接入MS+0.3 mg/L 6-BA+150 mL/L甘油的培養(yǎng)基中，設(shè)置不同溫度條件（35、36、37、38、39、40 ℃，分別記為A1、A2、A3、A4、A5、A6處理）且在無光照條件下進行20 d預(yù)培養(yǎng)處理，觀察不定根的生長狀況，20 d后統(tǒng)計經(jīng)上述不同方法處理的不定根成活率。選取最佳溫度處理的不定根，在超凈工作臺上切取根尖生長點處0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mm 區(qū)域的細胞（分別記為B1、B2、B3、B4、B5處理），將其接入pH值為5.8的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，在溫度18 ℃、光照時間6 h/d、光照度800 lx的條件下培養(yǎng) 30 d，獲得多倍體愈傷組織，觀察統(tǒng)計愈傷組織誘導率和生長情況。

1.2.3 病毒檢測 采用雙抗體夾心ELISA方法[8]（DAS-ELISA）對培育的川貝母多倍體愈傷組織進行病毒檢測。

1.2.4 鱗莖芽的誘導 選取質(zhì)地較緊密、生長速度快且顏色為黃白色或淡黃色的多倍體愈傷組織，將其接入添加0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L 6-BA，0、0.2 mg/L IAA不同濃度激素的多倍體鱗莖芽誘導MS培養(yǎng)基（分別記為C0、C1、C2、C3、C4處理）中，同時以不添加任何激素的MS培養(yǎng)基為對照，在培養(yǎng)溫度為20 ℃、光照時間16 h/d、光照度為2 000 lx的條件下培養(yǎng)20 d，獲得川貝母多倍體鱗莖芽。

1.2.5 多倍體鱗莖芽的生根培養(yǎng) 在超凈臺上切取生長20 cm的多倍體鱗莖芽作為無根苗，將其轉(zhuǎn)入添加不同濃度NAA （0、0.2 mg/L）、IBA （0、0.1、0.2、0.3 mg/L）激素的1/2MS 生根培養(yǎng)基（分別記為D1、D2、D3、D4處理）中誘導生根，30 d后觀察記錄鱗莖芽的生根情況。

1.2.6 煉苗和移栽 選取長出2條以上不定根的川貝母多倍體脫毒苗，打開瓶蓋，在室內(nèi)煉苗3～5 d后從培養(yǎng)瓶中取出，洗去不定根上的培養(yǎng)基，移栽至消毒后的松軟土壤中生長。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理溫度對不定根生長的影響

本研究采用高溫作為多倍體川貝母脫毒的前期處理方法，從表1可以看出，隨著溫度的增加，外植體的成活率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。當溫度為35 ℃時，成活率最高，為6309%；而溫度升到40 ℃時，成活率最低，只有27.12%。符國芳曾報道，對外植體的熱處理脫毒通常在35～54 ℃較適宜[9]，本研究選取了35～40 ℃作為試驗條件，雖然有報道稱溫度越高對脫毒的效果越好，但從試驗結(jié)果可以看出，高溫對外植體存活率的影響也是較大的。綜合整體因素考慮認為，35 ℃時為不定根前期脫毒的最佳溫度。

2.2 不同根尖長度對脫毒效果的影響

外植體的大小同樣會影響脫毒的效率[10]，通常情況下采用莖尖脫毒所選取的莖尖大小一般為0.1～0.5 mm，高于這個范圍值脫毒效果不好，太低又不利于愈傷組織的形成。從表2可以看出，選取不同根尖長度對脫毒的影響有著類似的結(jié)果，隨著根尖長度的不斷增加，脫毒率基本逐漸降低，但是愈傷組織誘導率卻與之成反比。例如，0.2 mm根尖長度的脫毒率最好，達到了95.16%，但是其愈傷組織誘導率只有2216%；1.0 mm根尖長度的脫毒率僅有63.13%，而愈傷組織誘導率卻是所取根尖長度中最高的，達到了93.64%。綜合整體因素考慮可知，選取根尖長度為0.4 mm時為最佳，其脫毒率在5個處理中較高，為92.87%，并且其愈傷組織也較易形成，誘導率達到了57.89%。