羥苯磺酸鈣對對比劑腎病大鼠腎的保護(hù)作用

于芬芬 季文萱 單文紅 孫艷 劉桂美 黃俊彥

近年來隨著放射影像學(xué)的快速發(fā)展和介入治療的廣泛應(yīng)用，對比劑在臨床診療中的應(yīng)用也越來越多，對比劑引起的對比劑腎病(contrastinduced nephropathy，CIN)也隨之逐年增多，已成為醫(yī)院獲得性腎功能不全的第3 位原因［1］。目前，CIN 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，認(rèn)為可能的機(jī)制有:血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變導(dǎo)致腎髓質(zhì)缺血缺氧，對比劑對腎小管的直接毒性作用，活性氧產(chǎn)生增多導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，細(xì)胞凋亡，炎性因子等［1-2］。國內(nèi)外許多研究表明，抗氧化劑可通過減少腎氧化應(yīng)激對CIN 發(fā)揮保護(hù)作用［3-5］。羥苯磺酸鈣是一種微循環(huán)改善劑及抗氧化劑，廣泛應(yīng)用于抗氧化治療。本實(shí)驗(yàn)通過建立CIN 大鼠模型，檢測腎丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況，觀察氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡與CIN 的關(guān)系，并給予羥苯磺酸鈣干預(yù)，探討羥苯磺酸鈣在CIN 中的干預(yù)效果及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取體重為200 ～220 g 的清潔級(jí)、健康雄性Wistar 大鼠(購自山東魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。TUNEL 試劑盒購自Roche 公司，MDA、SOD、GSH-Px試劑盒購自R ﹠ D，吲哚美辛(indometacin，INDO)粉劑、N-硝基-L-精氨酸甲酯(N'-nitro-L-argininemethylesterhydrochloride，L-NAME)粉劑均購自美國Sigma 公司，76%泛影葡胺購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，羥苯磺酸鈣購自海南林恒制藥有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CIN 大鼠模型建立及分組 將84 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組:假手術(shù)組(A 組)、模型組(B 組)和羥苯磺酸鈣干預(yù)組(C 組)，每組28 只。造模當(dāng)天，B 組、C 組按文獻(xiàn)制備CIN 大鼠模型［6］并有所改進(jìn)，具體方法如下:大鼠尾靜脈埋置留置針1 枚，每隔15 min 分別由大鼠尾靜脈注射INDO(10 mg/kg)、L-NAME(10 mg/kg)和76%泛影葡胺(10 ml/kg);A 組同樣方法注射等量的INDO、L-NAME及生理鹽水;C 組于造模前3 d 及造模當(dāng)天給予羥苯磺酸鈣［100 mg/(kg·d)］［7］灌胃，A 組及B 組給予等量的生理鹽水灌胃。造模72 h 內(nèi)A 組未見大鼠死亡，B 組有5 只大鼠死亡，C 組有1 只大鼠死亡。以應(yīng)用對比劑48 h 或72 h 內(nèi)血肌酸酐(Scr)較基礎(chǔ)水平升高≥25%為造模成功［1］。

1.2.2 標(biāo)本收集 于造模后24 h、48 h、72 h 分批處死大鼠，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠7 只，腹主動(dòng)脈取血，摘取大鼠雙腎，剝離腎被膜，取1/4 腎組織于10%中性甲醛固定，其余腎組織液氮速凍后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱凍存。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測 造模后48 h，應(yīng)用日本奧林巴斯AU2700 全自動(dòng)生化分析儀檢測尿素氮(BUN)、Scr。

1.2.4 病理檢查 腎組織石蠟包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察造模后24 h、48 h、72 h 的腎病理變化。

1.2.5 ELISA 法檢測造模后48 h 血清MDA、SOD、GSH-Px 在聚乙烯板反應(yīng)孔中加入準(zhǔn)備好的樣品及標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)30 min，洗板;加入酶標(biāo)試劑反應(yīng)30 min，洗板;加入顯色液，37℃顯色10 min，加入終止液，15 min 內(nèi)讀取OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品濃度。

1.2.6 TUNEL 檢測造模后48 h 腎細(xì)胞凋亡 中性甲醛固定腎組織，石蠟包埋，切片，脫蠟，水合，細(xì)胞通透，加TUNEL 反應(yīng)液，再加入標(biāo)記熒光素抗體的辣根過氧化酶，然后與二氨基苯胺(DAB)反應(yīng)顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。在細(xì)胞凋亡區(qū)域，隨機(jī)選取5 個(gè)視野(×400)，以腎小管上皮細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞數(shù)占腎小管上皮細(xì)胞總數(shù)的百分比作為腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)，同時(shí)設(shè)陰性對照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有資料采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用 珋±s 表示，同一時(shí)間點(diǎn)不同組間比較采用單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)檢測結(jié)果

A 組大鼠造模后各時(shí)間段血BUN、Scr 未見顯著變化，B 組和C 組大鼠造模后24 h 血BUN、Scr 顯著升高，48 h 達(dá)到高峰，至72 h 有所下降。與A 組相比，B 組大鼠造模后48 h 血Scr 升高2 倍以上，達(dá)到CIN 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］;與B 組相比，C 組大鼠造模后48 h BUN、Scr 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，但仍比A 組嚴(yán)重(表1)。

表1 各組大鼠造模后48 h 生化指標(biāo)(珋±s，n=7)

表1 各組大鼠造模后48 h 生化指標(biāo)(珋±s，n=7)

注:Scr，肌酸酐;BUN，尿素氮;A 組，假手術(shù)組;B 組，模型組;C組，羥苯磺酸鈣干預(yù)組;a，與A 組比較，P ＜0.05;b，與B 組比較，P ＜0.05

項(xiàng)目 A 組 B 組 C組Scr(μmol/L) 34.3 ±5.7 105.6 ±10.8a 66.6 ±3.1 ab BUN(mmol/L) 4.6 ±0.8 54.4 ± 2.8a 48.4 ±3.9 ab

2.2 病理變化

A 組大鼠各時(shí)間段均未見明顯病理變化;B 組和C 組大鼠造模后24 h 即出現(xiàn)腎病理損傷，造模后48 h 及72 h 病理損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)腎小管重度玻璃樣變性、腎小球萎縮;C 組同時(shí)間段病理變化較B 組輕，但仍比A 組嚴(yán)重(圖1)。

2.3 用ELISA 法檢測造模后48 h 血清MDA、SOD、GSH-Px

與A 組相比，B 組MDA 表達(dá)顯著升高，SOD 及GSH-Px 表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);C 組MDA 表達(dá)較B 組低，SOD 及GSH-Px 表達(dá)較B 組高，但仍未達(dá)到A 組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，表2)。

表2 各組大鼠造模后48 h 血清MDA、SOD、GSH-Px 表達(dá)情況(珋±s，n=7)

表2 各組大鼠造模后48 h 血清MDA、SOD、GSH-Px 表達(dá)情況(珋±s，n=7)

注:MDA，丙二醛;SOD，超氧化物歧化酶;GSH-Px，谷胱甘肽過氧化物酶;A 組，假手術(shù)組;B 組，模型組;C 組，羥苯磺酸鈣干預(yù)組;a，與A 組比較，P ＜0.05;與B 組比較，P ＜0.05

項(xiàng)目 A 組 B 組 C組MDA(nmol/ml) 3.1 ±0.4 6.5 ± 0.9a 4.4 ± 0.9 ab SOD(U/ml) 91.7 ±8.1 66.2 ± 8.0a 78.9 ±11.0ab GSH-Px(U/ml) 90.8 ±7.2 55.7 ±10.4a 62.0 ±10.9 ab

圖1 HE 染色觀察各組大鼠造模后不同時(shí)間段的病理改變(×400)

2.4 TUNEL 法檢測造模后48 h 腎細(xì)胞凋亡

光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，計(jì)算腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)(珋±s，n =7)，3 組的凋亡指數(shù)(%)分別為:A 組(0.6 ± 0.5)%，B 組(38.7 ±4.6)%，C 組(8.3 ±3.6)%。A 組腎細(xì)胞未見明顯凋亡;與A 組相比，B 組大鼠腎細(xì)胞凋亡顯著，凋亡指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與B組相比，C 組大鼠腎細(xì)胞凋亡明顯減輕，凋亡指數(shù)顯著降低，但仍重于A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，圖2)。

3 討論

CIN 是指在使用對比劑48 h 或72 h 內(nèi)出現(xiàn)的腎損傷，通常指血Scr 絕對值升高≥44.2 μmol/L，或相對基礎(chǔ)水平升高≥25%，且排除其他能夠引起腎損傷的因素，血Scr 水平在3 ～5 d 達(dá)到高峰，通常在7 ～10 d 可降至基線水平［1］。目前，CIN 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，較多研究表明，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡可能參與CIN 的發(fā)病機(jī)制［3-5］。

圖2 TUNEL 檢測各組大鼠造模后48 h 腎細(xì)胞凋亡情況(如箭頭所示)×400

在正常情況下，氧化應(yīng)激處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)遭遇外界刺激后，氧化作用超過還原作用，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。目前認(rèn)為，CIN 時(shí)氧自由基生成增多，存在氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧自由基的產(chǎn)生途徑包括黃嘌呤氧化酶途徑和細(xì)胞色素氧化酶途徑，對比劑可通過改變腎血流動(dòng)力學(xué)使腎內(nèi)滲透壓增高，同時(shí)引起腎實(shí)質(zhì)缺血缺氧，激活黃嘌呤氧化酶引起腺苷分解，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生;另外，對比劑可通過降低腎皮質(zhì)中過氧化氫酶和SOD 的活性而導(dǎo)致活性氧的生成增加［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用對比劑后，活性氧產(chǎn)生增加，可導(dǎo)致和增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞毒性損傷，表明氧化損傷是CIN 的主要發(fā)病機(jī)制之一［9］。注射對比劑后，起的大鼠腎毒性起預(yù)防保護(hù)作用［17］。這些研究均 表明羥苯磺酸鈣可作為一種自由基清除劑，具有強(qiáng)產(chǎn)生的氧自由基還可與一氧化氮生成過氧亞硝酸鹽，后者更具氧化性，并且可降低一氧化氮的生物利用度，產(chǎn)生更嚴(yán)重的組織損傷［4］。MDA 是脂質(zhì)氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，是反映氧化應(yīng)激狀態(tài)的經(jīng)典標(biāo)志物，且能夠間接反映氧自由基的生成量;清除體內(nèi)氧自由基的主要系統(tǒng)是抗氧化酶系統(tǒng)，SOD 及GSH-Px 是該系統(tǒng)重要的兩個(gè)因子，SOD 能夠?qū)⒊蹶庪x子歧化為過氧化氫，GSH-Px 可以清除過氧化氫及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物［5，10］。本實(shí)驗(yàn)通過檢測CIN 大鼠模型中以上3 個(gè)因子的表達(dá)情況，觀察到B 組與A 組大鼠相比，MDA 顯著升高，SOD 和GSH-Px 顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了氧化應(yīng)激與CIN 的發(fā)生密切相關(guān)。

細(xì)胞凋亡，又稱細(xì)胞程序性死亡，是指細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的、有一系列酶參與的一個(gè)主動(dòng)的、高度有序的死亡過程，是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)死亡的過程。有研究發(fā)現(xiàn)，對比劑對腎小管具有直接毒性，腎小管上皮細(xì)胞的過度凋亡與CIN 發(fā)病機(jī)制有關(guān)［3］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與A 組相比，B 組大鼠腎細(xì)胞凋亡明顯，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高，說明細(xì)胞凋亡可能參與CIN 的發(fā)病機(jī)制。

羥苯磺酸鈣是一種可以改善微循環(huán)的藥物，依靠其對內(nèi)皮素-1(ET-1)、緩激肽等血管活性物質(zhì)的影響及顯著的抗氧化作用，廣泛應(yīng)用于糖尿病視網(wǎng)膜病變和慢性靜脈功能不全的治療［11-13］，也有其在氧化應(yīng)激水平改善冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)患者缺血/再灌注損傷的研究［14］。近年來，國內(nèi)外較多研究發(fā)現(xiàn)，羥苯磺酸鈣對腎疾病也具有肯定的保護(hù)作用。多項(xiàng)研究表明，羥苯磺酸鈣可通過保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制腎纖維化、減少纖溶酶原激活抑制因子-1(PAI-1)等機(jī)制改善糖尿病腎病［15-16］。另有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，羥苯磺酸鈣還可以通過減少氧化應(yīng)激對慶大霉素引大的抗氧化作用。

本實(shí)驗(yàn)通過研究羥苯磺酸鈣對CIN 大鼠生化、腎病理、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等相關(guān)指標(biāo)的影響，探討羥苯磺酸鈣對CIN 的干預(yù)效果。通過HE 染色及TUNEL 染色觀察到腎損傷以腎小管最為顯著，說明對比劑主要損傷部位為腎小管上皮細(xì)胞。造模大鼠血清中MDA 表達(dá)增加，SOD 及GSH-Px 表達(dá)顯著下降，說明氧化應(yīng)激可能參與CIN 的發(fā)生發(fā)展，與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［3-4］。B 組細(xì)胞凋亡顯著，表明細(xì)胞凋亡亦可能參與CIN 的發(fā)生發(fā)展。此外，C 組腎病理改變及細(xì)胞凋亡較B 組顯著減輕，且MDA 含量較B 組顯著降低，SOD 及GSH-Px 含量較B 組顯著升高，SOD 升高較GSH-Px 明顯，但尚未達(dá)到正常狀態(tài)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羥苯磺酸鈣能夠保護(hù)CIN大鼠的腎功能，可能機(jī)制為羥苯磺酸鈣通過增強(qiáng)SOD 及GSH-Px 的表達(dá)增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)，反應(yīng)性減少M(fèi)DA 表達(dá)，減少氧自由基生成，加快自由基清除，從而對抗氧化應(yīng)激損傷;另外，羥苯磺酸鈣可能通過減少細(xì)胞凋亡發(fā)揮對CIN 模型大鼠的保護(hù)作用。

綜上所述，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡可能參與CIN的發(fā)生發(fā)展，且該過程主要發(fā)生在腎小管上皮細(xì)胞。羥苯磺酸鈣可能是通過減輕CIN 大鼠氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡發(fā)揮腎保護(hù)作用。關(guān)于氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡介導(dǎo)CIN 發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制及羥苯磺酸鈣發(fā)揮腎保護(hù)作用的具體途徑有待進(jìn)一步研究。

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