高密度雙菌型復(fù)合微生態(tài)制劑發(fā)酵條件的研究

張恒慧，續(xù)繁星，李曉宇，任曉莉，王曉麗，徐永平，5，*（.太原工業(yè)學(xué)院，山西太原00008；2.大連理工大學(xué)，遼寧大連6024；.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)006；4.大連理工大學(xué)動(dòng)物性食品安全保障技術(shù)教育部工程研究中心，遼寧大連6600；5.大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司，遼寧大連6600）

高密度雙菌型復(fù)合微生態(tài)制劑發(fā)酵條件的研究

張恒慧1，2，續(xù)繁星3，李曉宇2，4，任曉莉1，王曉麗1，徐永平2，4，5，*
（1.太原工業(yè)學(xué)院，山西太原030008；2.大連理工大學(xué)，遼寧大連116024；3.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110016；4.大連理工大學(xué)動(dòng)物性食品安全保障技術(shù)教育部工程研究中心，遼寧大連116600；5.大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司，遼寧大連116600）

摘要：通過(guò)單因素試驗(yàn)分別研究初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量等因素對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的影響，隨后通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：雙菌型復(fù)合微生態(tài)制劑的最優(yōu)發(fā)酵條件為凝結(jié)芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的菌種配比1∶2，培養(yǎng)溫度37℃，初始pH 6.8，接種量4%。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，復(fù)合微生態(tài)制劑發(fā)酵菌體濃度達(dá)7.75×109cfu/mL。

關(guān)鍵詞：凝結(jié)芽孢桿菌；嗜酸乳桿菌；復(fù)合微生態(tài)制劑；發(fā)酵條件

微生態(tài)制劑是一類(lèi)可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群平衡來(lái)抑制腸道病原菌或促進(jìn)機(jī)體健康從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有利影響的活菌制劑[1]。微生態(tài)制劑能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道功能紊亂、提高動(dòng)物機(jī)體免疫力，相比較抗生素的抑菌作用，可以有效避免耐藥性、藥物殘留、和二重污染等副作用[2-4]。目前微生態(tài)制劑制品以單菌型微生態(tài)制劑研究較多，而且以發(fā)酵乳居多，其他營(yíng)養(yǎng)物的發(fā)酵產(chǎn)品較少，如凝結(jié)芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌益生菌等的發(fā)酵乳制劑[5-7]。然而檢驗(yàn)微生態(tài)制劑發(fā)酵結(jié)果的重要指標(biāo)就是發(fā)酵液中的活菌數(shù)，如何提高發(fā)酵液中活菌數(shù)是微生態(tài)制劑發(fā)酵條件研究的重點(diǎn)之一。

動(dòng)物腸道是一個(gè)多菌生長(zhǎng)的復(fù)雜環(huán)境，正常情況下，多種益生菌協(xié)調(diào)生長(zhǎng)，各自最適生長(zhǎng)條件又不完全相同，在一定范圍內(nèi)可能發(fā)揮著接力益生作用[8]。芽孢桿菌類(lèi)益生菌（如凝結(jié)芽孢桿菌）為好氧繁殖，進(jìn)入人和動(dòng)物腸道內(nèi)能消耗大量的游離氧，并在腸道內(nèi)定植，降低氧化還原電勢(shì)，有利于腸道內(nèi)厭氧微生物細(xì)菌如乳酸菌、雙歧桿菌的生長(zhǎng)；嗜酸乳桿菌是兼性厭氧菌，耐熱性差，耐酸性較強(qiáng)，能在其他乳酸菌不能生長(zhǎng)的環(huán)境中（低pH，高膽鹽）生長(zhǎng)繁殖[9-11]。因此，多菌型微生態(tài)制劑在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中可以較長(zhǎng)時(shí)間保持一個(gè)比較高的活菌濃度，對(duì)環(huán)境變化（如產(chǎn)酸pH變化）的適應(yīng)更強(qiáng)，最終發(fā)酵液能保持一個(gè)更長(zhǎng)時(shí)期的高活菌濃度。

本文主要研究發(fā)酵條件（溫度、初始pH、接種量、菌種配比）對(duì)雙菌型復(fù)合微生態(tài)制劑活菌濃度的影響，并且設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，對(duì)高活菌數(shù)復(fù)合微生態(tài)制劑的制備進(jìn)行初步探索，同時(shí)為不同益生菌接力發(fā)揮益生作用的理論提供初步研究依據(jù)，為進(jìn)一步大規(guī)模優(yōu)化發(fā)酵條件提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌種

凝結(jié)芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌：太原工業(yè)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2材料與試劑

胰蛋白胨、酵母浸粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；BL培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、無(wú)水乙醇、濃鹽酸、瓊脂粉、EDTA、甘油等：均為分析純。

1.1.3儀器與設(shè)備

SW-C1-LED型超潔凈工作臺(tái)、BPX-52型生化培養(yǎng)箱、YXQ—LS—18SI型高壓滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；AY220型電子天平：日本島津制作所；MP512-01型精密pH計(jì)：上海三信儀表廠；752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥器：北京市光明醫(yī)療器械廠；OLYMPUS光學(xué)顯微鏡。

1.1.4培養(yǎng)基與種子的制備

活化培養(yǎng)基為10%脫脂乳：脫脂乳粉100 g加蒸餾水至1 000 mL，121℃高壓滅菌15 min，備用。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉8.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.04 g，吐溫80 1.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，121℃高壓滅菌15 min，備用。

BL瓊脂培養(yǎng)基：肝浸粉4.0 g，蛋白胨5.0 g，牛肉浸粉3.0 g，胰酪蛋白胨5.0 g，可溶性淀粉0.5 g，L-半胱氨酸0.5 g，葡萄糖10.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，磷酸氫二鉀1.0g，大豆胨3.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸亞鐵0.01g，氯化鈉0.01 g，瓊脂20.0 g，硫酸錳0.006 7 g，吐溫80 1.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，121℃高壓滅菌15 min，備用。

MRS瓊脂培養(yǎng)基：1 000 mL MRS液體培養(yǎng)基加入14.0 g瓊脂粉。

1.2方法

1.2.1菌種活化、傳代、純化和擴(kuò)培

將實(shí)驗(yàn)室甘油冷凍保藏的凝結(jié)芽孢桿菌用10%的滅菌脫脂乳活化3次，活化溫度為37℃，涂布接種于BL瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h～16h，長(zhǎng)出單個(gè)菌落擴(kuò)培后再涂布接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h～16 h，待長(zhǎng)出單個(gè)菌落，隨機(jī)挑取半數(shù)單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，確定是否純種；挑取確認(rèn)純種的菌落接種到MRS液體培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)培。取實(shí)驗(yàn)室保藏的嗜酸乳桿菌按照上述操作，獲得純種擴(kuò)培菌液。

1.2.2種子液的制備

分別將凝結(jié)芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的活化擴(kuò)培菌液接種于種子培養(yǎng)基（MRS液體培養(yǎng)基），于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h。

1.2.3菌液濃度與OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

凝結(jié)芽孢桿菌種子液接種于滅菌MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)2 h后每隔2 h取發(fā)酵液作觀測(cè)點(diǎn)，共取5個(gè)點(diǎn)；將每個(gè)點(diǎn)的發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布于MRS瓊脂平板，每組取3個(gè)平行，37℃培養(yǎng)待平板長(zhǎng)出單菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)；同時(shí)以空白MRS培養(yǎng)基為對(duì)照調(diào)零，在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)取各點(diǎn)對(duì)應(yīng)的OD值；根據(jù)平板計(jì)數(shù)法得到的菌濃度和對(duì)應(yīng)的吸光度值便可繪制出細(xì)菌生長(zhǎng)的OD標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用嗜酸乳桿菌重復(fù)上述步驟，繪制嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的OD標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4復(fù)合微生態(tài)制劑發(fā)酵的單因素試驗(yàn)

1）測(cè)定兩種菌生長(zhǎng)曲線

將活化的凝結(jié)芽孢桿菌種子液以3%的接種量于體積恒定、pH為7.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，分別隔1、2、3、4、6、8、10、12、14 h測(cè)定其在波長(zhǎng)為600 nm處的光密度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。依上述試驗(yàn)操作，測(cè)定嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)曲線。

2）測(cè)定最適初始pH

配制所需pH的MRS液體培養(yǎng)基的滅菌備用，每個(gè)pH做3個(gè)試管平行對(duì)照，每管裝10 mL；將活化的菌種以3%接種量接種于試管；37℃培養(yǎng)12 h，以相應(yīng)pH的MRS液體培養(yǎng)基做空白對(duì)照，測(cè)定其在600 nm處的OD值。設(shè)置初始pH：凝結(jié)芽孢桿菌pH設(shè)為6.0、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5；嗜酸乳桿菌pH設(shè)為4.5、5.0、5.6、5.8、6.0、6.5。

3）測(cè)定最適溫度

將MRS液體培養(yǎng)基分裝（每支試管10 mL），115℃，20 min滅菌后，以3%的接種量接入待測(cè)菌種；培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為31、34、37、40、43、46℃，每個(gè)溫度作3個(gè)平行，培養(yǎng)12 h后測(cè)定菌液OD值。

4）測(cè)定最適接種量

凝結(jié)芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌分別按1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量將活化的菌種接種于10 mL滅菌MRS液體培養(yǎng)基，每個(gè)梯度做3個(gè)平行，37℃培養(yǎng)12 h，測(cè)定發(fā)酵液OD值。

1.2.5正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)復(fù)合微生態(tài)制劑發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化復(fù)合微生態(tài)制劑的發(fā)酵條件，確定單因素試驗(yàn)中影響比較大的兩種菌配比、培養(yǎng)溫度、初始pH為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以獲取雙菌型復(fù)合微生態(tài)制劑的最佳發(fā)酵條件，具體影響因素、添加水平及各因素間不同水平組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，優(yōu)化發(fā)酵條件。

表1　發(fā)酵條件正交試驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì)Table 1　Factors and levels of orthogonal experiment

2　結(jié)果與分析

2.1菌液濃度OD標(biāo)準(zhǔn)曲線

菌液濃度是檢驗(yàn)乳酸菌發(fā)酵結(jié)果的重要指標(biāo)，利用菌液濃度和OD值的正比例關(guān)系，可以將菌液濃度的測(cè)定轉(zhuǎn)換為菌液OD值的測(cè)定。制作菌液濃度的OD標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以快速獲得菌液濃度。凝結(jié)芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的OD標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌OD標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　OD standard curve of Bacillus coagulans

圖2 嗜酸乳桿菌OD標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　OD standard curve of Lactobacillus acidophilus

其中凝結(jié)芽孢桿菌標(biāo)曲擬合方程為y=3.531 8x+ 3.997 7，R2=0.994 2，嗜酸乳桿菌標(biāo)曲擬合方程為y= 1.86x+6.832 1，R2=0.992 6，線性擬合良好。

2.2乳酸菌生長(zhǎng)曲線

研究生長(zhǎng)曲線，可以分清楚乳酸菌4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子液進(jìn)行接種，同時(shí)研究乳酸菌生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖3和圖4。

圖3　凝結(jié)芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.3　Growth curve of Bacillus coagulans

圖4 嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.4　Growth curve of Lactobacillus acidophilus

如圖3所示，凝結(jié)芽孢桿菌生長(zhǎng)0～3 h為延遲期，3 h～12 h為對(duì)數(shù)期，12 h以后趨于平穩(wěn)；如圖4所示，嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)0～4 h為延遲期，4 h～12 h為對(duì)數(shù)期，12 h達(dá)到穩(wěn)定期趨于平緩。

2.3初始pH對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

乳酸菌細(xì)胞對(duì)環(huán)境pH非常敏感，不同種乳酸菌細(xì)胞內(nèi)代謝有所差異，其最適pH也有所不同。本試驗(yàn)分別研究了初始pH對(duì)兩種乳酸菌生長(zhǎng)的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

圖5　初始pH對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.5　Effect of initial pH value on the growth of Bacillus coagulans

圖6　初始pH對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.6　Effect of initial pH value on the growth of Lactobacillus acidophilus

從圖中結(jié)果看出，凝結(jié)芽孢桿菌的初始pH為7.0時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)最高；嗜酸乳桿菌初始pH為6.0時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)最高。

2.4溫度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

不同乳酸菌的最適生長(zhǎng)溫度在一定范圍內(nèi)有所差異，本試驗(yàn)分別研究了不同發(fā)酵溫度對(duì)兩種乳酸菌生長(zhǎng)的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。

圖7　溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.7　Effect of temperature on the growth of Bacillus coagulans

圖8　溫度對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.8　Effect of temperature on the growth of Lactobacillus acidophilus

由圖中可以看出，凝結(jié)芽孢桿菌在37℃～40℃之間的活菌濃度都比較高，最適生長(zhǎng)溫度為38℃；嗜酸乳桿菌在37℃時(shí)活菌濃度明顯較高，最適生長(zhǎng)溫度為37℃。

2.5接種量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)研究了不同接種量對(duì)兩種乳酸菌生長(zhǎng)的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9和圖10。

圖9　接種量對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.9　Effect of inoculating quanity on the growth of Bacillus coagulans

圖10　接種量對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.10　Effect of inoculating quanity on the growth of Lactobacillus acidophilus

從圖中可以看出接種量的不同對(duì)發(fā)酵液的活菌數(shù)有一定的影響，凝結(jié)芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌都以4%的接種量獲得的活菌數(shù)最高。當(dāng)接種量從較低水平提高時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)接種量超過(guò)4%，發(fā)酵液活菌數(shù)有所下降，可能是接種量大，后期由于營(yíng)養(yǎng)缺乏導(dǎo)致部分菌體死亡。綜合考慮種子液的使用量和活菌數(shù)的含量，選擇4%的接種量為宜。

2.6復(fù)合微生態(tài)制劑發(fā)酵條件的優(yōu)化

雙菌型復(fù)合微生態(tài)制劑發(fā)酵條件的正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　發(fā)酵條件正交優(yōu)化試驗(yàn)安排、結(jié)果及直觀分析Table 2　The arrangement，results and direct analysis of orthogonal experiment

由表2極差分析可知，影響雙菌型微生態(tài)制劑發(fā)酵活菌數(shù)因素主次關(guān)系為：A>B>C，最優(yōu)方案為A3B1C3。對(duì)應(yīng)的發(fā)酵條件為：凝結(jié)芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的菌種配比為1∶2；培養(yǎng)溫度為37℃；初始pH為6.8。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，復(fù)合微生態(tài)制劑發(fā)酵菌體濃度達(dá)7.75×109cfu/mL。

3　結(jié)論

通過(guò)發(fā)酵條件單因素和正交試驗(yàn)確定該復(fù)合微生態(tài)制劑的最優(yōu)發(fā)酵條件，即凝結(jié)芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的菌種配比為1∶2；培養(yǎng)溫度為37℃；初始pH 為6.8；接種量4%。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，復(fù)合微生態(tài)制劑發(fā)酵菌體濃度達(dá)7.75×109cfu/mL。相比較文獻(xiàn)中記錄的以及試驗(yàn)中的單菌型微生態(tài)制劑的活菌濃度有所提高。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.041

收稿日期：2015-08-12

基金項(xiàng)目：太原工業(yè)學(xué)院校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（2014LQ01）

作者簡(jiǎn)介：張恒慧（1988—），男（漢），助教，碩士，從事微生態(tài)制劑及動(dòng)物腸道性疾病防治研究。

*通信作者

Study on High Cell Density Culture of Compound Bi-Probiotics

ZHANG Heng-hui1，2，XU Fan-xing3，LI Xiao-yu2，4，REN Xiao-li1，WANG Xiao-li1，XU Yong-ping2，4，5，*
（1.Taiyuan Institute of Technology，Taiyuan 030008，Shanxi，China；2.Dalian University of Technology，Dalian 116024，Liaoning，China；3.Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，Liaoning，China；4.Center for Food Safety of Animal Origin，Ministry of Education，Dalian University of Technology，Dalian 116600，Liaoning，China；5.SEM Bio-Engineering Technology Co.Ltd.，Dalian 116600，Liaoning，China）

Abstract：This paper mainly studied the high cell density culture conditions of compound probiotics with Bacillus coagulans and Lactobacillus acidophilus.In single factor trials，initial pH value，temperature，inoculating quanity were taken as considered factors.The optimal culturing conditions obtained from the orthogonal experiment were：mixture ratio（Bacillus coagulans∶Lactobacillus acidophilus）1∶2，temperature 37℃，initial pH 6.8，inoculating quanity 4%.With the optimal conditions，the cell density of compound probiotics could reach as high as 7.75×109cfu/mL.

Key words：Bacillus coagulans；Lactobacillus acidophilus；compound probiotics；fermentation conditions