酶標(biāo)儀快速測定大鼠、小鼠精子密度的方法研究

江偉雯， 許藝飛，陳婭琦，蔡泳鋒，吳清和，黃萍， 操紅纓

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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酶標(biāo)儀快速測定大鼠、小鼠精子密度的方法研究

江偉雯， 許藝飛，陳婭琦，蔡泳鋒，吳清和，黃萍， 操紅纓Δ

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的 利用酶標(biāo)儀建立一種快速、準(zhǔn)確的測定大、小鼠精子密度的方法。方法 ①最適波長確立與回歸方程建立：雄性KM小鼠和SD大鼠各6只，脫頸椎處死后分離左側(cè)附睪，于PBS內(nèi)充分剪碎，水浴充分游離精子，用酶標(biāo)儀分別在300、380、450、530、600 nm下測定吸光度，擬合吸光度曲線，取相關(guān)系數(shù)最接近于1及標(biāo)準(zhǔn)差最小的為最佳波長；取KM小鼠、SD大鼠各10只，乙醚過量麻醉致死后用PBS稀釋得到4、8、16、36倍的精子懸液，用酶標(biāo)儀檢測吸光度并使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，以精子密度為橫坐標(biāo)及吸光度為縱坐標(biāo)建立回歸方程。 ② 精子吸光度穩(wěn)定性檢測：KM小鼠和SD大鼠各6只，乙醚過量麻醉致死后制備左側(cè)附睪懸液，樣品置于室溫(25 ℃)或繼續(xù)37 ℃水浴，并于水浴后的0、20、30、40、50、60 min，取樣品測定吸光度，記錄樣品的吸光度變化。③ 回歸方程驗(yàn)證：使用20%乙醇灌胃30 d造KM小鼠少精癥模型，采用吸光度-精子密度曲線方程及細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)2種方法測定造模KM小鼠精子密度，驗(yàn)證新方法。結(jié)果 確立KM小鼠、SD大鼠吸光度-精子密度曲線在380 nm處可以建立最適回歸方程，KM小鼠精子密度x1與吸光度y1的關(guān)系為線性函數(shù)，線性回歸方程為y1=2×10-9x1+0.0648，R2=0.9743；SD大鼠精子密度x2與吸光度y2的關(guān)系為線性函數(shù)，線性回歸方程為y2=5×10-9x2+0.0621，R2=0.9940；SD大鼠精子懸液在水浴60 min后，A值與0 min時相比顯著減低(P<0.05)，但在常溫下40 min后顯著升高(P<0.05)；KM小鼠精子懸液在水浴和常溫條件下50 min后，與0 min時相比，A值顯著升高(P<0.05)；與正常對照組相比，用酶標(biāo)儀檢測和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的乙醇少精組的精子密度均顯著下降(P<0.05)；與標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相比，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板方法檢測乙醇少精組的精子密度沒有顯著變化。吸光度-精子密度曲線方程法可有效檢測出少精癥動物模型精子密度的減少。結(jié)論 利用酶標(biāo)儀建立吸光度-精子密度曲線方程法可以快速、準(zhǔn)確的測定KM小鼠和SD大鼠的精子密度。

精子密度；吸光度；SD大鼠；KM小鼠；少精模型

在大鼠、小鼠實(shí)驗(yàn)指標(biāo)和養(yǎng)殖過程中，測定其精子密度極為普遍。目前常用的測定方法有血球計(jì)數(shù)法[1]、流式細(xì)胞儀法[2]和分光光度法[3]。其中血球計(jì)數(shù)法在處理大量樣品時顯得繁瑣和低效，流式細(xì)胞儀法處理繁瑣，費(fèi)用高；而分光光度法具有操作簡單，費(fèi)用便宜等優(yōu)點(diǎn)；酶標(biāo)儀所運(yùn)用的技術(shù)就是分光光度法，能更加方便快速得到吸光度，適用于不同物質(zhì)的分光光度法的測定。精子懸液在紫外光下呈現(xiàn)一定的吸光度，利用建立的精子密度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠快速、精確地測定精子密度[4-8]。大鼠、小鼠的精子數(shù)量在生殖系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)上作為一個評判標(biāo)準(zhǔn)，其快速檢測技術(shù)尤為重要，因此本實(shí)驗(yàn)擬運(yùn)用酶標(biāo)儀測定大鼠、小鼠精子懸液的吸光度(absorbance，A)建立A值-精子密度標(biāo)準(zhǔn)曲線以快速測定精子密度，構(gòu)建2個變量的方程關(guān)系，并通過建立小鼠乙醇少精模型驗(yàn)證運(yùn)用吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出精子密度方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：KM小鼠，38只，SPF級，雄性，體質(zhì)量30～35 g；SD大鼠，22只，SPF級，雄性，體質(zhì)量300～350 g，均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，大鼠許可證為44005900001714，小鼠許可證為44007200015976。實(shí)驗(yàn)動物嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)條例》。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：Multiskan Go 1510全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo scientific公司)；Eclipse TE2000-s倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；96孔板(上海百研生物技術(shù)有限公司)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司，編號：02270113)。

PBS溶液(武漢博士德生物技術(shù)有限公司，)；無水乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號20130928，分析純，純度>99.7%)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 最適波長確定：各取6只雄性SD大鼠、KM小鼠，脫頸椎處死后仰臥放置，輕輕擠壓腹部使得睪丸向下移動，剪開睪丸處皮膚層，拉出左側(cè)睪丸，緊貼睪丸處找到附睪頭，順勢找出整個附睪，分離附睪與睪丸。將雄性大鼠、小鼠左側(cè)的完整附睪放進(jìn)裝有1 mL，37 ℃預(yù)溫PBS的EP管中，用剪刀充分剪碎附睪，置于37 ℃恒溫水浴箱里25 min制成精子懸液。用移液槍吸取EP管中部精子混懸液150 μL，用PBS梯度稀釋成4、8、16、36倍，制備成精子懸液，另外準(zhǔn)備空白PBS作為空白對照。96孔板中每孔加入100 μL以上倍數(shù)的精子懸液，每個倍數(shù)重復(fù)4個孔，用全波長酶標(biāo)儀分別在300、380、450、530、600 nm(波長下測定吸光度，擬合吸光度曲線，取相關(guān)系數(shù)最接近于1及標(biāo)準(zhǔn)差最小的為最佳波長。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：各取10只雄性SD大鼠、KM小鼠，同1.2.1方法制備4、8、16、36倍精子懸液，另外準(zhǔn)備空白PBS作為空白對照。96孔板中每孔加入100 μL不同倍數(shù)精子懸液，用全波長酶標(biāo)儀在經(jīng)過1.2.1項(xiàng)下所得到的最適波長下測定吸光度，并利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在倒置顯微鏡下，計(jì)數(shù)上述溶液中的精子密度(精子密度計(jì)算按精子數(shù)/mL=四大方格中精子總數(shù)×2×104)，以精子密度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣品穩(wěn)定性：各取6只大鼠、小鼠按上述步驟制備成精子懸液，在37 ℃水浴和室溫(25 ℃)條件下繼續(xù)放置0、20、30、40、50、60 min，在最適波長條件下測定其吸光度。對吸光度進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，探討精子混懸液在室溫(25 ℃)或37 ℃水浴條件下，1h內(nèi)的樣品吸光度的穩(wěn)定性。

1.2.4 乙醇少精模型：隨機(jī)將16只KM小鼠分為正常對照組和模型組，每組8只。模型組動物每天按10 mL/kg灌胃20%乙醇溶液[9]，正常對照組動物灌胃等體積蒸餾水，造模30d。按上述步驟制備成精子懸液，96孔板中每孔加入100 μL待測液體，用全波長酶標(biāo)儀分別在最適波長下測定吸光度，利用1.2.2所求的KM小鼠標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其精子密度；利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在倒置顯微鏡下，計(jì)數(shù)上述溶液中的精子密度。對比2者有無差別，以驗(yàn)證新方法的可行。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠、KM小鼠精子不同波長下吸光度擬合曲線相關(guān)系數(shù) SD大鼠、KM小鼠精子不同波長下吸光度擬合曲線相關(guān)系數(shù)見表1。大、小鼠精子吸光度擬合曲線R2均在380 mm處最接近1，且標(biāo)準(zhǔn)差為最小。因此，380 mm為最佳檢測精子吸光度波長。

表1 SD大鼠精子懸液在不同波長下吸光度擬合曲線的相關(guān)系數(shù)±s,n=6)Tab.1 The R2 of SD rat and KM mice sperm suspension absorbance fitting curve under different wavelength ±s，n=6)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 對精子密度與吸光度關(guān)系的回歸分析發(fā)現(xiàn)，精子密度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。SD大鼠精子密度x1與吸光度y1的關(guān)系為線性函數(shù)，線性回歸方程為y1=5×10-9x1+0.0621(R2=0.9940)，見圖1-A；KM小鼠精子密度x2與吸光度y2的關(guān)系為線性函數(shù)，線性回歸方程為y2=2×10-9x2+0.0648(R2=0.9743)，見圖1-B。

圖1 精子密度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A：大鼠的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B：小鼠的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard calibration curves of sperm concentration (cells/mL) and absorbanceA:The standard calibration curves of rats;B:The standard calibration curves of mice

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) SD大鼠精子懸液在水浴60 min后，A值與0 min時相比顯著減低(P<0.05)，但在常溫下40 min后顯著升高(P<0.05)；KM小鼠精子懸液在水浴和常溫條件下50 min后，與0 min相比，A值顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 SD大鼠、KM小鼠精子懸液穩(wěn)定性Tab.

*P<0.05，與0 min相比，compared with 0 min

2.4 乙醇少精模型 與正常對照組相比，用酶標(biāo)儀檢測和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的乙醇少精組的精子密度均顯著下降(P<0.05)；與標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相比，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板方法檢測乙醇少精組的精子密度沒有顯著變化。見表3。

表3 2種方法檢測KM小鼠精子密度±s)Tab.3 The density of KM mice sperm detected by the two ±s)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

3 討論

大鼠、小鼠精液分析是一項(xiàng)重要的用于評價生殖性實(shí)驗(yàn)的檢查指標(biāo)，如壯陽實(shí)驗(yàn)[10]，生殖系統(tǒng)評價實(shí)驗(yàn)[11]等，測定精子密度最常見的方法有目測法、血球計(jì)數(shù)法和庫爾特顆粒計(jì)數(shù)法[12]。目測法雖然簡單，但十分不精確；計(jì)數(shù)法雖然精確，但費(fèi)時、費(fèi)力，在處理大量樣品時很難做到快速及時，也會造成一些人為誤差，來自精子計(jì)數(shù)操作過程中的技術(shù)誤差,如計(jì)數(shù)池的差異、樣本混勻、加樣、技術(shù)人員的熟練程度等。而現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道利用吸光度原理測定精子密度，具有操作方法簡便、快速及結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，在很多領(lǐng)域上都有應(yīng)用，尤其是在家畜精子密度研究中應(yīng)用較多[13-15]，有關(guān)測定實(shí)驗(yàn)動物精子密度的研究較少。本實(shí)驗(yàn)首次建立通過酶標(biāo)儀檢測實(shí)驗(yàn)動物SD大鼠，KM小鼠精子懸液的吸光度來確定快速檢測精子密度的方法。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]，不同種類的酶標(biāo)儀、物種及稀釋度對結(jié)果均會造成一定的影響。因此本實(shí)驗(yàn)建議在使用吸光度曲線測定精子密度時，最好使用同一酶標(biāo)儀、同一塊板在同一稀釋度條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以減少實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的誤差。此外，不同種屬的動物可能有不同的吸光度差異，本文僅采用了SD大鼠及KM小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不能代表所有種屬的大鼠、小鼠。

研究發(fā)現(xiàn)[4-6]，測定動物精子密度所用到的波長在300 nm到780 nm之間，故本實(shí)驗(yàn)選用300、380、450、530、600 nm波長下檢測大小鼠精子懸液的吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中SD大鼠、KM小鼠精子吸光度曲線在300 nm～450 nm均可以建立相關(guān)系數(shù)較高的標(biāo)準(zhǔn)曲線，但在380 nm處，曲線相關(guān)系數(shù)變化的標(biāo)準(zhǔn)差最小，穩(wěn)定性最高，因此本實(shí)驗(yàn)最佳檢測精子吸光度波長為380 nm。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證明，在常溫條件(25 ℃)下，大鼠精子懸液在40 min，小鼠在30 min就會與初始值有顯著性差異。但從圖2曲線變化條件上看，無論大小鼠在常溫條件下超過20 min，曲線即出現(xiàn)混亂。主要原因是精子在非適宜生存條件下，會出現(xiàn)大量的死亡沉底，從而導(dǎo)致吸光度的異常變化。水浴條件下(37 ℃)，精子吸光度能在較長一段時間保持穩(wěn)定。文獻(xiàn)報(bào)道，精子游離處理有使用20 min及30 min 2種時間[17-18]，本實(shí)驗(yàn)也證明2個時間均穩(wěn)定且差異不大。

通過模擬酗酒造成的精子密度減少癥狀[19]。在KM 小鼠乙醇少精模型實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)成功使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法驗(yàn)證了這一模型KM小鼠的精子密度的降低，精子計(jì)數(shù)法及標(biāo)準(zhǔn)曲線法均得到了相似的結(jié)果。大鼠酒精少精癥模型[17]，本研究亦有開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，但2種方法均未顯示造模大鼠精子密度與正常大鼠精子密度有差異(數(shù)據(jù)未展示)。

建立精子密度-吸光度曲線的方法與計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法各有優(yōu)缺點(diǎn)，吸光度曲線法可以更加快速準(zhǔn)確地得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但在吸光度測量過程中需保持精子活力，同時，該方法也要求實(shí)驗(yàn)人員必須要有熟練的操作技能，分離附睪是否完整，脂肪剝離是否干凈，吸取精子懸液是否均勻無雜質(zhì)等均對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大的影響。計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法[20]人工誤差大，操作繁瑣，但不需要對精子活力有要求，即使精子死亡亦可得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

因此，通過本研究建立的酶標(biāo)儀檢測法可以快速準(zhǔn)確地測定大鼠、小鼠的精子密度，可以加快大小鼠精子計(jì)數(shù)的速度，有利于研究大鼠、小鼠生殖能力及提高生殖能力相關(guān)實(shí)驗(yàn)速率。

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(編校：王冬梅)

Rapidly detecting the sperm concentration in mice and rats based on enzyme-labeled instrument

JIANG Wei-wen, XU Yi-fei, CHEN Ya-qi, CAI Yong-fei, WU Qing-he, HUANG Ping, CAO Hong-yingΔ

(School of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

ObjectiveTo establish a rapid and accurate method,and to determine the density of mice and rats sperm with enzyme-labeled instrument.Methods①The optimal wavelengths and the regression equation set up: After six Kunming mice and six Sprague-Dawley rats were sacrificed, the left epididymis was separated and fully cut up in phosphate buffer saline.With water bath,the sperm were fully dissociated.Using the enzyme-labeled instrument to detect the wavelength absorbance respectively under different wavelength and fitting absorbance curve.The best wavelength will be the most close to 1 of the correlation coefficient (R2) and the standard deviation of minimum.After ten Kunming mice and ten Sprague-Dawley rats were sacrificed,the sperm suspension of different concentration gradient were got.The regression equation of the sperm density and absorbance was established by using enzyme-labeled instrument and haemocytometer.②The test of sperm absorbance stability: Mice and rats,six respectively,were used to make the sperm suspension.Samples were put in room temperature (25 ℃) or 37 ℃ water bath continued,and after water bath about 0,20,30,40,50,60 min,the change of absorbance was recorded.③The regression equation verification: The mice were administrated orally with 20% ethanol solution for 30 days to make oligospermia.In order to verify the new method,two different method were used to get the sample sperm.ResultsThe optimal absorbancy-sperm density curve could be established at 380 nm.The means of KM mice sperm count (x1) and absorbance (y1) are showed to be the linear function,and the linear regression equation isy1=2×10-9x1+0.0648,R2=0.9743.The means of SD rat sperm count (x2) and absorbance (y2) are showed to be the linear function,and the linear regression equation isy2=5×10-9x2+0.0621,R2=0.9940.SD rat sperm suspension liquid after 60 min in water bath, absorbance value at 0 min significantly decreased(P<0.05), but at room temperature after 40 min significantly increased(P<0.05); KM mice sperm suspension in the water bath and under the condition of normal temperature after 50 min, compared with the 0 min, absorbance value increased significantly(P<0.05).Compared with control group, sperm density of ethanol oligozoospermia group by enzyme standard detector and standard curve calculation were significantly decreased (P<0.05);compared with absorbancy-sperm density equation, determination of ethanol oligozoospermia group of sperm density by cell counting plate method had not significant difference.The results suggested absorbancy-sperm density equation could effectively detect the reduction of the mice sperm in oligospermia.ConclusionUsing enzyme-labeled instrument to set up the curve of absorbancy- sperm density equation can estimate the sperm density of mice and rats rapidly and exactly.

sperm density; absorbance; SD rat; KM mice; oligospermia model

江偉雯， 女，碩士在讀，研究方向：中藥新藥與保健品研發(fā)，E-mail：304128246@qq.com；操紅纓，通訊作者，女，博士，副教授，研究方向：中藥泌尿與生殖藥理研究，E-mail：1171629708@qq.com。

R965

A

1005-1678(2015)09-0026-04