辣木主枝嫩芽無菌培養(yǎng)及植株再生研究

高燕　姜艷　白燕冰等

摘要 [目的]確定不同部位嫩芽外植體與植物生長素及天然提取物誘導(dǎo)辣木不定芽的分化能力及不定根生長的最佳條件。[方法]選擇優(yōu)良辣木主枝嫩芽的莖段為外植體，采用組織培養(yǎng)技術(shù)對嫩芽中部莖段誘導(dǎo)、增殖、生根等進(jìn)行研究。[結(jié)果]不同部位的嫩芽是影響辣木誘導(dǎo)和增殖最關(guān)鍵的因素，嫩芽誘導(dǎo)效果：中部>下端>上端，辣木誘導(dǎo)最適宜培養(yǎng)基是MS+6BA 0.5 mg/L+馬鈴薯水汁20 g/L +蔗糖25 g/L，誘導(dǎo)率為83%；增殖分化培養(yǎng)基為3/4 MS +6BA 0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L+馬鈴薯水汁20 g/L +蔗糖30 g/L，增殖系數(shù)為3.63；生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+香蕉水汁20 g/L +蔗糖20 g/L，生根率達(dá)83%，不定根誘導(dǎo)效果：IBA>IAA>NAA。 [結(jié)論]以主枝嫩芽中部為外植體可建立辣木嫩芽快繁體系，可提高增殖系數(shù)和生根率。

關(guān)鍵詞 辣木；離體培養(yǎng)；不定芽

中圖分類號 S604+.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2015）15-025-03

Sterile Culture of Moringa oleifera Buds and Plants Regeneration Test

GAO Yan，JIANG Yan*，BAI Yanbing et al

（Dehong Institute of Tropical Agricultural Sciences in Yunnan Province，Ruili，Yunnan 678600）

Abstract [Objective] Accord with the test make sure different parts of the buds explant and auxin induction and natural extracts of adventitious bud differentiation ability，and the best condition of adventitious roots growth.[Method] Selecting M.oleifera bud as explants，using tissue culture to study the problems such as bud induction，proliferation and rooting.[Result] Different parts of the bud is the key factor to affect induction and proliferation，the buds induction results：middle>lower>upper，the optimum culture medium of M.oleifera is MS+6BA0.5 mg/L+The potato water juice 20 g/L + sucrose 25 g/L，induction rate is 83%； the optimum culture medium of proliferation differentiation is 3/4 MS +6BA0.5 mg/L +KT0.1 mg/L + The potato water juice 20 g/L + sucrose 30 g/L，kfactor is 3.63； the optimum culture medium of rooting is 1/2MS+ IBA0.5 mg/L +NAA0.2 mg/L+ banana water juice 20 g/L + sucrose 20 g/L，rooting rate is 83%，adventitious roots induction effect：IBA>IAA>NAA.[Conclusion] The central of the main branch buds as explants can establish M.oleifera buds micropropagation system，which can improve the multiplication and rooting rate.

Key words Moringa oleifera； in vitro culture； Adventitious buds

辣木（Moringa oleifera Lam），又稱奇樹、鼓槌樹， 原產(chǎn)于印度和非洲，為辣木科（Moringaceae）辣木屬多年生多功能熱帶植物，僅一個屬，世界共有14種[1]。辣木全株均可利用，營養(yǎng)物質(zhì)種類多而全[2]。印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，辣木可預(yù)防300種疾病，具有降壓、降膽固醇、降糖、醫(yī)療保健等功效，此外具有護(hù)肝、利尿、消炎、止痛、降壓、催欲等功能，被科學(xué)譽(yù)為“神奇之樹”和“母親最好的朋友”[3-5]。

我國辣木主要分布于云南、廣西、廣東、海南、澳門與臺灣地區(qū)，由于辣木喜溫，耐干旱，生長快，非常適宜云南省熱區(qū)廣泛種植[6]。由于辣木神奇的功效和潛在的市場價值，種植辣木的地區(qū)越來越多，傳統(tǒng)的種子育苗已不能滿足市場需要。目前，生產(chǎn)上種植的辣木90%以上是采用種子育苗，存在性狀不穩(wěn)定、抗病差、產(chǎn)量低等問題，而以主枝嫩芽為外植體，通過不定芽誘導(dǎo)、增殖分化、不定根誘導(dǎo)的種苗，可保證品種的穩(wěn)定性、抗病性及品質(zhì)，對促進(jìn)云南辣木良種選育及種苗繁殖推廣具有重要意義。2006年起，云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所進(jìn)行辣木引種、栽培試驗示范技術(shù)研究，針對種苗價格高、抗性差、生產(chǎn)成本高、嚴(yán)重影響辣木產(chǎn)量和品質(zhì)的提高等問題，筆者于2013～2014年以辣木主枝嫩芽不同部位的莖段為外植體，探索不同植物激素濃度及天然提取物對不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響，為云南辣木良種選育和種苗繁殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

辣木（PKM1）主枝嫩芽采自于云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所辣木栽培示范園，選擇健壯、腋芽飽滿、無病蟲害的嫩芽莖段作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 外植體選取。

選取生長健壯無病蟲害及性狀優(yōu)良的粗壯植株，剪取主枝頂端帶5～7個節(jié)的綠色嫩芽，嫩芽除去枝葉，置于自封袋保存。取材應(yīng)選擇晴天的10：00以前或陰天，盡量避開雨天。

1.2.2 外植體消毒。

將嫩芽切成長4 cm左右的莖段，分為上端（頂端以下1～2節(jié)）、中部（頂端以下3～4節(jié)）、下端（頂端以下5～7節(jié)）3種不同部位嫩芽，用無菌水沖洗2次，放入250 mg/L速潔（過氧乙酸）消毒液預(yù)處理10 min，在無菌操作臺上加入75%乙醇消毒30 s，再用0.1%HgCl2滅菌15 min，無菌水沖洗5～6次，無菌濾紙吸干水分，備用。

1.2.3 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。將消毒處理的莖段切成帶一個節(jié)2 cm左右的莖段接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，以MS為基本培養(yǎng)，附加6BA 濃度為 0.1、0.5、1.0 mg/L及馬鈴薯水汁（去皮切大小1 cm3小方塊加水煮沸10 min后過濾）20 g/L共6種處理， 培養(yǎng)基中蔗糖25 g/L，pH 5.8，培養(yǎng)溫度（28±2）℃，光照強(qiáng)度1 600～2 000 lx，光照時間10 h/d，先暗培養(yǎng)3 d，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)室。莖段每個處理均接種10個外植體，每個處理接種10瓶，每瓶接1個莖節(jié)，重復(fù)3次。培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計污染率、死亡率和誘導(dǎo)率。

污染率=（莖段污染外植體數(shù)/外植體總數(shù)）×100%

死亡率=（莖段死亡外植體數(shù)/外植體總數(shù)）×100%

誘導(dǎo)率=（莖段萌發(fā)外植體數(shù)/外植體總數(shù)）×100%

1.2.4 繼代增殖分化培養(yǎng)。

選擇生長健壯、5 cm以上的不定芽，將不定芽切成帶一節(jié)的小段接種于附加不同濃度植物激素的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。以3/4MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加馬鈴薯水汁20 g/L及6BA 0.5 mg/L和KT、 NAA 、GA3濃度分別為0.05、0.10、0.20 mg/L共9個處理的增殖分化培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基中蔗糖30 g/L，pH 5.8，光照強(qiáng)度1 800～2 200 lx，光照時間12 h/d，培養(yǎng)溫度（28±2）℃。莖段每個處理接種10個小段，每個處理接種10瓶，每瓶接1個莖節(jié)，重復(fù)3次。培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計增殖系數(shù)及生長狀況。

增殖系數(shù)=繼代增殖芽數(shù)/接種芽數(shù)

1.2.5 不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)。

選擇莖段誘導(dǎo)的健壯不定芽，切取枝葉帶一個節(jié)長2 cm莖段接種于不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。 以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加NAA、IBA、IAA濃度為0.1、0.5、1.0 mg/L共9個處理；附加香蕉水汁（去皮加水煮沸10 min后過濾）20 g/L及IBA 0.5 mg/L 和IAA濃度為0.1、0.2、0.5 mg/L共6個處理。培養(yǎng)基中蔗糖20 g/L，pH 5.8，光照強(qiáng)度2 000～2 400 lx，光照時間12 h/d，培養(yǎng)溫度（28±2）℃。莖段每個處理接種10個小段，重復(fù)3次。培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計生根率及生長情況。

平均根數(shù)=生根莖段總數(shù)/生根莖段數(shù)

生根率=（生根莖段數(shù)/接種莖段數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位外植體對辣木不定芽誘導(dǎo)的影響

為了確定辣木不定芽的最佳誘導(dǎo)部位，分別將上端、中部、下端接種于以MS為基本培養(yǎng)基添加6BA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基上，20 d后統(tǒng)計不定芽誘導(dǎo)情況。從表1可以看出，中部莖段嫩芽未木質(zhì)化，接種3 d后，基部切口出現(xiàn)愈傷組織分化，5 d中部莖段嫩芽開始萌發(fā)，不定芽萌發(fā)的時間較早，誘導(dǎo)的不定芽效果最好，誘導(dǎo)率為76.7%；下端嫩芽有一部分半木質(zhì)化，外植體消毒處理不徹底，污染率較高，接種7 d下端嫩芽才萌發(fā)，誘導(dǎo)率為63.3%；上端嫩梢細(xì)弱，外植體消毒處理易殺傷幼嫩組織，導(dǎo)致褐化死亡，死亡率達(dá)43.3%，誘導(dǎo)率為50.0%。因此，綠色嫩芽頂端下（中部）3～4節(jié)腋芽是辣木不定芽誘導(dǎo)的最佳外植體。

2.2 不同6BA濃度對辣木不定芽誘導(dǎo)的影響

因中部莖段外植體不定芽誘導(dǎo)優(yōu)于上端及下端，選擇中部莖段外植體接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，外植體切口處逐漸膨大，出現(xiàn)愈傷組織，培養(yǎng)5 d后，莖段腋芽開始萌發(fā)，誘導(dǎo)出的多數(shù)是單芽，苗細(xì)弱易黃化落葉，在培養(yǎng)基中添加馬鈴薯水汁20 g/L時，誘導(dǎo)出的多數(shù)是叢生芽，苗粗壯無黃化落葉現(xiàn)象。從表2可以看出，不同濃度6BA對辣木外植體不定芽誘導(dǎo)有較大差異，每個濃度6BA都能誘導(dǎo)出辣木不定芽，隨著6BA濃度的增加誘導(dǎo)不定芽呈拋物線，當(dāng)6BA濃度為0.5 mg/L，添加馬鈴薯水汁20 g/L時，外植體切口處出現(xiàn)乳白色愈傷組織，質(zhì)地緊密，外植體萌發(fā)數(shù)達(dá)25個，誘導(dǎo)率為83%， 平均萌發(fā)數(shù)為1.96個，平均芽長5.2 cm，不定芽的誘導(dǎo)效果最佳；其次為6BA濃度0.5 mg/L時，外植體萌發(fā)數(shù)達(dá)24個，誘導(dǎo)率為80%，平均萌發(fā)數(shù)為1.42個，平均芽長48 cm；最差的為6BA濃度0.1 mg/L時，外植體切口處出現(xiàn)乳黃色愈傷組織，顆粒狀，外植體萌發(fā)數(shù)16個，誘導(dǎo)率為53%，平均萌發(fā)數(shù)為1.13個，平均芽長3.7 cm。

2.3 不同濃度植物激素組合對辣木增殖分化的影響

從表3可以看出，不同濃度植物激素組合不同，辣木增殖分化能力相差較大，當(dāng)6BA 0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L時，增殖系數(shù)可達(dá)3.63，其次是6BA 0.5 mg/L+KT 0.2 mg/L時，增殖系數(shù)達(dá)3.02，最差是6BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L時，增殖系數(shù)為2.13。接種7 d后會出現(xiàn)黃化和落葉現(xiàn)象，15 d后從頂芽逐漸向下出現(xiàn)軟腐萎蔫，基部長出白色膨松愈傷組織等。但在培養(yǎng)基上添加馬鈴薯水汁20 g/L時，縮短培養(yǎng)時間和增加光照強(qiáng)度，基本上可以緩解上述現(xiàn)象。

2.4 不同植物激素對辣木不定根誘導(dǎo)的影響

將誘導(dǎo)生長較一致的不定芽切成2 cm長的帶一節(jié)以上莖段分別接種于不同激素IBA、NAA、IAA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4～5 d后，基部開始膨大，切口慢慢愈傷化，12 d左右基部愈傷組織或皮層長出不定根。從表4可以看出，不同IBA、NAA、IAA濃度對不定根的誘導(dǎo)有明顯差異，但每個處理都能誘導(dǎo)出不定根，誘導(dǎo)效果為IBA>IAA>NAA，隨著不同激素濃度的增加誘導(dǎo)不定根呈拋物線；當(dāng)IBA 0.5 mg/L時，生根率最高達(dá)77%，平均根數(shù)為4.4 條；其次當(dāng)IAA 0.5 mg/L時，生根率達(dá)73%，平均根數(shù)為3.9條。由此可知，隨著不同激素濃度的增加生根率先增加后下降。

2.5 不同激素濃度組合對辣木不定根誘導(dǎo)的影響

將誘導(dǎo)的不定芽切成2 cm帶一節(jié)以上莖段分別接種于不同激素濃度組合及香蕉水汁20 g/L的培養(yǎng)基上，均能誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)3～4 d后，基部開始膨大，切口慢慢愈傷化，10～12 d基部愈傷組織或皮層長出不定根。從表5可以看出，當(dāng)IBA濃度0.5 mg/L時，在低濃度下隨著IAA濃度增加生根率隨之增加，當(dāng)IBA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L再附加香蕉水汁20 g/L時，生根率高，根多粗壯，平均根數(shù)為4.7條，生根率為83%，效果最佳；當(dāng)IBA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L時，生根率較低，根少細(xì)弱，平均根數(shù)為4.3條，生根率為77%；當(dāng)IAA濃度0.5 mg/L時，生根率下降。

3 結(jié)論與討論

（1）辣木組織培養(yǎng)外植體有多種，該試驗主要以主枝嫩芽（上端、中部、下端）進(jìn)行試驗。結(jié)果表明，主枝嫩芽的誘導(dǎo)效果為中部>下端>上端。黎國運(yùn)等[7]研究表明，外植體（側(cè)芽）未通過愈傷組織階段，至少需要60 d。而該研究采用主枝嫩芽中部莖段，能誘導(dǎo)愈傷組織并分化再生植株，只需要45 d即可獲得一定量的試管苗，且誘導(dǎo)不定芽粗壯，增殖系數(shù)高。

（2）辣木莖段組織培養(yǎng)的關(guān)鍵之一是誘導(dǎo)不定芽增殖分化，而在增殖分化培養(yǎng)過程中變異和玻璃化苗是影響植物快繁的重要原因[8]，同時易出現(xiàn)黃化落葉、頂端干枯、落葉萎蔫，基部長出白色膨松愈傷組織，不定芽細(xì)弱等現(xiàn)象，朱尾銀[9]通過更改基本培養(yǎng)基中Ca2+、PO-4比例，基本上可以緩解上述現(xiàn)象。筆者通過在培養(yǎng)基中添加不同天然提取物（馬鈴薯水汁、香蕉水汁），不僅可緩解上述現(xiàn)象，而且對莖段增殖分化及生根有明顯的促進(jìn)作用[10]。

（3）不定根的誘導(dǎo)受許多因素的影響，其中生長素類物質(zhì)起著重要的調(diào)控作用[11]。目前，植物組織培養(yǎng)常用生長素類調(diào)控劑為IBA、IAA、NAA等。研究表明，它們對辣木根的誘導(dǎo)都有一定的效果，在不同濃度IBA、IAA、NAA試驗中，誘導(dǎo)效果為IBA>IAA>NAA。辣木主枝嫩芽中部莖段誘導(dǎo)最適宜培養(yǎng)基為MS+6BA 0.5 mg/L+馬鈴薯水汁20 g/L +蔗糖25 g/L，誘導(dǎo)率為83%；增殖最適宜的培養(yǎng)基為3/4 MS +6BA 0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L+馬鈴薯水汁20 g/L +蔗糖30 g/L，增殖系數(shù)為3.63；最適宜生根培養(yǎng)基為1/2MS+ IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+香蕉水汁20 g/L +蔗糖20 g/L，生根率達(dá)83%。

43卷15期 高 燕等 辣木主枝嫩芽無菌培養(yǎng)及植株再生研究

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