香蕉NPR1E基因的克隆及表達(dá)分析

王卓等

摘 要 NPR1基因可參與調(diào)節(jié)植物對(duì)病原菌的廣譜抗性，在植物系統(tǒng)抗性中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。通過RACE（rapid-amplification of cDNA ends）方法從香蕉根系中獲得NPR1E基因，命名為MaNPR1E（GenBank登錄號(hào)分別為：KF582550）。MaNPR1E是香蕉NPR1基因編碼框全長(zhǎng)cDNA，包含一個(gè)1 755 bp的最大開放閱讀框，編碼一個(gè)含584個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。經(jīng)蛋白質(zhì)序列同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其含有完整的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域、錨蛋白重復(fù)ANK序列和NPR1-like-C結(jié)構(gòu)域，屬于典型的NPR1蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹比對(duì)分析表明，MaNPR1E與海棗PdNPR3（XP_008808341.1）和油棕EgNPR3（XP_010914123.1）的親緣關(guān)系較近。組織特異性研究表明，該基因組成型表達(dá)于香蕉各組織。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，接種枯萎病菌后MaNPR1E的表達(dá)在感病品種中被抑制，而在抗病品種中被激活；MaNPR1E的表達(dá)受乙烯利和水楊酸的誘導(dǎo)。上述結(jié)果表明，MaNPR1E可能在香蕉抗枯萎病過程中扮演重要的調(diào)控角色。

關(guān)鍵詞 香蕉 ；MaNPR1E ；基因克隆 ；表達(dá)分析

分類號(hào) S668.1

Molecular Cloning and Expression of MaNPR1E Gene from Banana

（Musa acuminata L. AAA group， cv. Cavendish）

WANG Zhuo1） XU Biyu1） JIA Caihong1） LI Jianping1）

LIU Juhua1） ZHANG Jianbin1） MIAO Hongxia1） JIN Zhiqiang1，2）

（1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101；

2 Haikou Experimental Station， CATAS， Haikou， Hainan 570102）

Abstract NPR1（nonexpressor of PR gene 1），involved in regulating plant broad-spectrum resistance，plays important roles in plant system resistance. In this study， we report the molecular characteristics of NPR1E gene cloned from banana（Musa acuminate L. AAA group， cv. Cavendish）using a RACE-PCR-based strategy. MaNPR1E（accession number：KF582550） contained an open reading frame of 1 755 bp which encoded a polypeptide of 584 amino acids. Protein alignment showed that they contain the complete typical conserved BTB/POZ （BR-C， ttk and bab/Pox virus and Zinc finger）domain， ankyrin repeats and NPR1/NIM1 like defence protein C terminal，which belongs to a typical NPR1 protein. Phylogenetic analysis showed that the deduced amino acid sequences of MaNPR1E also have high similarity to PdNPR3（XP_008808341.1） and EgNPR3（XP_010914123.1） from Phoenix dactylifera and Elaeis guineensis，respectively. Tissue-specific studies showed that the expression of MaNPR1E was constitutive expressed in various tissues of banana seedling. In resistant and susceptible varieties of banana after inoculation Foc TR4， the expression of MaNPR1E was decreased. While in resistant varieties the time point of MaNPR1E， compared to control， increased higher than that in susceptible varieties at time points， also the expression of MaNPR1E was induced by Ethephon and salicylic acid. These results suggest that MaNPR1E may play an important role in the regulation of Banana resistance to the infection of Foc TR4.

Keywords banana ； MaNPR1E ； gene clone ； expression analysis

病原菌與植物在協(xié)同進(jìn)化中，植物形成一系列復(fù)雜的防御機(jī)制來(lái)避免病原菌的侵害，如系統(tǒng)獲得抗性（Systemic acquired resistance， SAR）和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（inducted systemic resistance， ISR）。SAR是植物在遭受病原菌侵染后產(chǎn)生的防御反應(yīng)，通過激活PR基因的表達(dá)來(lái)抵抗病毒、細(xì)菌和真菌的侵染[1]，水楊酸是植物建立SAR所必須的物質(zhì)[2]。ISR的建立依賴于茉莉酸（jasmonic acid， JA）和乙烯（ethylene， ET）的介導(dǎo)[3-4]。NPR1（nonexpressor ofpathogenesis related genes 1）參與植物SAR和ISR的建立[1-2，5]。NPR1 基因編碼的蛋白通常在N-末端包含一個(gè)BTB/POZ（broad-complex， tramtrack， and bric-a-brac/poxvirus and zinc finger）結(jié)構(gòu)域和一個(gè)錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域ANK （ankyinrepeat domain）， 這2 個(gè)結(jié)構(gòu)域在與其它蛋白質(zhì)互作時(shí)起著重要作用[6-7]。NPR1參與的生理過程為：在正常生長(zhǎng)狀態(tài)下，NPR1蛋白通過二硫鍵形成寡聚體存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)植物感染病原菌后， SA 的積累改變了細(xì)胞中的氧化還原勢(shì)， NPR1寡聚體解體后形成單體，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與TGA-bZIP轉(zhuǎn)錄因子互作，進(jìn)而調(diào)控一些啟動(dòng)子中含有as-1/ocs 順式作用元件的PR 基因的表達(dá)[2，8-9]。至今，已從多種植物中克隆了NPR1 基因及其同源基因，并對(duì)部分基因的功能進(jìn)行了不同程度的研究[6，10]。到目前為止，已經(jīng)克隆到香蕉NPR1基因中的4個(gè)成員，包括MNPR1A、MNPR1B[11]，MdNPR1[12]，MuNPR1-1[13]。在香蕉A基因組中預(yù)測(cè)出了8個(gè)NPR1基因[14]，表明香蕉NPR1基因的克隆及功能分析還需進(jìn)一步完善。

香蕉是熱帶、亞熱帶發(fā)展中國(guó)家重要的農(nóng)作物之一，其果實(shí)富含蛋白質(zhì)和碳水化合物，是一些熱帶地區(qū)人們食用的主要水果種類和國(guó)民收入的主要來(lái)源[15]。然而香蕉枯萎病嚴(yán)重威脅香蕉的正常生產(chǎn)[16]。NPR1在植物抗病中起著重要作用，是調(diào)控植物抗病反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵基因[2，11-12]，因此了解香蕉NPR1基因的功能將有助于揭示NPR1介導(dǎo)的抗病途徑與香蕉枯萎病的密切關(guān)系。在此之前，筆者利用RNA-seq方法獲得香蕉根系轉(zhuǎn)錄組[17]，基于轉(zhuǎn)錄組信息從香蕉根系中克隆了一個(gè)MaNPR1E基因，利用生物信息學(xué)網(wǎng)站分析該基因的結(jié)構(gòu)特性，采用熒光定量技術(shù)分析該基因的表達(dá)模式，探討枯萎病菌脅迫下MaNPR1在香蕉根系中的表達(dá)調(diào)控，有助于進(jìn)一步了解香蕉抗枯萎病的調(diào)控機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

供試香蕉品種為‘巴西蕉（cv. Cavendish AAA）和‘農(nóng)科1號(hào)（cv. Nongke No. 1）（購(gòu)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院組培中心），為移栽大棚后約60 d的健康杯苗，其中‘巴西蕉為病菌的感病品種，‘農(nóng)科1號(hào)為病菌的耐病品種。香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種（FusariumOxysporum f specialis （f. Sp） cubense Tropical Race 4， Foc TR4），由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科院環(huán)植所張欣博士饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的培養(yǎng)和收集

將于-80℃中以25%甘油保存的香蕉枯萎病4號(hào)生理小種孢子懸浮液接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，于28℃培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌水將孢子洗下來(lái)，用2層Mirocloth膜過濾，濾液以4 000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀用50 mL無(wú)菌水重懸，再以4 000 r/min離心15 min，孢子用無(wú)菌水洗2次，然后調(diào)到合適的濃度。

1.2.2 香蕉接種Foc TR4及激素處理

將‘巴西蕉和‘農(nóng)科1號(hào)分為2組，每組60顆幼苗。以蘸根接菌法接種Foc TR4，接種濃度為1×106個(gè)/mL，分別于接種后2、4、6 d取樣，以未接種的為對(duì)照（0 d）；分別以100 μmol/L 脫落酸（abscisic acid，ABA）、1%（V/V） 乙烯利（ethephon， ETH）、100 μmol/L 茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）和100 μmol/L 水楊酸（salicylic acid， SA）處理‘巴西蕉幼苗，以去離子水處理為對(duì)照。上述每個(gè)處理重復(fù)3次。于液氮中速凍后， 置于-80℃冰箱備用。

1.2.3 MaNPR1E的克隆及分析

在香蕉根系轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)5'RACE引物，按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）說(shuō)明書進(jìn)行RACE反應(yīng)；擴(kuò)增獲得的DNA序列經(jīng)過測(cè)序后在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)BLASTn和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)BLASTx中進(jìn)行同源核苷酸和蛋白序列檢索；應(yīng)用DNAMAN、ProtParam和MEGA4等生物軟件分析獲得cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并將其與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）、香蕉A基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//banana-genome.cirad.fr/tools.html）中已知的核酸和蛋白序列進(jìn)行比較分析。

1.2.4 MaNPR1E在香蕉不同器官中的表達(dá)分析

選取生長(zhǎng)8個(gè)月的香蕉根、球莖、假莖、葉、花和果實(shí)，按照Wan等[18]的方法提取RNA；每個(gè)樣品取4 μg總RNA，用Invitrogen SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase合成cDNA第一鏈；以香蕉根、球莖、假莖、葉、花和果實(shí)的cDNA為模板，以MaActin片段為內(nèi)參，采用RT-PCR方法對(duì)其進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析；將MaNPR1E在香蕉A基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//banana-genome.cirad.fr/tools.html）中進(jìn)行比對(duì)，以確定該基因是否屬于香蕉A基因組。在序列5′端非保守區(qū)域設(shè)計(jì)MaNPR1E基因表達(dá)引物，引物序列為P1（5′-GTTCGCCTTGTTCGGTTG-3′）和P2（5′-ACTTCGGATTGGATGGAC-3′）。MaActin1引物為P1（5′-CGAGGCTCAATCAAA-GA-3′）和P2（5′-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3′）。

1.2.5 MaNPR1E基因的表達(dá)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MaNPR1E基因的表達(dá)，試劑盒購(gòu)自TaRaKa公司，染料為SYBR Green，在Mx 3005P熒光定量PCR儀（吉泰生物科技公司）上進(jìn)行。分別以接種Foc TR4后不同時(shí)間點(diǎn)的經(jīng)ABA、乙烯利、茉莉酸甲酯和水楊酸處理過的巴西蕉根系cDNA第一鏈為模板，以MaActin片段為內(nèi)標(biāo)，引物同“1.2.4”。熒光定量PCR的反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性7 S，60℃退火15 S，72℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均做3 次生物學(xué)重復(fù)，利用SAS軟件（SAS 9.0 for Windows）進(jìn)行顯著性分析，“*”、“**”分別表示差異達(dá)到顯著（p<0.05）和極顯著（p<0.01）水平。結(jié)果用KyPlot軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaNPR1E克隆與序列分析

在香蕉根系轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[17]的基礎(chǔ)上，成功克隆一個(gè)香蕉NPR1基因ORF，測(cè)序后經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列與其他植物NPR1基因序列具有較高的同源性，表明該序列是香蕉NPR1基因編碼框全長(zhǎng)cDNA，命名為MaNPR1E，GenBank登錄號(hào)為：KF582550。MaNPR1E序列全長(zhǎng)為2 082 bp，其中5′非翻譯區(qū)123 bp，3′非翻譯區(qū)204 bp，含有一個(gè)1 755 bp的ORF，編碼584個(gè)氨基酸殘基（圖1），可編碼預(yù)期分子量為64.88 ku和等電點(diǎn)為6.66的氨基酸序列。將MaNPR1E推導(dǎo)的氨基酸序列與香蕉A基因組[14]進(jìn)行比對(duì)，找到與其高度同源的蛋白序列GSMUA_Achr5P02120，進(jìn)一步分析表明，兩者在氨基酸水平有4個(gè)位點(diǎn)存在差異，分別是第261、295、430、524號(hào)位點(diǎn)，相似度為99.32%。利用DNAMAN軟件將MaNPR1E與之前報(bào)道的4個(gè)NPR1（MNPR1A、MNPR1B[11]，MdNPR1[12]，MuNPR1-1[13]）進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，其相似度僅為53.48%（結(jié)果未顯示）。在GenBank中對(duì)MaNPR1E蛋白質(zhì)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域搜索和同源性分析，結(jié)果表明，MaNPR1E蛋白屬于NPR1家族成員，其氨基酸序列包含1個(gè)BTB/POZ結(jié)構(gòu)域（73～198，圖2 紅線區(qū)域）、1個(gè)錨蛋白重復(fù)ANK序列（279～374，圖2藍(lán)線區(qū)域）和1個(gè)NPR1-like-C結(jié)構(gòu)域（379～566，圖2 綠線區(qū)域）。利用軟件MEGA4.0中的NJ法構(gòu)建MaNPR1E基因的氨基酸序列和其他植物的NPR類基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以MaNPR1E與海棗 （Phoenix dactylifera， XP_008806697.1）和油棕（Elaeis guineensis， XP_010908601.1）的NPR3蛋白同源關(guān)系最近（圖3）。

2.2 MaNPR1E組織特異性表達(dá)分析

采用熒光定量RT-PCR方法，以MaActin作為內(nèi)參，分別檢測(cè)香蕉不同部位MaNPR1E mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果表明，MaNPR1E在所有組織中均有表達(dá)；在假莖中表達(dá)量最高，是根中的1.8倍，在花中表達(dá)最低，約為根的一半（圖4）。

2.3 不同抗性的香蕉品種接種Foc TR4后MaNPR1E的表達(dá)分析

在感病品種中，MaNPR1E的相對(duì)表達(dá)量在接種FocTR4后逐漸下降，且差異達(dá)到極顯著水平。在接種后6 d時(shí)達(dá)到最低，僅為對(duì)照的1/3（圖5）。在耐病品種中MaNPR1E的相對(duì)表達(dá)量在接種Foc TR4后顯著增加，在接種后4 d時(shí)達(dá)到最大，是對(duì)照的4.1倍。因此從相對(duì)表達(dá)量的變化上看，MaNPR1E的表達(dá)在感病品種中被抑制，而在抗病品種中被激活，表明該基因參與香蕉抗枯萎病的過程。

2.4 MaNPR1E對(duì)激素處理的響應(yīng)

為了檢測(cè)MaNPR1E對(duì)不同激素處理的響應(yīng)情況，分別用脫落酸（ABA）、乙烯利（ethephon）、茉莉酸甲酯（MeJA）和水楊酸（SA）對(duì)巴西蕉根系進(jìn)行處理。MaNPR1E的表達(dá)受乙烯利和水楊酸的誘導(dǎo)，均在處理12 h達(dá)到最大值，其相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的3.97倍和2.07倍；MaNPR1E的表達(dá)在MeJA處理6、12 h時(shí)均被抑制，在24 h時(shí)恢復(fù)到對(duì)照水平；MaNPR1E的表達(dá)在ABA處理下顯著被抑制，在處理24 h時(shí)約為對(duì)照的1/3（圖6）。這些結(jié)果表明，MaNPR1E可能參與乙烯利和水楊酸介導(dǎo)的抗病信號(hào)途徑。

3 討論

NPR1是調(diào)控植物抗病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)控病程相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)提高植物對(duì)病原菌的抗病性。本研究獲得一個(gè)全長(zhǎng)香蕉NPR1E基因（圖1）。在序列分析方面，該基因與其他植物的NPR1基因具有較高的同源性。MaNPR1E編碼的氨基酸分子量為64.88 ku，等電點(diǎn)為6.66，這與已報(bào)道的其它植物NPR1蛋白特征相似[6，8-9，11-13，19]。MaNPR1E推導(dǎo)的氨基酸序列中包含完整的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域、錨蛋白重復(fù)ANK序列和NPR1-like-C結(jié)構(gòu)域（圖2），這些NPR1基因典型的特點(diǎn)表明MaNPR1E屬于植物NPR1基因[11-13]。將MaNPR1E在香蕉A基因組[14]數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)與其高度同源的NPR1基因（表1），表明栽培的巴西蕉品種（AAA group）與測(cè)序的DH-Pahang品種（AA group）親緣關(guān)系很近，同時(shí)也表明，2個(gè)品種的NPR1基因是同源基因[14]，其差異主要是序列間的SNP形成的（結(jié)果未列出），這些SNP可以作為潛在的分子標(biāo)記為后續(xù)的香蕉育種服務(wù)。聚類分析結(jié)果表明，MaNPR1E與海棗和油棕的NPR3親緣關(guān)系較近（圖3）。上述結(jié)果均表明，MaNPR1E基因編碼的蛋白確實(shí)為一個(gè)新的香蕉NPR1蛋白。

己有研究表明，NPR1基因在植物組織中呈組成型表達(dá)[20]，在本研究中，供試的根、球莖、假莖、葉、花和果實(shí)中也均檢測(cè)到MaNPR1E的表達(dá)（圖4），表明MaNPR1E在香蕉組織中屬于組成型表達(dá)，根據(jù)這一結(jié)果推測(cè)，該基因可能在香蕉的生長(zhǎng)和發(fā)育過程中起著重要作用。在擬南芥中，NPR1基因是調(diào)控植物抗病性的關(guān)鍵基因之一[2，6]，它不僅直接參與植物的系統(tǒng)獲得性抗性調(diào)控和其他類型的誘導(dǎo)抗病性，還在植物基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)和植物基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)中起著核心調(diào)控作用[1-2]。過表達(dá)AtNPR1基因能增強(qiáng)擬南芥對(duì)丁香假單胞菌和霜霉菌的抗性[6]；在缺失NPR1基因后，擬南芥植株易感這些病原菌[21]。在接種Foc后，MNPR1A在耐病品種的表達(dá)量高于感病品種[11]；接種FOC R4后，MdNPR1在抗病品種“Dongguan Dajiao”中的表達(dá)量高于感病品種“Fenjiao”[12]。在本研究中，接種Foc TR4后，MaNPR1E同樣在抗病品種中上調(diào)表達(dá)而在感病品種中下調(diào)表達(dá)（圖5），說(shuō)明其可能參與了香蕉抗枯萎病的防衛(wèi)反應(yīng)。已報(bào)道的MaNPR1A、MaNPR1B和MdNPR-1基因均受外源水楊酸的誘導(dǎo)[11，13]，同樣MaNPR1-A和MNPR1B不受外源MeJA的誘導(dǎo)[11]，這與本研究結(jié)果相吻合。值得一提的是，在ISR建立的過程中茉莉酸和乙烯起著重要作用[12]。本研究結(jié)果表明，MaNPR1E基因明顯受外源乙烯利的誘導(dǎo)（圖6），表明香蕉MaNPR1E基因可能在乙烯介導(dǎo)的ISR中也起一定的作用。由此可見，該基因是否參與依賴于茉莉酸和乙烯介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性及如何提高香蕉的抗枯萎病能力值得深入研究。

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