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    2015-07-09 10:27林江慧張建偉肖曉毛高建平張惠芳魏崢
    分析化學(xué) 2015年5期

    林江慧 張建偉 肖曉毛 高建平 張惠芳 魏崢

    摘 要 建立了含N-乙?;嗡毓烟堑姆蛛x提純及其序列結(jié)構(gòu)分析方法。首先應(yīng)用肝素酶Ⅰ深度酶解低分子量肝素來(lái)富集含N-乙酰化結(jié)構(gòu)寡糖,通過(guò)Bio-Gel P10凝膠色譜法分離制備了包括二糖至十四糖的系列肝素寡糖粗樣品,ProPac PA-1強(qiáng)陰離子高效液相色譜(SAX-HPLC)等方法對(duì)粗樣品進(jìn)一步分離,提純得到4種六糖和3種八糖片段。其次應(yīng)用肝素酶Ⅰ, Ⅱ和Ⅲ復(fù)合酶解與 HPLC法分析各純化寡糖的二糖組分,并結(jié)合肝素酶Ⅰ底物特異性,初步推斷4種六糖和3種八糖的序列結(jié)構(gòu)。在寡糖的糖鏈兩端均含有N-硫酸化二糖,而N-乙?;欠植荚谔擎湲?dāng)中。應(yīng)用電噴霧離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-IT-TOF-MS)在負(fù)離子模式下進(jìn)一步表征寡糖并分析其裂解規(guī)律。結(jié)果表明,各寡糖中均出現(xiàn)大量因SO2

    3丟失形成的碎片離子峰,六糖中主要有雙電荷和三電荷碎片離子峰;在八糖中出現(xiàn)了一系列從雙電荷至五電荷的離子峰。各寡糖的雙電荷離子峰質(zhì)荷比進(jìn)一步確定了上述寡糖的序列結(jié)構(gòu)。六糖的裂解規(guī)律表明,裂解主要存在于糖苷鍵,N-乙酰葡糖胺和糖醛酸上的裂解方式分別為0,2X和0,2Z。本研究提供了切實(shí)有效的分離、分析未知結(jié)構(gòu)肝素寡糖序列的新方法。

    關(guān)鍵詞 肝素寡糖; 飛行時(shí)間質(zhì)譜; 肝素酶; 序列測(cè)定

    1 引 言

    肝素(Heparin, HP)是帶有大量負(fù)電荷的線性糖胺聚糖,在細(xì)胞表面和細(xì)胞基質(zhì)中廣泛表達(dá)。HP與眾多的蛋白質(zhì)相互作用,調(diào)控多種生物學(xué)功能。除了抗凝血及抗血拴生成外, 肝素還具有抗平滑肌細(xì)胞增殖、抗炎癥、抗腫瘤及抗病毒等, 而這些生物活性與肝素的特異結(jié)構(gòu)密切相關(guān)【1~3】。

    肝素聚糖鏈由50~200個(gè)重復(fù)的二糖單元構(gòu)成。HP二糖是由己糖醛酸(Hexuronic acid, Hex A)與葡萄糖胺(Glucosamine, GlcN)以1-4糖苷鍵連接而成。己糖醛酸有兩種結(jié)構(gòu),即葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸。己糖醛酸上的修飾有2位氧硫酸化,葡萄糖胺上的修飾有N位硫酸化、 N位乙?;6位氧硫酸化,以及一些稀有結(jié)構(gòu) C3位硫酸化。這些修飾的組合構(gòu)成了最常見(jiàn)的8種二糖單元(如表1所示)【4,5】。迄今為止評(píng)價(jià)HP結(jié)構(gòu)主要是通過(guò)分析其酶解二糖組分,對(duì)功能性寡糖的序列研究報(bào)道不多。

    高效液相色譜、凝膠色譜、毛細(xì)管電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等技術(shù)已被應(yīng)用于HP結(jié)構(gòu)的研究【6】。NMR雖然能夠測(cè)定肝素寡糖結(jié)構(gòu),但是需要樣品純度高且量較大,這限制了它在微量結(jié)構(gòu)寡糖分析中的應(yīng)用。由于質(zhì)譜精度高,可快速分析糖類(lèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)。近年來(lái),質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)被大量應(yīng)用于分析HP二糖或寡糖。Kailemia等應(yīng)用質(zhì)譜表征了一個(gè)類(lèi)似肝素結(jié)構(gòu)的五糖藥物【7】。Huang等通過(guò)化學(xué)修飾,全序列分析了合成的肝素、硫酸類(lèi)肝素寡糖類(lèi)似物【8】。Huang等應(yīng)用質(zhì)譜電子轉(zhuǎn)移裂解技術(shù)分析了硫酸類(lèi)肝素寡糖【9】。Shi等應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜分析了肝素/硫酸類(lèi)肝素寡糖的SO2

    4丟失【10】。Kailemia等應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜分析了酶化學(xué)合成的肝素結(jié)構(gòu)【11】。

    肝素大部分結(jié)構(gòu)是高硫結(jié)構(gòu),N-乙?;Y(jié)構(gòu)含量較低,但這部分結(jié)構(gòu)對(duì)于肝素功能也是至關(guān)重要的【11】。肝素六糖和八糖通過(guò)特殊的序列與多種蛋白質(zhì)、酶等相互作用調(diào)控肝素的生理功能。肝素的抗凝血和抗帶狀皰疹病毒作用的六糖片段中C3位硫酸化和N位乙酰化部位是活性的必需位點(diǎn)【12】。肝素的N位基團(tuán)是它與多種細(xì)胞增長(zhǎng)因子相互結(jié)合的必要位點(diǎn)【13,14】,并且具有抑制腫瘤細(xì)胞來(lái)源的類(lèi)肝素酶的活性【15】。最引人關(guān)注的是,低分子量肝素在臨床上有直接的抗癌活性,它有助于延長(zhǎng)腫瘤患者的生存時(shí)間,推測(cè)這與肝素的微量結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系【16,17】。

    分析微量結(jié)構(gòu)肝素寡糖的序列,不僅對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的研究具有重要意義,同時(shí)也為肝素作為有效的抑制劑提供了理論基礎(chǔ)。肝素酶是制備二糖和寡糖的重要工具酶。其中肝素酶I對(duì)含有N位和C2位SO2

    4的高硫二糖具有底物特異性【6】,對(duì)含N-乙?;土蚪Y(jié)構(gòu)不酶解。

    本研究基于肝素酶Ⅰ底物特異性,采用二糖組分分析法,酶解低分子量肝素,分離制備含N-乙?;嗡毓烟牵醪酱_定了它們的序列結(jié)構(gòu),并通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定寡糖的質(zhì)荷比及裂解規(guī)律。與文獻(xiàn)報(bào)道中用質(zhì)譜表征合成的已知結(jié)構(gòu)的肝素寡糖類(lèi)似物相比,本研究采用天然肝素對(duì)其寡糖的研究更具現(xiàn)實(shí)意義。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    1200系列高效液相色譜儀(HPLC,美國(guó)Agilent公司);Christ Alpha 1-4 LD Plus冷凍干燥機(jī)、Christ RVC 2-18真空離心濃縮儀(德國(guó)Christ公司); MS-IT-TOF離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜、2450型紫外分光光度計(jì) (日本島津公司)。ProPac PA-1強(qiáng)陰離子交換(SAX)色譜柱(250 mm×4.0 mm,美國(guó)Dionex公司);Bio-Gel P10凝膠色譜柱 (115 cm × 1.7 cm,fine grade,美國(guó)Bio-Rad公司)。

    低分子量肝素(分子量1000~14000 Da,英國(guó)Leo Laboratories公司);8種肝素標(biāo)準(zhǔn)二糖(ΔHexA(2S)-GlcNAc,ΔHexA-GlcNAc,ΔHexA-GlcNAc(6S),ΔHexA(2S)-GlcNS,ΔHexA-GlcNS,ΔHexA-GlcNS(6S),ΔHexA(2S)-GlcNAc(6S),ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)),四糖(dp4),六糖(dp6),八糖(dp8),十糖(dp10),十二糖(dp12), 十四糖(dp14) (英國(guó)Idroun公司);肝素酶Ⅰ,肝素酶Ⅱ, 肝素酶 Ⅲ(美國(guó)Sigma公司);乙腈(色譜純,德國(guó)Merck KGaA 公司);乙酸銨,碳酸氫銨(分析純,美國(guó)Sigma公司);NaCl(色譜純,美國(guó)Sigma公司);BSA(生物級(jí),美國(guó)MPBio公司);其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。endprint

    2.2 低分子量肝素深度酶解

    200 mg低分子量肝素溶解在2 mL 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖溶液(含0.1 mmol/L乙酸鈣和100 μg/mL BSA, pH 7.0)中,加入50 mIU肝素酶Ⅰ在37 ℃酶解12 h后,加入50 mIU肝素酶Ⅰ繼續(xù)酶解12 h。加熱至沸3 min終止反應(yīng)。10000 r/min離心10 min,取上清液,凍干。

    2.3 肝素寡糖的粗分離制備

    上述樣品用1 mL 0.2 mol/L NH4HCO3溶解,上樣到Bio-Gel P10凝膠色譜層析柱(115 cm×1.7 cm)。0.2 mol/L NH4HCO3洗脫,流速0.2 mL/min。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm,依次收集每個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的糖片段。55 ℃加熱24 h 揮發(fā)NH4HCO3,凍干獲得肝素寡糖粗樣品。

    2.4 肝素寡糖的細(xì)分與制備

    ProPac PA-1柱強(qiáng)陰離子交換HPLC(250 mm×4.0 mm)進(jìn)一步分離2.3節(jié)中獲得的dp6和dp8寡糖。流動(dòng)相A 為超純水(以 HCl調(diào)至pH 3.5),流動(dòng)相B 為, 2 mol/l NaCl(以 HCl調(diào)至pH 3.5)。dp6和dp8粗樣品溶解在1 mL水(pH 3.5)中,上樣。流速1 mL/min,線性梯度洗脫:0~2 min, 100% A; 2.1~7.1 min, 100%~60% A; 7.1~47.1 min, 60%~25% A。檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm。收集色譜峰對(duì)應(yīng)的寡糖樣品,截留分子量500透析膜(美國(guó)Spectrum公司)透析2天,凍干,得到 dp6a, dp6b, dp6c, dp6d, dp8a, dp8b和dp8c 純品。

    2.5 肝素寡糖組分分析

    2.5.1 各粗樣組分分析 取2.3節(jié)制備的四糖(dp4)、六糖(dp6)、八糖(dp8)、十糖(dp10)、十二糖(dp12)、十四糖(dp14)、大于十四糖(>dp14)各50 μg,分別加入10 mIU肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全酶解,SAX HPLC分離。色譜條件如下:A 為超純水(以 HCl調(diào)至pH 3.5),流動(dòng)相B 為 2 mol/L NaCl(以HCl調(diào)至pH 3.5)。樣品溶解于1 mL A中。色譜流速1 mL/min,線性梯度洗脫:0~2 min, 100% A;2.1~35.1 min,100%~75% A;35.1~57.1 min,75%~50% A。232 nm紫外檢測(cè)。

    2.5.2 寡糖dp6a, dp6b, dp6c, dp6d, dp8a, dp8b和dp8c 純樣品組分分析

    取2.4節(jié)制備的dp6a , dp6b, dp6c, dp6d, dp8a , dp8b和dp8c各100 μg, 分別加入5 mIU的肝素酶Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ完全酶解,SAX HPLC分離,色譜分離條件同上。

    2.6 肝素寡糖質(zhì)譜分析

    離子化模式:ESI源;負(fù)離子模式;霧化氣(高純N2)流速1.50 L/min;干燥氣(高純N2)流速10 L/min;加熱模塊溫度200 ℃;曲形脫溶劑管(CDL)

    溫度200 ℃;離子源電壓4.5 kV;檢測(cè)器電壓1.6 kV;質(zhì)量掃描范圍:m/z 200~2000。準(zhǔn)確吸取10 μL 50 μg/mL的dp6a, dp6b, dp6c, dp6d, dp8a, dp8b, dp8c,在負(fù)離子模式下,手動(dòng)注入質(zhì)譜儀。

    圖1 凝膠色譜柱分離肝素寡糖的色譜圖

    Fig.1 Separation of heparin oligosaccharides on

    Bio-Gel P10 chromatographic column

    洗脫液: 0.2 mol/L NH4HCO3,流速: 0.2 mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng): 232 nm。

    Elution: 0.2 mol/L NH4HCO3, flow rate: 0.2 mL/min, UV detection wavelength: 232 nm.

    3 結(jié)果與討論

    3.1 肝素寡糖的粗分離及組分分析

    如圖1所示,肝素寡糖混合樣品經(jīng)Bio-Gel P10 凝膠層析柱,依據(jù)分子量大小分離,獲得肝素二糖及一系列寡糖。通過(guò)與寡糖標(biāo)樣的洗脫時(shí)間對(duì)照(外標(biāo)法)可知,圖1中各峰對(duì)應(yīng)二糖(dp2)、四糖(dp4)、六糖(dp6)、八糖(dp8)、十糖(dp10)、十二糖(dp12)、十四糖(dp14)以及 大于十四糖(>dp14)。從圖1可見(jiàn),Bio-GelP10凝膠色譜柱能夠完全分離7種肝素寡糖和二糖,其中dp2的含量最高,隨著寡糖分子量的增加,含量逐漸減少。由于肝素酶I對(duì)含有3個(gè)SO2

    4的高硫二糖具有底物特異性【6】,不能酶解含N-乙?;土蚨?,因此推斷以上系列寡糖中含有不同長(zhǎng)度的N-乙?;墙Y(jié)構(gòu)。

    2.3節(jié)中制備的寡糖dp4至>dp14按2.5.1節(jié)方法經(jīng)肝素酶酶解-SAXHPLC分離,得到其二糖組分見(jiàn)表2,dp4至>dp14 的寡糖中均含有4種N-乙?;牵╠p4除外),4種N-硫酸化二糖。ΔHexA-GlcNAc隨著寡糖分子量的增加,含量呈遞增趨勢(shì)。同樣,ΔHexA-GlcNAc(6S) 和ΔHexA(2S)-GlcNAc的含量也呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。ΔHexA(2S)-GlcNAc(6S)含量變化不太。dp6至>dp14 的系列寡糖中,含N-乙酰化總二糖含量明顯遞增。上述結(jié)果表明,隨著寡糖分子量的增加,N-乙?;窃黾拥目赡軅€(gè)數(shù)為1~3個(gè)。

    N-硫酸化二糖含量變動(dòng)趨勢(shì)與N-乙?;遣煌?。從dp6至>dp14 的寡糖中ΔHexA-GlcNS含量呈明顯遞增趨勢(shì),變動(dòng)范圍為1.9%→16.5%。ΔHexA-GlcNS(6S)呈遞減趨勢(shì)(20.8%→9.8%)。ΔHexA(2S)-GlcNS和ΔHexA(2S)-GlcNAc(6S)的含量變化不大,僅有3.0%和2.0%左右的波動(dòng)。從表2可見(jiàn),以>dp14為例,N-硫酸化二糖(NS-dp2)占總二糖含量為59.5%,2-O硫酸化二糖占43.5%,6-O硫酸化二糖(6S-dp2)占49.0%。寡糖系列中,隨著分子量的增大,NS-dp2百分含量(84.3%→59.5%),2S-dp2百分含量(84%→43.5%)和 6S-dp2百分含量(87.0%→49.0%)都呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。endprint

    3.2 dp6,dp8分離提純及序列分析

    利用SAX-HPLC進(jìn)一步分離dp6和dp8寡糖(見(jiàn)圖2), dp6主要含有4個(gè)寡糖為dp6a, dp6b, dp6c, dp6d和dp8主要有3個(gè)寡糖dp8a, dp8b和dp8c。各提純組分經(jīng)肝素酶Ⅰ, Ⅱ和Ⅲ完全酶解后,SAX-HPLC分析,外標(biāo)法鑒定其二糖組成及摩爾比(表2)。

    表3列出了按2.5.2節(jié)中分析dp6和dp8 細(xì)分寡糖的組分及摩爾比。dp6a含有兩種二糖結(jié)構(gòu)ΔHexA-GlcNS, ΔHexA2S-GlcNS6S,摩爾比接近2∶1?;诟嗡孛涪竦孜锾禺愋?,二糖GlcA2S-GlcNS6S在寡糖結(jié)構(gòu)的末端。因此,dp6a序列結(jié)構(gòu)為ΔHexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6S。按同理分析為了解質(zhì)譜在測(cè)試寡糖中的精確度,表4列出了雙電荷理論質(zhì)荷比、實(shí)測(cè)質(zhì)荷比及偏差。偏差范圍在

    34.1~37.4 ppm 之間。肝素寡糖質(zhì)譜相對(duì)較復(fù)雜,質(zhì)譜數(shù)據(jù)中還能觀測(cè)到一系列的同位素峰。

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