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    基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法分析人乳β—酪蛋白新生兒體外消化模型多肽組

    2015-07-09 05:10李相怡方曦任皓威程琳張拓付國(guó)紅劉寧
    分析化學(xué) 2015年5期
    關(guān)鍵詞:酪蛋白多肽蛋白酶

    李相怡 方曦 任皓威 程琳 張拓 付國(guó)紅 劉寧

    摘 要 通過(guò)體外模擬新生兒消化道條件,用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法(MALDI-TOF/TOF)探究人乳β-酪蛋白消化后的多肽組。在離子源加速電壓為20 kV,激光波長(zhǎng)337 nm,激光頻率200 Hz,離子延遲提取時(shí)間330 ns,質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加2000次條件下,掃描質(zhì)量范圍m/z 500~ 5000的肽段。結(jié)果表明,消化后得到26個(gè)肽段,分子量集中在1000~4000 Da。與已知功能的肽段序列進(jìn)行對(duì)比,人乳β-酪蛋白在新生兒體外模型消化后未產(chǎn)生與已知功能的活性肽序列匹配的肽段,但發(fā)現(xiàn)9個(gè)肽前體,其中含4個(gè)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (ACE)抑制肽前體,2個(gè)酪蛋白磷酸肽(CPP)前體,2個(gè)抗氧化肽前體,1個(gè)免疫活性肽前體,由酶切位點(diǎn)推測(cè)分析,肽前體可以繼續(xù)在蛋白酶作用下轉(zhuǎn)化為生物活性肽。

    關(guān)鍵詞 β-酪蛋白; 新生兒; 體外消化; 多肽組; 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜

    1 引 言

    多肽組(Peptidome)是指器官、組織、細(xì)胞和體液中全部?jī)?nèi)源性多肽組分,包括生物體內(nèi)具有特殊功能的活性多肽和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的多肽【1~3】,多肽組學(xué)(peptidomics)研究的是多肽組的成分、功能、變化規(guī)律及其相關(guān)關(guān)系【2】,已應(yīng)用于人體體液多肽組分析【4,5】。人乳以富含多種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)以及活性肽等優(yōu)點(diǎn)被公認(rèn)是新生兒最好的食品,其中β-酪蛋白的含量為30%~35%【6~8】,是人乳中比重最大的酪蛋白【9,10】。本課題組在人乳β-酪蛋白(尤其是中國(guó)人乳β-酪蛋白)的鑒定和結(jié)構(gòu)功能方面已開(kāi)展了前期研究【11~13】。目前, 關(guān)于人乳β-酪蛋白的研究集中于對(duì)其消化產(chǎn)物的分離、鑒定和生物學(xué)功能方面【14~17】,還沒(méi)有針對(duì)人乳β-酪蛋白消化后多肽組學(xué)的報(bào)道,而研究人乳β-酪蛋白消化后的多肽組可以為日后研發(fā)更適合嬰幼兒的配方食品提供參考。嬰兒(≤12月齡)尤其是新生兒(≤28日齡)的消化系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟,代謝旺盛,但蛋白酶活性很低,胃蛋白酶活性和分泌量與嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育的時(shí)間成正相關(guān),而胰蛋白酶的活性以及分泌量在3~24月齡時(shí)也低于成年人【18,19】。本研究在普遍使用的嬰兒體外消化方法【20】基礎(chǔ)上,根據(jù)新生兒蛋白酶活性低的特點(diǎn),建立了更適合研究新生兒體外消化的模型。以此模型消化人乳β-酪蛋白,用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法分析其消化產(chǎn)物多肽組。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    GL-21M高速冷凍離心機(jī)(上海離心機(jī)械研究所); Delta320型pH計(jì)和AL204精密電子天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司); 真空冷凍干燥機(jī)(上海醫(yī)用儀器廠); DYY-10C型電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器); 凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-RAD公司); 蛋白質(zhì)純化儀AKTA purifer 100(美國(guó)GE公司); AB4700 MALDI TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

    DEAE-Sepharose Fast Flow葡聚糖凝膠(美國(guó)GE公司); ziptip C18層析柱(美國(guó)GE公司); 人乳采自中國(guó)漢族人乳; 胃蛋白酶、胰蛋白酶、尿素 (美國(guó)Sigma公司); 預(yù)染蛋白Marker(美國(guó)Thermo scientific公司); 30 %聚丙烯酰胺(北京Solarbio公司); 兔抗人β-酪蛋白抗體(美國(guó)Abcam公司); 增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒(Tiangen公司)。其它試劑均為分析純; 實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

    2.2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.2.1 人乳β-酪蛋白的純化與鑒定 參照文獻(xiàn)\低以及酶添加量很少。但含9個(gè)肽前體(肽前體是在特定

    環(huán)境下,經(jīng)蛋白酶消化可以轉(zhuǎn)化為生物活性肽的多肽),其中酪蛋白磷酸肽前體2個(gè),抗氧化肽前體2個(gè),ACE抑制肽前體4個(gè),免疫活性肽前體1個(gè),各種多肽的功能分布見(jiàn)圖4B。在圖4C中,根據(jù)存在的酶切位點(diǎn)推測(cè)肽前體可以在胃蛋白酶或者羧肽酶B等作用下轉(zhuǎn)化成活性肽(除黑色外,其它顏色的部分為活性肽序列),如第一個(gè)CPP前體可被蛋白酶K消化成CPP。

    4 結(jié) 論

    新生兒體外消化模型消化人乳β-酪蛋白,獲得人乳β-酪蛋白多肽組數(shù)據(jù),模擬胃消化得到9個(gè)肽段,模擬小腸消化得到6個(gè)肽段,模擬胃腸連續(xù)消化得到11個(gè)肽段。實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)與已知功能活性肽序列匹配的肽段; 但發(fā)現(xiàn)有9個(gè)肽前體,其中CCP肽前體2個(gè),抗氧化肽前體2個(gè),ACE抑制肽前體4個(gè),免疫活性肽前體1個(gè),由酶切位點(diǎn)推測(cè)分析肽前體可以繼續(xù)在蛋白酶作用下轉(zhuǎn)化為生物活性肽。這些多肽可能具有促進(jìn)新生兒腸道菌群的建立及腸黏膜的發(fā)育等功能,具體的功能有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究。

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