• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    含N—乙?;嗡毓烟堑闹苽浼靶蛄蟹治?/h1>
    2015-07-09 10:27林江慧張建偉肖曉毛高建平張惠芳魏崢
    分析化學(xué) 2015年5期

    林江慧 張建偉 肖曉毛 高建平 張惠芳 魏崢

    摘 要 建立了含N-乙?;嗡毓烟堑姆蛛x提純及其序列結(jié)構(gòu)分析方法。首先應(yīng)用肝素酶Ⅰ深度酶解低分子量肝素來(lái)富集含N-乙酰化結(jié)構(gòu)寡糖,通過(guò)Bio-Gel P10凝膠色譜法分離制備了包括二糖至十四糖的系列肝素寡糖粗樣品,ProPac PA-1強(qiáng)陰離子高效液相色譜(SAX-HPLC)等方法對(duì)粗樣品進(jìn)一步分離,提純得到4種六糖和3種八糖片段。其次應(yīng)用肝素酶Ⅰ, Ⅱ和Ⅲ復(fù)合酶解與 HPLC法分析各純化寡糖的二糖組分,并結(jié)合肝素酶Ⅰ底物特異性,初步推斷4種六糖和3種八糖的序列結(jié)構(gòu)。在寡糖的糖鏈兩端均含有N-硫酸化二糖,而N-乙?;欠植荚谔擎湲?dāng)中。應(yīng)用電噴霧離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-IT-TOF-MS)在負(fù)離子模式下進(jìn)一步表征寡糖并分析其裂解規(guī)律。結(jié)果表明,各寡糖中均出現(xiàn)大量因SO2

    3丟失形成的碎片離子峰,六糖中主要有雙電荷和三電荷碎片離子峰;在八糖中出現(xiàn)了一系列從雙電荷至五電荷的離子峰。各寡糖的雙電荷離子峰質(zhì)荷比進(jìn)一步確定了上述寡糖的序列結(jié)構(gòu)。六糖的裂解規(guī)律表明,裂解主要存在于糖苷鍵,N-乙酰葡糖胺和糖醛酸上的裂解方式分別為0,2X和0,2Z。本研究提供了切實(shí)有效的分離、分析未知結(jié)構(gòu)肝素寡糖序列的新方法。

    關(guān)鍵詞 肝素寡糖; 飛行時(shí)間質(zhì)譜; 肝素酶; 序列測(cè)定

    1 引 言

    肝素(Heparin, HP)是帶有大量負(fù)電荷的線性糖胺聚糖,在細(xì)胞表面和細(xì)胞基質(zhì)中廣泛表達(dá)。HP與眾多的蛋白質(zhì)相互作用,調(diào)控多種生物學(xué)功能。除了抗凝血及抗血拴生成外, 肝素還具有抗平滑肌細(xì)胞增殖、抗炎癥、抗腫瘤及抗病毒等, 而這些生物活性與肝素的特異結(jié)構(gòu)密切相關(guān)【1~3】。

    肝素聚糖鏈由50~200個(gè)重復(fù)的二糖單元構(gòu)成。HP二糖是由己糖醛酸(Hexuronic acid, Hex A)與葡萄糖胺(Glucosamine, GlcN)以1-4糖苷鍵連接而成。己糖醛酸有兩種結(jié)構(gòu),即葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸。己糖醛酸上的修飾有2位氧硫酸化,葡萄糖胺上的修飾有N位硫酸化、 N位乙?;6位氧硫酸化,以及一些稀有結(jié)構(gòu) C3位硫酸化。這些修飾的組合構(gòu)成了最常見(jiàn)的8種二糖單元(如表1所示)【4,5】。迄今為止評(píng)價(jià)HP結(jié)構(gòu)主要是通過(guò)分析其酶解二糖組分,對(duì)功能性寡糖的序列研究報(bào)道不多。

    高效液相色譜、凝膠色譜、毛細(xì)管電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等技術(shù)已被應(yīng)用于HP結(jié)構(gòu)的研究【6】。NMR雖然能夠測(cè)定肝素寡糖結(jié)構(gòu),但是需要樣品純度高且量較大,這限制了它在微量結(jié)構(gòu)寡糖分析中的應(yīng)用。由于質(zhì)譜精度高,可快速分析糖類(lèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)。近年來(lái),質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)被大量應(yīng)用于分析HP二糖或寡糖。Kailemia等應(yīng)用質(zhì)譜表征了一個(gè)類(lèi)似肝素結(jié)構(gòu)的五糖藥物【7】。Huang等通過(guò)化學(xué)修飾,全序列分析了合成的肝素、硫酸類(lèi)肝素寡糖類(lèi)似物【8】。Huang等應(yīng)用質(zhì)譜電子轉(zhuǎn)移裂解技術(shù)分析了硫酸類(lèi)肝素寡糖【9】。Shi等應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜分析了肝素/硫酸類(lèi)肝素寡糖的SO2

    4丟失【10】。Kailemia等應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜分析了酶化學(xué)合成的肝素結(jié)構(gòu)【11】。

    肝素大部分結(jié)構(gòu)是高硫結(jié)構(gòu),N-乙?;Y(jié)構(gòu)含量較低,但這部分結(jié)構(gòu)對(duì)于肝素功能也是至關(guān)重要的【11】。肝素六糖和八糖通過(guò)特殊的序列與多種蛋白質(zhì)、酶等相互作用調(diào)控肝素的生理功能。肝素的抗凝血和抗帶狀皰疹病毒作用的六糖片段中C3位硫酸化和N位乙酰化部位是活性的必需位點(diǎn)【12】。肝素的N位基團(tuán)是它與多種細(xì)胞增長(zhǎng)因子相互結(jié)合的必要位點(diǎn)【13,14】,并且具有抑制腫瘤細(xì)胞來(lái)源的類(lèi)肝素酶的活性【15】。最引人關(guān)注的是,低分子量肝素在臨床上有直接的抗癌活性,它有助于延長(zhǎng)腫瘤患者的生存時(shí)間,推測(cè)這與肝素的微量結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系【16,17】。

    分析微量結(jié)構(gòu)肝素寡糖的序列,不僅對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的研究具有重要意義,同時(shí)也為肝素作為有效的抑制劑提供了理論基礎(chǔ)。肝素酶是制備二糖和寡糖的重要工具酶。其中肝素酶I對(duì)含有N位和C2位SO2

    4的高硫二糖具有底物特異性【6】,對(duì)含N-乙?;土蚪Y(jié)構(gòu)不酶解。

    本研究基于肝素酶Ⅰ底物特異性,采用二糖組分分析法,酶解低分子量肝素,分離制備含N-乙?;嗡毓烟牵醪酱_定了它們的序列結(jié)構(gòu),并通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定寡糖的質(zhì)荷比及裂解規(guī)律。與文獻(xiàn)報(bào)道中用質(zhì)譜表征合成的已知結(jié)構(gòu)的肝素寡糖類(lèi)似物相比,本研究采用天然肝素對(duì)其寡糖的研究更具現(xiàn)實(shí)意義。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    1200系列高效液相色譜儀(HPLC,美國(guó)Agilent公司);Christ Alpha 1-4 LD Plus冷凍干燥機(jī)、Christ RVC 2-18真空離心濃縮儀(德國(guó)Christ公司); MS-IT-TOF離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜、2450型紫外分光光度計(jì) (日本島津公司)。ProPac PA-1強(qiáng)陰離子交換(SAX)色譜柱(250 mm×4.0 mm,美國(guó)Dionex公司);Bio-Gel P10凝膠色譜柱 (115 cm × 1.7 cm,fine grade,美國(guó)Bio-Rad公司)。

    低分子量肝素(分子量1000~14000 Da,英國(guó)Leo Laboratories公司);8種肝素標(biāo)準(zhǔn)二糖(ΔHexA(2S)-GlcNAc,ΔHexA-GlcNAc,ΔHexA-GlcNAc(6S),ΔHexA(2S)-GlcNS,ΔHexA-GlcNS,ΔHexA-GlcNS(6S),ΔHexA(2S)-GlcNAc(6S),ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)),四糖(dp4),六糖(dp6),八糖(dp8),十糖(dp10),十二糖(dp12), 十四糖(dp14) (英國(guó)Idroun公司);肝素酶Ⅰ,肝素酶Ⅱ, 肝素酶 Ⅲ(美國(guó)Sigma公司);乙腈(色譜純,德國(guó)Merck KGaA 公司);乙酸銨,碳酸氫銨(分析純,美國(guó)Sigma公司);NaCl(色譜純,美國(guó)Sigma公司);BSA(生物級(jí),美國(guó)MPBio公司);其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。endprint

    2.2 低分子量肝素深度酶解

    200 mg低分子量肝素溶解在2 mL 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖溶液(含0.1 mmol/L乙酸鈣和100 μg/mL BSA, pH 7.0)中,加入50 mIU肝素酶Ⅰ在37 ℃酶解12 h后,加入50 mIU肝素酶Ⅰ繼續(xù)酶解12 h。加熱至沸3 min終止反應(yīng)。10000 r/min離心10 min,取上清液,凍干。

    2.3 肝素寡糖的粗分離制備

    上述樣品用1 mL 0.2 mol/L NH4HCO3溶解,上樣到Bio-Gel P10凝膠色譜層析柱(115 cm×1.7 cm)。0.2 mol/L NH4HCO3洗脫,流速0.2 mL/min。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm,依次收集每個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的糖片段。55 ℃加熱24 h 揮發(fā)NH4HCO3,凍干獲得肝素寡糖粗樣品。

    2.4 肝素寡糖的細(xì)分與制備

    ProPac PA-1柱強(qiáng)陰離子交換HPLC(250 mm×4.0 mm)進(jìn)一步分離2.3節(jié)中獲得的dp6和dp8寡糖。流動(dòng)相A 為超純水(以 HCl調(diào)至pH 3.5),流動(dòng)相B 為, 2 mol/l NaCl(以 HCl調(diào)至pH 3.5)。dp6和dp8粗樣品溶解在1 mL水(pH 3.5)中,上樣。流速1 mL/min,線性梯度洗脫:0~2 min, 100% A; 2.1~7.1 min, 100%~60% A; 7.1~47.1 min, 60%~25% A。檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm。收集色譜峰對(duì)應(yīng)的寡糖樣品,截留分子量500透析膜(美國(guó)Spectrum公司)透析2天,凍干,得到 dp6a, dp6b, dp6c, dp6d, dp8a, dp8b和dp8c 純品。

    2.5 肝素寡糖組分分析

    2.5.1 各粗樣組分分析 取2.3節(jié)制備的四糖(dp4)、六糖(dp6)、八糖(dp8)、十糖(dp10)、十二糖(dp12)、十四糖(dp14)、大于十四糖(>dp14)各50 μg,分別加入10 mIU肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全酶解,SAX HPLC分離。色譜條件如下:A 為超純水(以 HCl調(diào)至pH 3.5),流動(dòng)相B 為 2 mol/L NaCl(以HCl調(diào)至pH 3.5)。樣品溶解于1 mL A中。色譜流速1 mL/min,線性梯度洗脫:0~2 min, 100% A;2.1~35.1 min,100%~75% A;35.1~57.1 min,75%~50% A。232 nm紫外檢測(cè)。

    2.5.2 寡糖dp6a, dp6b, dp6c, dp6d, dp8a, dp8b和dp8c 純樣品組分分析

    取2.4節(jié)制備的dp6a , dp6b, dp6c, dp6d, dp8a , dp8b和dp8c各100 μg, 分別加入5 mIU的肝素酶Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ完全酶解,SAX HPLC分離,色譜分離條件同上。

    2.6 肝素寡糖質(zhì)譜分析

    離子化模式:ESI源;負(fù)離子模式;霧化氣(高純N2)流速1.50 L/min;干燥氣(高純N2)流速10 L/min;加熱模塊溫度200 ℃;曲形脫溶劑管(CDL)

    溫度200 ℃;離子源電壓4.5 kV;檢測(cè)器電壓1.6 kV;質(zhì)量掃描范圍:m/z 200~2000。準(zhǔn)確吸取10 μL 50 μg/mL的dp6a, dp6b, dp6c, dp6d, dp8a, dp8b, dp8c,在負(fù)離子模式下,手動(dòng)注入質(zhì)譜儀。

    圖1 凝膠色譜柱分離肝素寡糖的色譜圖

    Fig.1 Separation of heparin oligosaccharides on

    Bio-Gel P10 chromatographic column

    洗脫液: 0.2 mol/L NH4HCO3,流速: 0.2 mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng): 232 nm。

    Elution: 0.2 mol/L NH4HCO3, flow rate: 0.2 mL/min, UV detection wavelength: 232 nm.

    3 結(jié)果與討論

    3.1 肝素寡糖的粗分離及組分分析

    如圖1所示,肝素寡糖混合樣品經(jīng)Bio-Gel P10 凝膠層析柱,依據(jù)分子量大小分離,獲得肝素二糖及一系列寡糖。通過(guò)與寡糖標(biāo)樣的洗脫時(shí)間對(duì)照(外標(biāo)法)可知,圖1中各峰對(duì)應(yīng)二糖(dp2)、四糖(dp4)、六糖(dp6)、八糖(dp8)、十糖(dp10)、十二糖(dp12)、十四糖(dp14)以及 大于十四糖(>dp14)。從圖1可見(jiàn),Bio-GelP10凝膠色譜柱能夠完全分離7種肝素寡糖和二糖,其中dp2的含量最高,隨著寡糖分子量的增加,含量逐漸減少。由于肝素酶I對(duì)含有3個(gè)SO2

    4的高硫二糖具有底物特異性【6】,不能酶解含N-乙?;土蚨?,因此推斷以上系列寡糖中含有不同長(zhǎng)度的N-乙?;墙Y(jié)構(gòu)。

    2.3節(jié)中制備的寡糖dp4至>dp14按2.5.1節(jié)方法經(jīng)肝素酶酶解-SAXHPLC分離,得到其二糖組分見(jiàn)表2,dp4至>dp14 的寡糖中均含有4種N-乙?;牵╠p4除外),4種N-硫酸化二糖。ΔHexA-GlcNAc隨著寡糖分子量的增加,含量呈遞增趨勢(shì)。同樣,ΔHexA-GlcNAc(6S) 和ΔHexA(2S)-GlcNAc的含量也呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。ΔHexA(2S)-GlcNAc(6S)含量變化不太。dp6至>dp14 的系列寡糖中,含N-乙酰化總二糖含量明顯遞增。上述結(jié)果表明,隨著寡糖分子量的增加,N-乙?;窃黾拥目赡軅€(gè)數(shù)為1~3個(gè)。

    N-硫酸化二糖含量變動(dòng)趨勢(shì)與N-乙?;遣煌?。從dp6至>dp14 的寡糖中ΔHexA-GlcNS含量呈明顯遞增趨勢(shì),變動(dòng)范圍為1.9%→16.5%。ΔHexA-GlcNS(6S)呈遞減趨勢(shì)(20.8%→9.8%)。ΔHexA(2S)-GlcNS和ΔHexA(2S)-GlcNAc(6S)的含量變化不大,僅有3.0%和2.0%左右的波動(dòng)。從表2可見(jiàn),以>dp14為例,N-硫酸化二糖(NS-dp2)占總二糖含量為59.5%,2-O硫酸化二糖占43.5%,6-O硫酸化二糖(6S-dp2)占49.0%。寡糖系列中,隨著分子量的增大,NS-dp2百分含量(84.3%→59.5%),2S-dp2百分含量(84%→43.5%)和 6S-dp2百分含量(87.0%→49.0%)都呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。endprint

    3.2 dp6,dp8分離提純及序列分析

    利用SAX-HPLC進(jìn)一步分離dp6和dp8寡糖(見(jiàn)圖2), dp6主要含有4個(gè)寡糖為dp6a, dp6b, dp6c, dp6d和dp8主要有3個(gè)寡糖dp8a, dp8b和dp8c。各提純組分經(jīng)肝素酶Ⅰ, Ⅱ和Ⅲ完全酶解后,SAX-HPLC分析,外標(biāo)法鑒定其二糖組成及摩爾比(表2)。

    表3列出了按2.5.2節(jié)中分析dp6和dp8 細(xì)分寡糖的組分及摩爾比。dp6a含有兩種二糖結(jié)構(gòu)ΔHexA-GlcNS, ΔHexA2S-GlcNS6S,摩爾比接近2∶1?;诟嗡孛涪竦孜锾禺愋?,二糖GlcA2S-GlcNS6S在寡糖結(jié)構(gòu)的末端。因此,dp6a序列結(jié)構(gòu)為ΔHexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6S。按同理分析為了解質(zhì)譜在測(cè)試寡糖中的精確度,表4列出了雙電荷理論質(zhì)荷比、實(shí)測(cè)質(zhì)荷比及偏差。偏差范圍在

    34.1~37.4 ppm 之間。肝素寡糖質(zhì)譜相對(duì)較復(fù)雜,質(zhì)譜數(shù)據(jù)中還能觀測(cè)到一系列的同位素峰。

    References

    1 Robinson C J,Stringer S E. J. Cell Sci., 2001, 114: 853-865

    2 Couch man J R. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2003, 4: 926-937

    3 Kreuger J, Spillmann D, Li J P, Linda hl U. J. Cell Biol., 2006, 174: 323-327

    4 Wei W, Ninonuevo M R, Sharma A, Danan-Leon L M, Leary J A. Anal. Chem., 2011, 83(10): 3703-3708

    5 Yang B, Solakyildirim K, Chang Y, Linhardt R. J. Anal.Bioanal. Chem., 2011, 399(2): 541-557

    6 Wei Zheng, Lyon M, Gallagher J T. J. Biol. Chem., 2005, 280: 15742-15748

    7 Kailemia M J, Li L, Ly M, Linhardt RJ, Amster I J. Anal. Chem., 2012, 84(13): 5475-5478

    8 Huang R, Liu J, Sharp J S. Anal. Chem., 2013, 85 (12): 5787-5795

    9 Huang Y, Yu X, Mao Y, Costello C E, Zaia J, Lin C. Anal. Chem., 2013, 85(24): 11979-11986

    10 Shi X, Huang Y, Mao Y, Naimy H, Zaia J. J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2012, 23(9):1498-1511

    11 Kailemia M J, Li L, Xu Y, Liu J, Linhardt R J, Amster I J. Mol. Cell Proteomics., 2013, 12(4): 979-990

    12 Choudhary S, Marquez M, Alencastro F, Spors F, Zhao Y, Tiwari V. J. Biomed. Biotechnol., 2011, 2011: 264350

    13 Wei Z, Deakin J A, Blaum B S, Uhrin D, Gallagher J T, Lyon M. Glycoconj. J, 2011, 28(8-9): 525-535

    14 Catlow K R, Deakin J A, Wei Z, Delehedde M, Fernig D G, Gherardi E, Gallagher J T, Pavo M S G, Lyon M. J. Biol. Chem., 2008, 283: 5235-5238

    15 Borsig L.Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 2010, 93: 335-349

    16 Nicholas R L. J. Clin. Oncol., 2005, 23: 2119-2120

    17 Agnes Y Y L, Frederick R R. J. Clin. Oncol., 2005, 23: 2123-2135

    18 Zaia J, Costello C E. Anal. Chem., 2003, 75: 2445-2455

    19 Wol J J, Laremore T N, Busch A M , Linhardt R J, Amster I J. J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2008, 19: 790-798endprint

    日韩欧美精品免费久久| 亚洲精品国产av成人精品| 97热精品久久久久久| 韩国高清视频一区二区三区| 久久久久久伊人网av| 免费观看精品视频网站| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国精品久久久久久国模美| 国产黄片视频在线免费观看| 国产av国产精品国产| 激情 狠狠 欧美| 亚洲图色成人| 少妇熟女欧美另类| 人人妻人人澡欧美一区二区| freevideosex欧美| 哪个播放器可以免费观看大片| 高清午夜精品一区二区三区| 久久精品人妻少妇| 久久久久久久久久久免费av| 日韩一区二区视频免费看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产久久久一区二区三区| 丝袜喷水一区| 人人妻人人看人人澡| 卡戴珊不雅视频在线播放| 成人漫画全彩无遮挡| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 免费大片黄手机在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 久久久久性生活片| 中文字幕制服av| 99热这里只有是精品50| 99久久人妻综合| 国产亚洲精品久久久com| 日本黄色片子视频| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲国产最新在线播放| 美女内射精品一级片tv| 97热精品久久久久久| 亚洲内射少妇av| 久久综合国产亚洲精品| 久久99蜜桃精品久久| 美女大奶头视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 国产成人精品一,二区| 精品欧美国产一区二区三| 麻豆av噜噜一区二区三区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 精品一区二区三区视频在线| 免费看av在线观看网站| 国产av国产精品国产| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲人与动物交配视频| 晚上一个人看的免费电影| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品熟女久久久久浪| 午夜精品在线福利| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲图色成人| 特大巨黑吊av在线直播| 青春草视频在线免费观看| 熟女人妻精品中文字幕| 九九爱精品视频在线观看| 国产在线男女| 尾随美女入室| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| av在线亚洲专区| 国产毛片a区久久久久| 麻豆久久精品国产亚洲av| 干丝袜人妻中文字幕| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久人人爽人人片av| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品女同一区二区软件| av女优亚洲男人天堂| 亚洲av电影不卡..在线观看| 91精品国产九色| 99热这里只有是精品50| 天天一区二区日本电影三级| 九九在线视频观看精品| 国产精品无大码| 午夜福利高清视频| 日日撸夜夜添| 超碰97精品在线观看| 直男gayav资源| 国产黄色视频一区二区在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 直男gayav资源| 国产伦精品一区二区三区四那| 秋霞伦理黄片| 97超碰精品成人国产| 99久久精品一区二区三区| 久久久久久久久久成人| 免费看不卡的av| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久鲁丝午夜福利片| 精品人妻熟女av久视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日本wwww免费看| 亚洲成色77777| 欧美+日韩+精品| 免费观看在线日韩| 91久久精品电影网| www.色视频.com| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| .国产精品久久| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美高清成人免费视频www| 国产老妇女一区| 国内精品一区二区在线观看| 免费人成在线观看视频色| 久久久久久久久久久免费av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 精品久久久久久电影网| 国产黄a三级三级三级人| 卡戴珊不雅视频在线播放| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美性感艳星| 国产精品日韩av在线免费观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 丰满乱子伦码专区| 亚洲综合精品二区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久99热这里只频精品6学生| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产乱来视频区| 精品一区二区三区视频在线| 国产色爽女视频免费观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 一级黄片播放器| 国产在线一区二区三区精| 国产色爽女视频免费观看| 成年版毛片免费区| 寂寞人妻少妇视频99o| 天堂网av新在线| 国产老妇女一区| 国产一区二区在线观看日韩| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 色网站视频免费| 亚洲欧美日韩无卡精品| a级毛片免费高清观看在线播放| 日本爱情动作片www.在线观看| 简卡轻食公司| 天堂俺去俺来也www色官网 | 可以在线观看毛片的网站| 久久久久久久久久久免费av| 麻豆成人av视频| 1000部很黄的大片| 亚洲av国产av综合av卡| 人体艺术视频欧美日本| 日韩伦理黄色片| 床上黄色一级片| 26uuu在线亚洲综合色| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲最大成人av| 97在线视频观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 一级黄片播放器| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲最大成人中文| 中文欧美无线码| 夫妻午夜视频| 日韩大片免费观看网站| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久久精品欧美日韩精品| 久久久色成人| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产有黄有色有爽视频| 精品不卡国产一区二区三区| 免费大片黄手机在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| www.色视频.com| 国产成人91sexporn| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久草成人影院| 九九爱精品视频在线观看| 精品一区二区三卡| 免费在线观看成人毛片| av在线观看视频网站免费| 国产一区二区在线观看日韩| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美xxⅹ黑人| 久久久久久久久中文| 中文资源天堂在线| 色5月婷婷丁香| 边亲边吃奶的免费视频| 免费观看a级毛片全部| 中文字幕av成人在线电影| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产综合精华液| 午夜亚洲福利在线播放| 性色avwww在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 黄色欧美视频在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 色综合色国产| 人妻一区二区av| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 51国产日韩欧美| 可以在线观看毛片的网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 午夜福利高清视频| 日韩欧美三级三区| 久久久久九九精品影院| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 免费av观看视频| av网站免费在线观看视频 | 久久精品久久精品一区二区三区| 性插视频无遮挡在线免费观看| av黄色大香蕉| 欧美高清性xxxxhd video| 国产男女超爽视频在线观看| 国产 一区精品| 国产av在哪里看| 男人舔女人下体高潮全视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久99热6这里只有精品| 看免费成人av毛片| 久久精品人妻少妇| 街头女战士在线观看网站| 成人漫画全彩无遮挡| 久久久久网色| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲精品一二三| 久久久午夜欧美精品| 97超视频在线观看视频| 观看美女的网站| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 午夜激情福利司机影院| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产成人一区二区在线| 亚洲精品国产av蜜桃| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 免费看a级黄色片| 亚州av有码| 欧美成人a在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产成人精品一,二区| 免费av不卡在线播放| 美女黄网站色视频| 欧美性感艳星| 欧美高清性xxxxhd video| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲自拍偷在线| 久久久精品94久久精品| 天美传媒精品一区二区| 免费黄色在线免费观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久草成人影院| 国产成人精品福利久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美三级亚洲精品| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品三级大全| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 成年女人在线观看亚洲视频 | 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久精品人妻少妇| 26uuu在线亚洲综合色| 99久国产av精品国产电影| 亚洲人成网站高清观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 免费观看的影片在线观看| 99热这里只有精品一区| 99久国产av精品| 亚洲经典国产精华液单| 少妇人妻一区二区三区视频| 免费大片黄手机在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 日韩成人av中文字幕在线观看| av线在线观看网站| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 日韩强制内射视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲无线观看免费| 免费少妇av软件| 亚洲成人中文字幕在线播放| 99久久精品热视频| 一本一本综合久久| 如何舔出高潮| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲精品,欧美精品| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 两个人的视频大全免费| 精品熟女少妇av免费看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久精品综合一区二区三区| 久久久久精品性色| 免费在线观看成人毛片| 女人久久www免费人成看片| 久久这里只有精品中国| 国产黄片视频在线免费观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 美女大奶头视频| 精品久久久久久久久av| 三级国产精品片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产午夜精品论理片| 3wmmmm亚洲av在线观看| freevideosex欧美| 国产av国产精品国产| 青春草国产在线视频| 国产综合懂色| 中文字幕av成人在线电影| 黄色一级大片看看| 午夜激情久久久久久久| 免费大片18禁| 99热这里只有精品一区| 大陆偷拍与自拍| 亚洲精品视频女| 亚洲内射少妇av| 成人亚洲精品av一区二区| 国产成人精品一,二区| 在线观看av片永久免费下载| 91久久精品国产一区二区三区| 偷拍熟女少妇极品色| videos熟女内射| 久久99精品国语久久久| 精品午夜福利在线看| 国产精品一区www在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 国产成人精品久久久久久| 久久综合国产亚洲精品| 99热6这里只有精品| 精品不卡国产一区二区三区| 99久久精品热视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 99热6这里只有精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲精品色激情综合| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美成人精品欧美一级黄| 日本熟妇午夜| av国产免费在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 99热网站在线观看| 国产视频内射| 国产久久久一区二区三区| 黄色一级大片看看| 国产成人91sexporn| 成人av在线播放网站| 最近2019中文字幕mv第一页| 九草在线视频观看| 亚洲国产欧美在线一区| 久久久色成人| 免费大片黄手机在线观看| 成人特级av手机在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 成人一区二区视频在线观看| 国产 一区精品| 国产精品.久久久| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 秋霞在线观看毛片| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 日韩亚洲欧美综合| 97热精品久久久久久| 国产伦一二天堂av在线观看| 九九在线视频观看精品| 午夜亚洲福利在线播放| 国产综合懂色| 91av网一区二区| 亚洲欧美精品专区久久| av女优亚洲男人天堂| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久久久九九精品二区国产| 成人特级av手机在线观看| 又爽又黄a免费视频| 日韩精品青青久久久久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产免费又黄又爽又色| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲国产欧美人成| 日韩欧美国产在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 日韩一区二区视频免费看| 久久久久久伊人网av| 天美传媒精品一区二区| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美日韩在线观看h| 精品欧美国产一区二区三| 内射极品少妇av片p| 九色成人免费人妻av| 成人亚洲精品av一区二区| 久久精品人妻少妇| 亚洲四区av| 亚洲最大成人中文| 精品一区在线观看国产| av女优亚洲男人天堂| 国产午夜福利久久久久久| 久久久久久国产a免费观看| 成人av在线播放网站| 国产成人精品福利久久| 欧美一区二区亚洲| 国产精品伦人一区二区| 国产黄色免费在线视频| 国产综合精华液| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 在线观看免费高清a一片| 麻豆成人av视频| 久久久久久久午夜电影| 午夜免费激情av| 网址你懂的国产日韩在线| 一级a做视频免费观看| 99热这里只有是精品50| 国产免费又黄又爽又色| 国产精品一及| 亚洲国产成人一精品久久久| 日本-黄色视频高清免费观看| 欧美激情在线99| 国产一区有黄有色的免费视频 | 久久午夜福利片| 黄色欧美视频在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 女人被狂操c到高潮| 熟妇人妻不卡中文字幕| 成人毛片a级毛片在线播放| 午夜激情久久久久久久| 国产在线一区二区三区精| ponron亚洲| 大香蕉97超碰在线| 成人亚洲欧美一区二区av| 两个人视频免费观看高清| 欧美+日韩+精品| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲无线观看免费| 日韩精品有码人妻一区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲人成网站在线观看播放| 日韩伦理黄色片| 一区二区三区乱码不卡18| 免费无遮挡裸体视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 成人av在线播放网站| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 亚洲色图av天堂| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产色婷婷99| 国产成人免费观看mmmm| 午夜福利成人在线免费观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲精品日本国产第一区| 久久99热6这里只有精品| 国产精品国产三级专区第一集| 男人爽女人下面视频在线观看| 永久网站在线| 国产av在哪里看| 久久精品国产亚洲网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 嫩草影院精品99| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日韩三级伦理在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 网址你懂的国产日韩在线| 在线观看免费高清a一片| 免费大片黄手机在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲精品一二三| 国产精品爽爽va在线观看网站| 97精品久久久久久久久久精品| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲最大成人av| 免费人成在线观看视频色| 国产精品一及| 免费黄频网站在线观看国产| 中文欧美无线码| 2021少妇久久久久久久久久久| 免费少妇av软件| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 男人舔奶头视频| 最近的中文字幕免费完整| 日韩一本色道免费dvd| 最近的中文字幕免费完整| 国产欧美日韩精品一区二区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 成年女人在线观看亚洲视频 | 美女国产视频在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 只有这里有精品99| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品一二三区在线看| 日本免费在线观看一区| 久久国内精品自在自线图片| 国产成人精品一,二区| 少妇的逼好多水| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲18禁久久av| 久久久精品免费免费高清| 亚洲精品,欧美精品| 免费看日本二区| 看非洲黑人一级黄片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产黄色免费在线视频| 久久人人爽人人片av| 午夜福利在线在线| 国产单亲对白刺激| 三级经典国产精品| 能在线免费看毛片的网站| av.在线天堂| 能在线免费看毛片的网站| 欧美三级亚洲精品| 成人av在线播放网站| 欧美不卡视频在线免费观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久人人爽人人片av| 人体艺术视频欧美日本| 久久国内精品自在自线图片| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚州av有码| 日韩一区二区视频免费看| 嫩草影院精品99| 中文字幕制服av| 我的女老师完整版在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 日本色播在线视频| 内地一区二区视频在线| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 联通29元200g的流量卡| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 在线天堂最新版资源| 丰满少妇做爰视频| av.在线天堂| 亚洲精品乱久久久久久| av专区在线播放| 日韩强制内射视频| 成年av动漫网址| 日韩大片免费观看网站| 成年女人在线观看亚洲视频 | 97超视频在线观看视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 观看美女的网站| 老司机影院毛片| 男人爽女人下面视频在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲综合色惰| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品久久久久久精品电影| 日本一本二区三区精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产精品久久视频播放| 三级国产精品欧美在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲av国产av综合av卡| 99久国产av精品| av在线蜜桃| 美女高潮的动态| 久久久久精品久久久久真实原创| 九九爱精品视频在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| freevideosex欧美| 精品久久久久久成人av| 亚洲怡红院男人天堂| 免费人成在线观看视频色| 乱人视频在线观看| 亚洲av二区三区四区| 精品欧美国产一区二区三| 成人午夜精彩视频在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 男女国产视频网站| 成年版毛片免费区| 成年人午夜在线观看视频 | 男女啪啪激烈高潮av片| 国产免费视频播放在线视频 | 免费播放大片免费观看视频在线观看| 男女那种视频在线观看| 综合色av麻豆| 国产伦在线观看视频一区| or卡值多少钱| 波野结衣二区三区在线| 简卡轻食公司| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产久久久一区二区三区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 特级一级黄色大片| 好男人视频免费观看在线| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产在视频线精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 美女主播在线视频| 国产免费又黄又爽又色| 国产黄色小视频在线观看| 免费少妇av软件|