基于吐溫—姜黃素復(fù)合物的熒光探針檢測脂肪酶活性

湯燕+張衛(wèi)+左煥楨+劉佳+江凌+田丹碧

摘 要 本實驗以姜黃素作為信號探針，吐溫作為脂肪酶的底物和包裹姜黃素的載體，建立了一種檢測脂肪酶活性的熒光法。實驗發(fā)現(xiàn)，采用0.3 mmol/L 吐溫40， 25 μmol/L 姜黃素，并且脂肪酶水解吐溫40的時間為35 min時，姜黃素的熒光強(qiáng)度變化值與脂肪酶濃度在0.002～0.05 mg/mL和0.05～0.25 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性關(guān)系，檢出限為0.6 mg/L （S/N=3）。此探針在高通量檢測脂肪酶活性以及與脂肪酶相關(guān)疾病檢測領(lǐng)域中有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 姜黃素； 吐溫40； 脂肪酶； 熒光探針

1 引 言

許多疾病都與生物體內(nèi)特定酶的活性密切相關(guān)，因此在生理條件下準(zhǔn)確檢測酶活性十分關(guān)鍵【1】，其中，脂肪酶（Lipase E.C. 3.1.1.3）是作用于羧酸酯鍵的一類水解酶，與急性胰腺炎、肥胖癥、動脈粥樣化等疾病密切相關(guān)【2】。脂肪酶的催化機(jī)理與其它的水解酶并不相同，其催化水解反應(yīng)發(fā)生在油-水界面上【3～5】，并且，它的底物為水不溶性酯類化合物，在測定酶活性過程中，通常需要乳化，乳化劑的加入會顯著影響酶活性檢測的真實性【6，7】，所以建立一種可靠、簡單、靈敏的檢測脂肪酶活性的方法尤為重要。

姜黃素是一種天然疏水性抗癌藥物，其自身具有紫外和熒光性質(zhì)【8，9】，可作為熒光信號探針；同時，吐溫是一種兩親性的、生物相容性良好的非離子表面活性劑【10，11】，它既作為脂肪酶的底物，又作為包封姜黃素的載體。因此，本研究利用姜黃素作為信號探針，吐溫作為脂肪酶的底物和姜黃素的載體，構(gòu)建了吐溫-姜黃素復(fù)合物這一傳感平臺，用于脂肪酶活性的檢測。與傳統(tǒng)的滴定法、平板法和濁度法等相比，本方法無需乳化底物、操作簡單、成本低廉，靈敏度得到明顯提高。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

SpectraMax M3微孔板檢測系統(tǒng)（美國分子儀器公司），HH-S1恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠），電子天平 （德國賽多利斯公司）。吐溫20、40、60、80，姜黃素 （Curcumin），無水甲醇等均為分析純 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。豬胰腺脂肪酶 （PPL）和人血清購于北京索萊寶科技有限公司。除姜黃素是用無水甲醇配制以外，其余所有樣品均在10 mmol/L磷酸鈉緩沖液（PBS， pH 7.4）中制備得到。

2.2 脂肪酶的熒光檢測

分別移取1 mL 0.3 mmol/L 吐溫40和10 μL 2.5 mmol/L姜黃素溶液于2 mL離心管中，混勻，加入10 μL不同濃度的PPL在 37 ℃下反應(yīng)35 min后，在微孔板檢測系統(tǒng)上測量體系加入PPL前后的熒光強(qiáng)度（圖1）。最終，以F0 -F （ΔF505）為縱坐標(biāo)，PPL濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，F(xiàn)0和F分別表示加入PPL前后的熒光強(qiáng)度。

2.3 實際樣品測定

將人血清在10000 r/min下離心10 min，向所獲得的上層清液中分別加入不同濃度的PPL溶液，配制成最終濃度分別為0.025， 0.5和1.0 mg/mL PPL的人血清樣品，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 吐溫-姜黃素復(fù)合物熒光檢測脂肪酶活性

圖1為吐溫40-姜黃素復(fù)合物的熒光探針檢測脂肪酶活性的原理圖。當(dāng)沒有脂肪酶存在時，吐溫40-姜黃素復(fù)合物仍然保持著膠束結(jié)構(gòu)，姜黃素?zé)o法釋放到緩沖溶液中發(fā)生降解，依然具有很高的熒光強(qiáng)度；當(dāng)脂肪酶存在時，它水解切割吐溫40中的羧酸酯鍵，

破壞了吐溫40-姜黃素復(fù)合物的膠束結(jié)構(gòu)，使得姜黃素從中釋放出來，在緩沖溶液中發(fā)生降解，熒光強(qiáng)度大大降低。為了驗證這一傳感機(jī)理，如圖2所示。姜黃素存在于10 mmol/L PBS （pH 7.4）時，發(fā)生降解，幾乎沒有熒光強(qiáng)度，溶液顏色為無色 （圖2a，a離心管）；當(dāng)吐溫40存在時，其姜黃素被包裹在內(nèi)，無法發(fā)生降解，具有很高的熒光強(qiáng)度，溶液顏色為黃色 （圖2b，b離心管），說明吐溫40保護(hù)姜黃素避免它與緩沖溶液相互作用而發(fā)生降解，從而擁有很高的熒光強(qiáng)度；當(dāng)加入PPL時，會使吐溫40發(fā)生水解，破壞了吐溫40-姜黃素復(fù)合物的膠束結(jié)構(gòu)，釋放出姜黃素，其熒光強(qiáng)度大大減弱，溶液顏色為淡黃色 （圖2d，d離心管），表明PPL具有破壞吐溫40的作用，進(jìn)而使得姜黃素游離出來并與緩沖溶液相互作用發(fā)生降解，熒光強(qiáng)度減弱；同時，為了說明是PPL水解吐溫40，使姜黃素釋放到緩沖溶液中發(fā)生降解，對照實驗采用失活的PPL（100 ℃煮沸一段時間）加入到吐溫40-姜黃素復(fù)合物溶液中，其熒光強(qiáng)度與未加酶時幾乎一致，且溶液顏色也是一致的 （圖2c，c離心管）。以上實驗結(jié)果表明，脂肪酶、姜黃素和吐溫40三者之間的相互作用關(guān)系， 即在PPL的作用下，吐溫40-姜黃素復(fù)合物的結(jié)構(gòu)遭到破壞，姜黃素釋放出來與緩沖液相互作用發(fā)生降解，熒光強(qiáng)度減弱。因此，本方法可成功檢測脂肪酶活性。

為了進(jìn)一步探究該傳感機(jī)理，采用紫外譜圖進(jìn)行研究。在中性水溶液中，姜黃素在430和355 nm處有兩個特征吸收峰，其中355 nm處出現(xiàn)的峰是由于水分子與姜黃素之間相互作用所導(dǎo)致的【8，12】。當(dāng)姜黃素加入到pH 7.4的PBS緩沖溶液中時，反應(yīng)1 min，發(fā)現(xiàn)在425 nm處出現(xiàn)一個低強(qiáng)度的吸收峰，并且在355 nm處有個不明顯的峰（圖3b）；35 min后，425 nm處的峰完全消失，355 nm處有一個明顯的吸收峰（圖3a）， 圖3 （a）磷酸鈉緩沖溶液與姜黃素反應(yīng)35 min；（b）磷酸鈉緩沖溶液和姜黃素反應(yīng)1 min；（c）吐溫40、姜黃素和PPL反應(yīng)35 min；（c）吐溫40與姜黃素反應(yīng)35 min的紫外譜圖

Fig.3 UV-vis spectra of curcumin after reacted with （a） PBS for 35 min， （b） PBS for 1 min， （c） mixture of Tween 40 and PPL for 35 min and （d） Tween 40 for 35 minendprint

說明隨著反應(yīng)時間的不斷延長，355 nm處的峰越來越明顯，其姜黃素與緩沖溶液相互作用越強(qiáng)。當(dāng)吐溫40存在時，355 nm處的峰完全消失，在425 nm處出現(xiàn)一個高強(qiáng)度的吸收峰 （圖3d）；加入PPL后，同樣355 nm處的峰完全消失，但是在425 nm處的吸收峰的強(qiáng)度要低于沒有加酶的（圖3c），表明了吐溫40的存在能夠顯著降低姜黃素與緩沖溶液的相互作用，加入PPL后，會增強(qiáng)姜黃素與緩沖溶液的相互作用，導(dǎo)致姜黃素不斷降解。這些現(xiàn)象再次驗證此傳感策略能很好地用于檢測脂肪酶活性。

3.2 實驗條件的優(yōu)化

采用熒光光譜考察了吐溫類型與濃度、姜黃素濃度以及PPL水解吐溫時間對此傳感策略性能的影響。吐溫有多種類型，如吐溫20， 40， 60和80等，都可以作為PPL的底物和包裹姜黃素的載體【10，12～15】，但是PPL對其水解程度不一樣，并且它們包裹姜黃素的能力也不一樣，因此選擇合適的吐溫十分關(guān)鍵，結(jié)果如圖4A所示，當(dāng)選用吐溫40作為PPL底物和包裹姜黃素載體時，熒光信號差值最大。

吐溫40濃度的選擇對于該傳感器的構(gòu)建尤為重要，低濃度不利于形成膠束，以包裹姜黃素，高濃度不利于PPL對其水解催化（圖4B）。在吐溫40濃度為0.05～0.30 mmol/L時，熒光信號差值不斷增大，當(dāng)濃度超過0.30 mmol/L時，熒光信號差值下降，因此選擇0.30 mmol/L 吐溫40作為最佳實驗條件。

姜黃素作為該策略的信號傳感元件，信號的強(qiáng)弱與其濃度大小相關(guān)。如圖4C所示，隨著姜黃素濃度的增加，熒光信號差值也相應(yīng)增大，至濃度達(dá)到25 μmol/L時，熒光信號差值趨向穩(wěn)定。因此，姜黃素的濃度選為25 μmol/L。

在PPL催化水解吐溫40的過程中，反應(yīng)時間是評價傳感策略的重要因素，結(jié)果如圖4D所示。在0～35 min反應(yīng)時間內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的延長，熒光信號差值不斷增加，35 min后，熒光信號差值趨于穩(wěn)定，表明PPL催化水解吐溫40達(dá)到平衡狀態(tài)，因此選擇PPL催化水解吐溫40的時間為35 min。

3.3 酶活動力學(xué)的測定

在最佳的實驗條件下，測定了不同濃度的PPL的酶活動力學(xué)曲線。如圖5所示，在相同反應(yīng)時間內(nèi)，隨著PPL濃度的增加，熒光信號差值也越來越大。另外，隨著水解反應(yīng)時間的不斷進(jìn)行，相同濃度下的PPL，其熒光信號差值也越來越大。這些結(jié)果表明，當(dāng)PPL的濃度越大或者隨著水解時間的增加，其破壞吐溫40-姜黃素復(fù)合物的能力就越強(qiáng)，釋放出來的姜黃素在緩沖溶液中降解的程度就越大，最終熒光強(qiáng)度的變化值也越大。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在最優(yōu)化條件下，對不同濃度的PPL進(jìn)行了定量檢測。如圖6A所示，隨著PPL濃度的不斷增加，反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度逐漸降低。以熒光強(qiáng)度的變化值為縱坐標(biāo)，PPL的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖6 B所示，PPL濃度在0.002～0.05 mg/mL和0.05～0.25 mg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程分別為ΔF505=7.900+5647CPPL（R2=0.9966），ΔF505=188.8+2217CPPL（R2=0.9892），檢出限低至0.6 mg/L（S/N=3）。本方法與傳統(tǒng)檢測脂肪酶活性相比，靈敏度大大提高，并且在高通量檢測脂肪酶活性以及與脂肪酶相關(guān)疾病檢測領(lǐng)域中有很大的應(yīng)用前景。

3.5 人血清中PPL的標(biāo)準(zhǔn)加入回收率

按照所建立的熒光檢測方法，通過標(biāo)準(zhǔn)加入法對人血清中的PPL進(jìn)行回收率計算。檢測結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，此傳感方法可以適用于實際樣品的檢測。

References

1 Hutter E， Maysinger D. Trends Pharmacol. Sci.， 2013， 34（9）： 497-507

2 Gupta R， Gupta N， Rathi P. Appl. Microbiol. Biotechno.， 2004， 64（6）： 763-781

3 Gupta R， Rathi P， Gupta N， Bradoo S. Biotechnol. Appl. Biochem.， 2003， 37（1）： 63-71

4 Gomes N， Goncalves C， Garcia-Roman M， Teixeira J A， Belo I. Anal. Methods， 2011， 3（4）： 1008-1013

5 Hasan F， Shah A A， Hameed A. Biotechnol. Adv.， 2009， 27（6）： 782-798

6 Beisson F， Tiss A， Rivière C， Verger R. Eur. J. Lipid Sci. Technol.， 2000， 102（2）： 133-153

7 Gilham D， Lehner R. Methods， 2005， 36（2）： 139-147

8 Sahu A， Bora U， Kasoju N， Goswami P. Acta Biomater.， 2008， 4（6）： 1752-1761

9 Ke D， Wang X， Yang Q， Niu Y， Chai S， Chen Z， An X， Shen W. Langmuir， 2011， 27（23）： 14112-14117

10 Kerwin B A. J. Pharmacol. Sci.， 2008， 97（8）： 2924-2935

11 Plou F， Ferrer M， Nuero O， Calvo M， Alcalde M， Reyes F， Ballesteros A. Biotechnol. Tech.， 1998， 12（3）： 183-186

12 Mandal S， Banerjee C， Ghosh S， Kuchlyan J， Sarkar N. J. Phys.Chem. B.， 2013， 117（23）： 6957-6968

13 Sakai Y， Hayatsu M， Hayano K. Soil Sci. Plant Nutr.， 2002， 48（5）： 729-734

14 Carson L A， Favero M S， Bond W W， Petersen N J. Appl.Microbiol.， 1973， 25（3）： 476-483

15 Baradi A F， Bourne G H. Nature， 1951， 168（4284）： 977-979endprint