連翹葉多糖對(duì)小鼠免疫功能影響的研究

張岫秀，蔡盈，吳中梅，高勇（.徐州市兒童醫(yī)院，江蘇徐州22006；2.徐州市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，江蘇徐州22006）

連翹葉多糖對(duì)小鼠免疫功能影響的研究

張岫秀1，蔡盈1，吳中梅1，高勇2，*
（1.徐州市兒童醫(yī)院，江蘇徐州221006；2.徐州市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，江蘇徐州221006）

摘要：研究連翹葉多糖對(duì)環(huán)磷酰胺（CTX）所致免疫低下模型小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能。采用腹腔注射環(huán)磷酰胺制造免疫抑制小鼠模型，考察不同劑量連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠臟器指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬功能、淋巴細(xì)胞增殖活性、血清IL-2和IL-4水平、溶血素水平和溶血空斑形成數(shù)量的影響。連翹葉多糖能明顯提高環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬能力、脾淋巴細(xì)胞的增殖能力、血清中IL-2和IL-4水平、溶血素含量和溶血空斑形成數(shù)量。連翹葉多糖具有良好的免疫增強(qiáng)活性，在藥品與功能食品的開(kāi)發(fā)中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：連翹葉；多糖；免疫功能

連翹（Forsythia suspense）為木犀科植物，是我國(guó)一種傳統(tǒng)的中藥材，廣泛分布在河北省太行山地區(qū)，主要含有連翹酚、連翹苷、連翹苷元、齊墩果酸、甾醇化合物、醛酮類(lèi)、醇酯醚類(lèi)揮發(fā)性成分[1]，具有抗菌消炎、清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱等功效。連翹果實(shí)為連翹的主要入藥部位，而大量的連翹葉卻未得到充分利用，大部分被直接廢棄，造成資源浪費(fèi)。近年來(lái)，已有學(xué)者對(duì)連翹葉片黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)等成分進(jìn)行了研究[2]，而關(guān)于連翹葉片多糖類(lèi)物質(zhì)的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。多糖一般是由10個(gè)及以上單糖以α-糖苷鍵或β-糖苷鍵以不同的方式連接而成的極性大分子化合物，因其具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、降血壓、降血脂、免疫調(diào)節(jié)活性[3-5]而得到廣泛關(guān)注和研究。本研究以連翹葉為原料，采用水提醇沉方法制備得到連翹葉粗多糖，研究了該多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響。

1　試驗(yàn)材料

環(huán)磷酰胺（批號(hào)：H14023686）：山西普德藥業(yè)股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基：上海浩然生物技術(shù)有限公司；刀豆素A（ConA）：北京中生瑞泰科技有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）：北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）：北京索萊寶科技有限公司；白細(xì)胞介素-4（IL-4）試劑盒：美國(guó)BD公司；白細(xì)胞介素-2（IL-2）試劑盒：美國(guó)BD公司；DEAE-Cellulose52：上海純優(yōu)生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FD-1B-50冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；752PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；MK3型酶標(biāo)儀：Thermo Fisher。

連翹葉：購(gòu)于安徽亳州；雞：健康家雞；豚鼠：健康豚鼠。

2　方法

2.1連翹葉多糖制備與含量測(cè)定

水提醇沉法制備連翹葉粗多糖[6]，粗多糖經(jīng)Sevag法脫除蛋白，采用DEAE-Cellulose52柱層析分離獲得高純度連翹葉多糖。制備連翹葉片干粉，超聲提取兩次，過(guò)濾并合并濾液，濃縮，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜，離心取沉淀，真空干燥，得到連翹葉片粗多糖。粗多糖首先經(jīng)Sevag法脫除蛋白3次，然后采用DEAE-Cellulose52柱層析分離，分別采用蒸餾水和0.5 mol/L NaCl洗脫，合并洗脫液，濃縮干燥，獲得高純度連翹葉多糖。采用苯酚-硫酸法[7]測(cè)定連翹葉片多糖含量。

2.2連翹葉多糖免疫活性測(cè)定

2.2.1小鼠造模、分組與給藥

小白鼠（昆明種）購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室，雌雄各半，體重18 g～22 g，正常飼養(yǎng)適應(yīng)一周，將小鼠隨機(jī)分成5組，即正常組、模型組和給藥組（連翹葉多糖高、中、低劑量組），每組10只，雌雄各半，各組體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。正常組每天灌胃生理鹽水0.3 mL和腹腔注射生理鹽水0.3 mL，模型組每天灌胃生理鹽水0.3 mL和腹腔注射CTX 20 mg/kg。3個(gè)給藥組每天分別灌胃0.3 mL不同濃度的連翹葉多糖（高、中、低劑量分別為300、150、75 mg/kg）溶液，同時(shí)腹腔注射CTX 20 mg/kg。

2.2.2免疫器官臟器指數(shù)的測(cè)定[8]

按“2.2.1”方法進(jìn)行小鼠分組、造模和給藥處理。給藥一周后將小鼠脫頸椎處死，于無(wú)菌條件下剝?nèi)∑⑴K、胸腺器官稱(chēng)重，計(jì)算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)按式（1）計(jì)算。

臟器指數(shù)/（mg/g）=器官質(zhì)量/體質(zhì)量（1）

2.2.3腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定[9]

按“2.2.1”方法進(jìn)行小鼠分組、造模和給藥處理。給藥一周后腹腔注射5%的雞紅細(xì)胞0.5 mL進(jìn)行免疫，10 h后處死，剪開(kāi)腹部皮膚并用2 mL生理鹽水沖洗腹腔，吸取沖洗液滴于載玻片上，37℃孵育30 min，用生理鹽水漂洗，干燥后用丙酮和甲醇等比例混合溶液固定6 min～10 min，瑞氏染液染色，然后油鏡下觀察并計(jì)數(shù)，計(jì)算巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)，吞噬率及吞噬指數(shù)分別按式（2）和式（3）計(jì)算。

2.2.4脾淋巴細(xì)胞增殖活性的測(cè)定[10]

取“2.2.2”方法所得小鼠脾臟，常規(guī)制備脾細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，各取400 μL至96孔培養(yǎng)板中，加入200 mg/L ConA溶液10 μL，培養(yǎng)基代替ConA溶液做對(duì)照，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h各取上清液200 μL，加入已除菌的5 mg/mL MTT溶液40 μL，繼續(xù)培養(yǎng)至結(jié)束。離心保留沉淀，各加入37℃DMSO300μL，振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光值，計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)，淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)按式（4）計(jì)算。

式中：A處理為加ConA孔吸光值；A對(duì)照為空白孔吸光值。

2.2.5血清中IL-2、IL-4的測(cè)定

按“2.2.1”方法進(jìn)行小鼠分組、造模和給藥處理。給藥一周后各組小鼠摘眼球取血，3 000 r/min離心15 min，取血清，按試劑盒的說(shuō)明操作，檢測(cè)各組小鼠血清中IL-2和IL-4水平。

2.2.6溶血素及溶血空斑形成測(cè)定[11]

按“2.2.1”方法進(jìn)行小鼠分組、造模和給藥處理。給藥第一天，小鼠腹腔注射5%的雞紅細(xì)胞0.3 mL進(jìn)行免疫，末次給藥1 h后摘取眼球取血，離心，取血清用生理鹽水稀釋100倍，取稀釋血清2mL、5%雞紅細(xì)胞1 mL和10%新鮮豚鼠血清1 mL，混勻，以生理鹽水代替豚鼠血清做空白對(duì)照，37℃保溫30 min，4℃離心，取上清液，于540 nm處測(cè)定吸光值，檢測(cè)溶血素水平。

小鼠取血致死后，取脾臟并勻漿，用都氏液稀釋至細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×109個(gè)/mL。取相同體積的脾細(xì)胞混懸液、0.2%雞紅細(xì)胞和10%新鮮豚鼠血清混勻。以生理鹽水代替豚鼠血清做空白對(duì)照，37℃保溫1 h，3 000 r/min離心15 min，取上清液，于413 nm處測(cè)定吸光值，檢測(cè)溶血空斑數(shù)量。

2.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SAS9.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示數(shù)值，差異顯著性分析采用單因素方差分析。

3　結(jié)果與分析

3.1連翹葉多糖含量測(cè)定

多糖含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.006 2x+0.053 7，R2= 0.995。連翹葉片純化多糖的得率為4.12%，多糖含量為90.74%。

3.2連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響

不同劑量連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠胸腺和臟器指數(shù)的影響見(jiàn)表1。

由表1可以看出，與正常組相比，模型組小鼠臟器指數(shù)均顯著降低（P<0.01），免疫抑制模型造模成功。與模型組相比，中、高劑量組連翹葉多糖可以顯著增加胸腺重量（P<0.01），高劑量組多糖可以顯著增加脾臟重量（P<0.01）。

3.3連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

不同劑量連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響見(jiàn)表2。

表2　連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（±SD）Table 2　Effect of FLP on abdominal cavity macrophage function in immunosuppressive mice（±SD）

表2　連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（±SD）Table 2　Effect of FLP on abdominal cavity macrophage function in immunosuppressive mice（±SD）

注：▲▲與正常組比較P<0.01；★與模型組比較P<0.05；★★與模型組比較P<0.01；-表示未測(cè)定。

組別　　劑量/ （mg/kg）　　吞噬率/%　　吞噬指數(shù)正常組　-　41.274±5.778　0.523±0.058模型組　-　29.560±3.695▲▲　0.372±0.049▲▲連翹葉多糖低劑量組　75　32.512±2.666　0.396±0.046連翹葉多糖中劑量組　150　34.168±4.476★　0.412±0.043連翹葉多糖高劑量組　300　39.515±4.268★★　0.493±0.057★★

由表2可以看出，與正常組相比，模型組小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能顯著降低（P<0.01），免疫抑制模型造模成功。中、高劑量組連翹葉多糖可顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能，與模型組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯（P< 0.05，P<0.01），高劑量組多糖可顯著提高吞噬指數(shù)（P< 0.01），表明連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能具有促進(jìn)作用。

3. 4連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

不同劑量連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響見(jiàn)表3。

表3　連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響（±SD）Table 3　Effect of of FLP on lymphocyte proliferation in immunosuppressive mice

表3　連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響（±SD）Table 3　Effect of of FLP on lymphocyte proliferation in immunosuppressive mice

注：▲▲與正常組比較P<0.01；★與模型組比較P<0.05；-表示未測(cè)定。

組別　　劑量/（mg/kg）　　脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)正常組　-　87.240±8.201模型組　-　67.347±8.351▲▲連翹葉多糖低劑量組　75　69.672±7.664連翹葉多糖中劑量組　150　72.274±7.011連翹葉多糖高劑量組　300　74.620±6.343★

由表3可以看出，與正常組相比，模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力顯著降低（P<0.01），免疫抑制模型造模成功。與模型組相比，高劑量組連翹葉多糖可以顯著增強(qiáng)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力（P< 0.05）。

3.5連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4含量的影響

不同劑量連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4含量的影響見(jiàn)表4。

表4　連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4含量的影響（±SD）Table 4　Effect of FLP on the the leval of IL-2 and IL-4 in immunosuppressive mice（±SD）

表4　連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4含量的影響（±SD）Table 4　Effect of FLP on the the leval of IL-2 and IL-4 in immunosuppressive mice（±SD）

注：▲▲與正常組比較P<0.01；★★與模型組比較P<0.01；-表示未測(cè)定。

組別　　劑量/ （mg/kg）　IL-2（pg/mL）　IL-4（pg/mL）正常組　-　31.388±2.731　35.693±3.819模型組　-　13.045±1.426▲▲　21.937±2.654▲▲連翹葉多糖低劑量組　75　14.859±2.360　23.746±2.018連翹葉多糖中劑量組　150　17.912±2.418★★　26.524±2.097★★連翹葉多糖高劑量組　300　22.358±3.130★★　33.231±3.560★★

由4可以看出，模型組小鼠血清中IL-2和IL-4含量顯著降低（P<0.01），免疫抑制模型造模成功。與模型組相比，中、高劑量組連翹葉多糖可顯著提高免疫抑制小鼠血清中IL-2和IL-4水平（P<0.01）。

3. 6連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影響

不同劑量連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影響見(jiàn)表5。

表5　連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影響（±SD）Table 5　Effect of FLP on the formation of hemolysin and hemolytic plaque in immunosuppressive mice（±SD）

表5　連翹葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影響（±SD）Table 5　Effect of FLP on the formation of hemolysin and hemolytic plaque in immunosuppressive mice（±SD）

注：▲▲與正常組比較P<0.01；★★與模型組比較P<0.01；-表示未測(cè)定。

溶血空斑A413 nm（n=5）正常組　-　0.543±0.041　0.367±0.037模型組　-　0.212±0.017▲▲　0.191±0.028▲▲連翹葉多糖低劑量組　75　0.234±0.026　0.207±0.024連翹葉多糖中劑量組　150　0.357±0.046★★　0.218±0.034連翹葉多糖高劑量組　300　0.418±0.040★★　0.279±0.031★★組別　　劑量/ （mg/kg）溶血素A540 nm（n=10）

由表5可以看出，與正常組相比，模型組小鼠溶血素水平和溶血空斑形成數(shù)量顯著下降（P<0.01），免疫抑制模型造模成功。與模型組相比，中、高劑量連翹葉多糖能夠明顯促進(jìn)免疫抑制小鼠溶血素值升高（P< 0.01），高劑量連翹葉多糖能夠明顯增加溶血空斑數(shù)量（P<0.01），表明連翹葉多糖對(duì)提高免疫抑制小鼠體液免疫功能有一定作用。

4　討論

環(huán)磷酰胺是臨床抗腫瘤的基礎(chǔ)藥物，在取得較好療效的同時(shí)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有較大的損傷[13]。本文考察了不同劑量的連翹葉多糖對(duì)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫功能低下小鼠免疫系統(tǒng)的修復(fù)能力。

機(jī)體免疫細(xì)胞大多分布于主要免疫器官胸腺和脾臟，兩者的重量在一定程度上可反映免疫器官內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，從而反映機(jī)體免疫能力的強(qiáng)弱；巨噬細(xì)胞是機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)的主要組成部分，可吞噬異體抗原，吞噬細(xì)胞數(shù)量的增加和吞噬能力的增強(qiáng)反映了機(jī)體非特異性免疫功能的增強(qiáng)。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)價(jià)動(dòng)物免疫能力的強(qiáng)弱，其增殖率的高低可直接反應(yīng)機(jī)體的T淋巴細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞的免疫水平；IL-2和IL-4是由輔助性淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，能促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖、分化和抗體的產(chǎn)生，對(duì)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能均有重要的促進(jìn)作用；溶血素是小鼠血清抗體水平的指標(biāo)，溶血空斑是抗體形成細(xì)胞的檢測(cè)指標(biāo)，血清溶血素含量高低和溶血空斑形成數(shù)量，可反映機(jī)體體液免疫功能的強(qiáng)弱。

本研究表明適宜劑量的連翹葉多糖能明顯提高環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞的增殖能力、血清中IL-2和IL-4水平、溶血素水平和溶血空斑形成數(shù)量，表明連翹葉多糖具有良好的免疫增強(qiáng)活性，但其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。因此進(jìn)一步純化連翹葉多糖、研究各組分的免疫活性、各組分的相互作用對(duì)免疫活性的影響以及從細(xì)胞、分子等層面探討多糖作用機(jī)制的工作有待于進(jìn)一步展開(kāi)。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.007

收稿日期：2015-10-22

基金項(xiàng)目：徐州市衛(wèi)生科技資源現(xiàn)狀調(diào)查與分析（xkqz030）

作者簡(jiǎn)介：張岫秀（1964—），女（漢），副主任護(hù)師，學(xué)士，主要從事兒科護(hù)理與臨床研究。

*通信作者：高勇（1967—），主任技師。

Investigation on the Influence of Polysaccharide from Forsythia suspensa Leaves on Immunological Function of Mice

ZHANG Xiu-xiu1，CAI Ying1，WU Zhong-mei1，GAO Yong2，*
（1.Xuzhou Children's Hospital，Xuzhou 221006，Jiangsu，China；2.Xuzhou Institute of Medical Science，Xuzhou 221006，Jiangsu，China）

Abstract：To investigate the modulation of Forsythia suspensa polysaccharide（FLP）on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide（CTX），mice were injected with CTX to establish the immunosuppressive model.The effects of different doses of FLP on the index of thymus and spleen，peritoneal macrophage activity and the levels of blood serum hemolysin and hemolytic plaque in mice were detected.FLP was effective in improving the immune function of immunosuppressive mice，improved the index of thymus and spleen，increased the phagocytic activity of peritoneal macrophage，proliferation activity of splenic lymphocytes，the level of IL-2 and IL-4 and improved the formation of hemolysin and hemolytic plaque in immunosuppressive mice.FLP could enhance the immunological activity，has a higher application value in the development of immunomodulator and functional foods.

Key words：Forsythia suspensa leaves；polysaccharide；immunological function