乙酸脅迫酵母細胞凋亡過程中單個線粒體損傷的拉曼光譜分析

李冰+盧明倩+王巧貞+石貴玉+廖威+黃庶識

摘 要 應(yīng)用激光光鑷拉曼光譜技術(shù)（LTRS）作為一種非入侵分析線粒體的工具，結(jié)合氧電極法、紫外分光光度計法，研究乙酸脅迫酵母細胞后提取的線粒體，以及直接脅迫正常酵母細胞的離體線粒體的拉曼光譜。結(jié)果顯示，乙酸脅迫酵母細胞后提取的線粒體的拉曼光譜，歸屬于核酸的譜峰（1081和1301 cm）、蛋白質(zhì)的譜峰（872，1445，1604和1657 cm）、脂類的譜峰（1125，1301，1445和1657 cm）、Cyt c的特征峰（750和1125 cm）、線粒體呼吸特征峰（1604 cm），都隨著誘導(dǎo)程度的加深而降低，與常規(guī)法測定的指標(biāo)呼吸率，磷氧比，細胞色素C含量的降低，MDA含量的升高的變化趨勢相似；乙酸直接脅迫線粒體的拉曼光譜，歸屬于核酸的譜峰（1081和1301 cm），蛋白質(zhì)的譜峰（872，1445，1604和1657 cm），脂類的譜峰（1125，1301，1445和1657 cm），Cyt c的特征峰（750和1125 cm），線粒體呼吸特征峰（1604 cm），都隨著誘導(dǎo)程度的加深而降低，與常規(guī)法測定的指標(biāo)呼吸率、磷氧比、細胞色素C含量的降低，MDA含量的升高的變化趨勢相似。結(jié)果表明，乙酸脅迫細胞過程中，乙酸進到細胞內(nèi)可能直接作用于線粒體，引起線粒體內(nèi)物質(zhì)的釋放，導(dǎo)致依賴于線粒體途徑的細胞凋亡。

關(guān)鍵詞 拉曼光譜； 乙酸脅迫； 酵母細胞； 線粒體； 凋亡

1 引 言

乙酸是酵母發(fā)酵過程中的一種代謝產(chǎn)物，它不能被酵母代謝，會對酵母細胞產(chǎn)生生理毒害作用，抑制酵母發(fā)酵，如果乙酸等代謝產(chǎn)物進一步積累就會誘發(fā)酵母細胞大量死亡【1，2】。用20～200 mmol/L乙酸對對數(shù)期的釀酒酵母細胞進行脅迫，酵母細胞會發(fā)生染色質(zhì)伴隨著核膜的凝聚、細胞膜磷脂酰絲氨酸的外翻和TUNEL顯陽性表型等的凋亡現(xiàn)象，當(dāng)乙酸脅迫同一種穩(wěn)定時期的釀酒酵母時，發(fā)現(xiàn)依賴于線粒體途徑的酵母細胞凋亡現(xiàn)象【3】；進一步研究發(fā)現(xiàn)，酵母細胞凋亡與ROS的產(chǎn)生、Cyt c從線粒體釋放到細胞質(zhì)中有關(guān)【4】。用一定濃度乙酸處理酵母細胞時，發(fā)現(xiàn)酵母細胞凋亡過程釋放的Cyt c能激活Caspase，使Caspase裂解成為有酶解活性的異源二聚體，并引發(fā)下游的一系列級聯(lián)反應(yīng)，通過裂解特異底物和激活內(nèi)源性核酸酶最終導(dǎo)致細胞凋亡【5，6】。但直到目前為止，酵母的代謝產(chǎn)物如何誘導(dǎo)細胞死亡的過程仍不完全清楚。初步的研究表明，其代謝物可通過誘導(dǎo)線粒體中內(nèi)含物的釋放來啟動細胞不可逆的凋亡程序【7】。

激光光鑷拉曼系統(tǒng)（LTRS）是利用激光束形成的光鑷固定溶液中的單個活細胞，再經(jīng)過瞬時增加激光功率同時激發(fā)和收集細胞的拉曼光譜，具有無損傷、靈敏、快速等優(yōu)勢，是研究溶液中單個活細胞的有力工具。線粒體是真核生物細胞中進行能量代謝的重要細胞器，在功能上線粒體不僅是細胞能量代謝的中樞，還是細胞凋亡的重要參與者；線粒體大小約為0.5～1 μm，在緩沖液中可被激光鑷子所捕獲，避免了由于布朗運動對線粒體的影響。因此，LTRS的應(yīng)用使得離體有活性的單個線粒體的研究成為可能【10】。本研究應(yīng)用LTRS，研究了乙酸脅迫酵母細胞以及離體線粒體過程中的光譜變化，獲得乙酸誘導(dǎo)酵母細胞發(fā)生凋亡的過程中，線粒體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、脂類等大分子物質(zhì)變化的實時信息，是單個線粒體水平上的一種簡單快速分析方法。

2 實驗部分

2.1 菌株與培養(yǎng)基

菌種：安琪釀酒高活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）。

培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基：1%酵母提取物、2%葡萄糖、2%蛋白胨。

2.2 乙酸脅迫酵母細胞以及線粒體的提取

2.2.1 酵母菌的活化 取干酵母粉于YPD液體培養(yǎng)液中，29 ℃、100 r/min培養(yǎng)過夜，將長菌的液體培養(yǎng)基稀釋105倍后涂板，29 ℃培養(yǎng)。挑取單菌落至新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中，在29 ℃以100 r/min培養(yǎng)過夜，按1%的接種量接種到新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中，再在29 ℃以150 r/min培養(yǎng)，當(dāng)OD≈0.8時，即可離心收集菌體。

2.2.2 線粒體的提取 將離心收集的菌體，用菌體預(yù)處理緩沖液處理后加入蝸牛酶緩沖液，再加入原生質(zhì)體裂解液和玻璃珠（425～600 μm）冰上渦旋破壁，破壁后差速離心法提取線粒體【11，12】，線粒體提取液懸浮，4 ℃保存待用。對所提取的線粒體馬上進行穩(wěn)定性與完整性測試，只有在4 ℃條件下，2 h內(nèi)保持結(jié)構(gòu)的完整性以及生理穩(wěn)定性的離體線粒體，才可用于后續(xù)實驗。

2.2.3 不同濃度乙酸脅迫酵母細胞 將離心收集的菌體，用50 mmol/L Tris緩沖液（pH 7.5）洗2～3次，在等體積、終濃度分別為0，50，100和200 mmol/L乙酸中進行處理，在29 ℃以100 r/min緩慢搖60 min，離心去掉處理液，用50 mmol/L Tris緩沖液（pH 7.5）洗3次，稱濕重，提取酵母線粒體。

2.2.4 高濃度乙酸脅迫酵母細胞后不同時間點線粒體的提取

將離心收集的菌體，用50 mmol/L Tris緩沖液（pH 7.5）洗3次，在終濃度為200 mmol/L乙酸中進行處理，在29 ℃以100 r/min緩慢搖，分別在0，30，60和90 min時間點取樣，離心去掉上清液，50 mmol/L Tris緩沖液（pH 7.5）洗3次，稱濕重，提取酵母線粒體。

2.3 乙酸脅迫離體線粒體

將離心收集的酵母細胞，用50 mmol/L Tris緩沖液（pH 7.5）洗3次，稱濕重，提取酵母線粒體。提取后的酵母線粒體，在4 ℃條件下，終濃度為20 mmol/L 乙酸中進行處理，不時搖動離心管使線粒體始終懸浮于處理液中，分別在0，15，30，45，60，75和90 min時間點取樣，離心去掉處理液，線粒體懸浮液洗滌3次后懸浮，4 ℃保存?zhèn)溆?。endprint

2.4 凋亡細胞DAPI染色

細胞凋亡DAPI染色按試劑盒說明書步驟進行（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。離心收集乙酸處理后的細胞，加500 μL DAPI工作液洗1次，再加500 μL DAPI工作液重懸細胞，37 ℃染色15 min，離心收集細胞棄去工作液，加入Buffer A重懸細胞，滴加于載玻片上，熒光顯微鏡以340/380 nm紫外光激發(fā)，鏡檢、拍照。

2.5 線粒體生理生化活性測定

參照文獻＼

圖4是200 mmol/L乙酸脅迫酵母細胞不同時間后提取其線粒體的拉曼光譜及特征峰強度變化趨勢圖。圖中顯示，歸屬于核酸的譜峰（1081和1301 cm），蛋白質(zhì)的譜峰（872，1445，1604和1657 cm），脂類的譜峰（1125，1301，1445和1657 cm），Cyt c的特征峰（750和1125 cm）及線粒體呼吸特征峰（1604 cm）均隨著脅迫時間的增加而降低。所以，200 mmol/L乙酸脅迫下，酵母細胞線粒體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)、脂類、Cyt c的譜峰強度變化和時間存在依賴關(guān)系。

3.4 乙酸脅迫酵母細胞后其線粒體生理生化指標(biāo)

圖5是200 mmol/L乙酸脅迫酵母細胞不同時間后，在不同時間點提取其線粒體后所測定的的生理生化指標(biāo)變化趨勢。圖5A是乙酸脅迫細胞后其線粒體在不同時間點的呼吸率（RCR）與磷氧比（P/O）值，RCR和P/O反映線粒體氧化磷酸化的偶聯(lián)程度，圖5A顯示，隨著脅迫時間的延長RCR和P/O均呈下降趨勢，說明線粒體的氧化磷酸化偶聯(lián)程度降低，功能受損【23】，呼吸下降，與圖4中呼吸特征峰1604 cm

的變化相似。圖5B是乙酸脅迫細胞后其線粒體在不同時間點的丙二醛（MDA）和Cyt c含量變化趨勢圖。MDA是膜脂過氧化的一種終產(chǎn)物，而且，MDA還具有較強的細胞毒素，對線粒體的呼吸功能具有顯著的抑制作用【24】，圖5B顯示，隨著乙酸脅迫時間的延長，MDA含量增加，說明線粒體膜脂過氧化程度加深。Cyt c是存在于膜間隙的水溶性蛋白質(zhì)，正常情況下不能自由的通過線粒體外膜，當(dāng)線粒體外膜通透性增加時，會被釋放到胞漿中【25，26】；隨著乙酸脅迫時間的延長，Cyt c含量降低，說明線粒體外膜受到破壞。圖5中的生理生化指標(biāo)與圖4脂類、Cyt c、呼吸的拉曼峰強度變化基本一致。

當(dāng)細胞受到凋亡信號的刺激時，可導(dǎo)致線粒體跨膜電位降低，外膜破裂，促使線粒體內(nèi)各種凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，誘導(dǎo)因子的釋放可引起線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的降低。而線粒體跨膜電位的降低，可使氧化磷酸化過程解偶聯(lián)，大量的ROS產(chǎn)生，ATP的水解大于合成，造成ATP濃度迅速降低，胞質(zhì)ADP和膜上肌酸磷酸酯濃度增高，影響線粒體的呼吸作用【27】。線粒體中的線粒體DNA（mtDNA），裸露于基質(zhì)中，缺乏組合蛋白的保護，最易受到傷害，而且催化mtDNA復(fù)制的DNA聚合酶Y不具有校正功能，同時還缺乏有效的修復(fù)酶，所以mtDNA一旦受到損傷不易被修復(fù)，造成呼吸鏈功能受損，進一步積累ROS【28】，而線粒體內(nèi)外膜的破裂可使一些受損傷的mtDNA擴散到胞漿中，引起核酸含量的降低。Cytc從破裂的線粒體中釋放出來，導(dǎo)致線粒體呼吸鏈功能出現(xiàn)異常，引起ATP的減少，影響線粒體的呼吸作用【27】。

3.5 乙酸脅迫酵母離體線粒體拉曼光譜

圖6是提取酵母線粒體后，用20 mmol/L乙酸直接脅迫離體線粒體不同時間的拉曼光譜及特征峰強度變化趨勢圖。結(jié)果顯示，歸屬于核酸的譜峰（1081和1301 cm

），蛋白質(zhì)的譜峰（872，1445，1604和1657 cm

），脂類的譜峰（1125，1301，1445和1657 cm

），Cyt c的特征峰（1125 cm

）及線粒體呼吸特征峰（1604 cm

）均隨著脅迫時間的延長而降低，與乙酸直接脅迫細胞后，提取線粒體測定其光譜的變化趨勢一致。提示乙酸直接脅迫細胞后，乙酸進到胞內(nèi)可能直接作用于線粒體，造成生物大分子的流失。

圖6 20 mmol/L乙酸脅迫酵母離體線粒體不同時間拉曼光譜圖（a）及主要特征峰的強度變化趨勢（b， c）

Fig.6 Raman spectra of yeast mitochondria in vitro induced with 20 mmol/L of acetic acid in different times （a） and the trends of major band intensities （b and c）

3.6 乙酸脅迫酵母離體線粒體生理生化指標(biāo)

圖7是20 mmol/L乙酸脅迫酵母離體線粒體后，不同時間點的生理生化指標(biāo)。呼吸率、磷氧比（圖7a）和Cyt c含量（圖7b）隨著脅迫時間的延長而下降，與圖6中呼吸特征峰1604 cm

和Cyt c特征峰1125 cm

的變化相似。MDA的含量（圖7b）隨著乙酸脅迫時間的延長而上升，與圖6中的拉曼譜峰變化趨勢相似。這些生理生化指標(biāo)與圖5結(jié)果一致。

圖7 20 mmol/L乙酸脅迫酵母離體線粒體后其不同時間點的生理生化指標(biāo)。（a）線粒體呼吸率（RCR）以及磷氧比（P/O），（b）MDA含量以及Cyt c含量。

Fig.7 Changes of RCR （a）， P/O （a）， MDA content （b），Cyt c concentration （b） of yeast mitochondria in vitro induced with 20 mmol/L of acetic acid in different times

4 結(jié) 論endprint

乙酸脅迫酵母細胞后提取線粒體，以及乙酸直接脅迫離體線粒體，歸屬核酸、蛋白質(zhì)、脂類、Cyt c、線粒體呼吸特征峰強度均隨著脅迫程度的加深而降低。表明在乙酸脅迫酵母細胞過程中，乙酸進入到細胞內(nèi)可能直接作用于線粒體，導(dǎo)致線粒體膜脂質(zhì)過氧化程度加深，線粒體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)、脂類、Cyt c含量的降低，呼吸功能衰竭，出現(xiàn)依賴于線粒體途徑的細胞凋亡現(xiàn)象。LTRS可以作為一種非入侵性分析線粒體的有用工具。

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