正交試驗優(yōu)選無糖潤肺顆粒醇提取工藝

沈麗娟，楊鑫驥，杜靜，何艷,傅應(yīng)華Δ

(1.浙江莎普愛思藥業(yè)股份有限公司，浙江 平湖 314200；2.嘉興學(xué)院 醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，浙江 嘉興 314001；3.杭州市紅十字會醫(yī)院藥劑科， 浙江 杭州 310009)

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正交試驗優(yōu)選無糖潤肺顆粒醇提取工藝

沈麗娟1，楊鑫驥2，杜靜3，何艷2,傅應(yīng)華2Δ

(1.浙江莎普愛思藥業(yè)股份有限公司，浙江 平湖 314200；2.嘉興學(xué)院 醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，浙江 嘉興 314001；3.杭州市紅十字會醫(yī)院藥劑科， 浙江 杭州 310009)

目的 優(yōu)化無糖潤肺顆粒劑的醇提取生產(chǎn)工藝。方法 采用3個不同比例的乙醇水作溶劑，選擇4因素3水平正交表L9(34)進行試驗，對處方中9味中藥的醇溶性成分進行提取，以黃芩苷含量和干浸膏得率2者加權(quán)之和為定量指標(biāo)，對影響醇提取效率的4個因素3個水平進行考察。結(jié)果 醇溶性成分提取最優(yōu)條件為：取9味中藥先用10倍量70%乙醇浸泡45 min，再加熱回流提取3次，每次1.5 h。結(jié)論 本法可最大限度提取處方中9味中藥的醇溶性成分，可作為潤肺顆粒劑的醇提取生產(chǎn)工藝。

無糖潤肺顆粒劑；醇提工藝優(yōu)化；正交試驗；黃芩苷

無糖潤肺顆粒劑是依據(jù)杭州市紅十字會醫(yī)院潤肺合劑處方(院內(nèi)協(xié)定處方)經(jīng)現(xiàn)代制備工藝研制而成的一個純中藥的固體制劑。其處方由桔梗、甘草、黃芩、麥冬等9味中藥組成，具有養(yǎng)陰潤肺、涼血解毒的功效。臨床上用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，可以降低疾病復(fù)發(fā)和使用糖皮質(zhì)類激素藥物、免疫抑制劑引起的毒副作用，在減少患者抗菌藥物用量、降低感染發(fā)生率方面療效顯著。由于原合劑用傳統(tǒng)中藥水煎煮方法制備而成，使大量醇溶性有效成分丟失，影響制劑的療效。為了最大限度獲取有效成分，保證無糖潤肺顆粒劑質(zhì)量穩(wěn)定可控，本文對處方中9味中藥采用乙醇提取，利用正交試驗法對醇提取工藝進行優(yōu)化。黃芩是處方中君藥之一，黃芩苷是其主要有效成分，含量也較高。因此以黃芩的有效成分黃芩苷為考察指標(biāo)，參考文獻[1-5]建立了高效液相色譜法測定無糖潤肺顆粒劑醇提干浸膏中黃芩苷含量的方法， 并以黃芩苷含量與醇提干浸膏得率加權(quán)之和為評判指標(biāo)，篩選出無糖潤肺顆粒劑9味中藥的最佳醇提取工藝條件，以期為實際生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器：高效液相色譜儀，由P680低壓四元泵，UVD170U紫外-可見檢測器，ASI-100自動進樣器，TCC-100柱溫箱，Chromeleon色譜數(shù)據(jù)工作站組成(美國Dionex公司)；電子天平(Mettler Toledo公司)。

1.1.2 藥品與試劑：黃芩苷對照品(批號：110715-201117，含量為91.7%，使用前無需干燥，購自中國食品藥品檢定研究院)；桔梗、甘草、黃芩、麥冬等9味中藥購自杭州桐君堂醫(yī)藥藥材有限公司中藥飲片廠，經(jīng)嘉興市食品藥品檢驗檢測院朱山寅主任中藥師鑒定均為正品；缺黃芩的8味中藥醇提對照空白樣品溶液1批(自制)。乙醇為藥用規(guī)格(濃度95%)，甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 黃芩苷含量測定方法的建立

① 檢測波長的選擇：取黃芩苷對照品適量，用甲醇溶解并定量稀釋至濃度約為10 μg/mL的溶液，于島津UV-2501PC紫外分光光度計上在200 ～ 400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。

② 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗方法：試驗了3種不同極性的反相C18色譜柱，包括Ailgent Zorbax SB-C18柱、依利特Krisomail-C18柱和Ailgent Zorbax Extend-C18柱，2種不同流動相系統(tǒng)包括甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)及添加少量磷酸，3種不同流速為0.5、1.0、1.5 mL/min，對色譜條件進行反復(fù)試驗，理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計算。

③ 樣品測定：精密量取正交試驗27份樣品溶液，振搖均勻，再精密量取1 mL，分別置25 mL量瓶中，加甲醇約20 mL，超聲溶解10 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；另精密稱取黃芩苷對照品適量，用甲醇溶解并準(zhǔn)確稀釋成含黃芩苷90.0 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計算樣品中黃芩苷含量。

④ 線性關(guān)系考察：精密稱取黃芩苷對照品10.60 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積，以峰面積(Y)對黃芩苷對照品濃度(X，μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸。

⑤ 進樣精密度試驗：精密稱取黃芩苷對照品適量，用甲醇溶解并定量稀釋至濃度約為90.0 μg/mL的溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進樣6次，測定峰面積。

⑥ 重復(fù)性試驗：取同一份正交試驗樣品，振搖均勻，再精密量取1 mL，置25 mL量瓶中，共5份，按“③樣品測定項下” 方法制備供試品溶液，同法測定黃芩苷含量。

⑦ 溶液穩(wěn)定性試驗：取同一份供試品溶液，在0、2、8、12、24 h內(nèi)取樣測定黃芩苷峰面積。

⑧ 加樣回收率試驗：取同一份已知含量的正交試驗樣品(黃芩苷含量為2.245 mg/mL)，振搖均勻，再精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，共9份，分3組，每組3份，各精密加入黃芩苷對照品溶液(含黃芩苷2.206 mg/mL)0.8、1、1.2 mL，按“③樣品測定項下” 方法制備供試品溶液，同法測定黃芩苷含量，計算低、中、高3個濃度的加樣回收率。

⑨ 專屬性試驗：取缺黃芩的醇提對照空白樣品溶液適量，按“③樣品測定項下” 方法用甲醇稀釋至與供試品溶液濃度相當(dāng)?shù)娜芤海鳛殛幮詫φ杖芤?，進樣10 μL；另取“③樣品測定項下” 制備的供試品溶液與黃芩苷對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.2 正交試驗的試驗方法

① 浸泡時間的優(yōu)選：按處方比例準(zhǔn)確稱取上述9味中藥各3份，每份16.4 g，分別加入10倍量50%、60%、70%乙醇，各浸泡30、45、60、75 min，抽濾凈藥材表面可流動溶劑，準(zhǔn)確稱重。

② 正交試驗設(shè)計：應(yīng)用正交設(shè)計的科學(xué)實驗設(shè)計方法，本文選定試驗因素為4，即不同濃度乙醇(A)、不同溶劑倍數(shù)(B)、不同提取時間(C)和不同提取次數(shù)(D)；各因素取3水平(表1)，按L9(34)正交表進行篩選[6]。根據(jù)正交試驗表進行試驗，對處方中9味中藥中的醇溶性有效成分進行提取。見表1。

表1 正交試驗的因素和水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment design

③ 試驗方法：按處方比例準(zhǔn)確稱取上述9味中藥飲片，每份16.4 g，共27份，置1000 mL磨口燒瓶中，連接冷凝管加熱回流提取，按L9(34)正交試驗表進行試驗。每份樣品在第一次加熱回流提取前均先浸泡45 min，經(jīng)不同時間、次數(shù)提取后，放冷，收集提取液，先經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇，再將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

④ 干浸膏量的測定[1]：按照《中國藥典》2010年版一部干燥失重法，精密吸取濃縮液25 mL，置已經(jīng)105 ℃干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥至恒重，計算干浸膏重量，再乘以2即為每份樣品所得醇提干浸膏的重量。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷含量測定結(jié)果

2.1.1 檢測波長的確定：確定最大吸收波長為280 nm。

2.1.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果：色譜柱：Krisomail-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水-磷酸(53︰47 ︰0.1)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃。理論板數(shù)按黃芩苷峰計算應(yīng)大于3500，黃芩苷峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于1.5。

2.1.3 專屬性試驗結(jié)果：在供試品溶液色譜圖中，呈現(xiàn)與黃芩苷對照品色譜保留時間(7.286 min)一致的色譜峰，陰性對照溶液未出現(xiàn)與對照品色譜保留時間一致的色譜峰，表明陰性對照溶液不干擾供試品溶液中黃芩苷的定量測定，方法專屬性好。見圖1。

圖1 對照品溶液(A)、供試品溶液(B)和陰性對照溶液(C)的高效液相色譜圖1 .黃芩苷Fig.1 HPLC chromatogram of standard solution(A), sample solution(B) and negative solution(C)1.Baicalin

2.1.4 線性關(guān)系考察結(jié)果：以峰面積(Y)對黃芩苷對照品濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程為Y=0.5302X-0.9120，r=0.9997。結(jié)果表明，黃芩苷峰面積與濃度在19.5～195.0 μg/mL之間呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗結(jié)果：計算6次進樣黃芩苷峰面積的RSD=0.22%。表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性測定結(jié)果：計算6份樣品中黃芩苷含量分別為2.263、2.180、2.258、2.194、2.275、2.301 mg/mL，平均含量為2.245 mg/mL，RSD=2.12%。表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果：對同一份供試液中黃芩苷測定其峰面積基本不變，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗結(jié)果：回收率試驗結(jié)果見表2，低、中、高3個濃度加樣回收率分別為95.0%，100.9%，102.2%，平均為99.4%。表明本法回收率良好。見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=3)Tab.2 Results of recovery test from sample(n=3)

2.2 正交試驗的試驗結(jié)果

2.2.1 浸泡時間的確定：經(jīng)3種不同濃度乙醇浸泡45 min后，藥材重量均不再增加，故確定浸泡時間為45 min。

2.2.2 正交試驗結(jié)果與方差分析:采用綜合評分法分析試驗結(jié)果，計算公式為

計算結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 L9(34)正交試驗結(jié)果(n=3)Tab.3 Optimization test results of L9(34)(n=3)

*評判指標(biāo)(%)=黃芩苷含量×10×60%+浸膏得率×40%*Assessment index (%)=baicalin content×10×60%+extract quantity×40%

表4 正交試驗方差分析表Tab.4 Variance analysis table of optimization test

F0.05(2,18)=6.01，F(xiàn)0.01(2,18)=3.55

由正交試驗結(jié)果和方差分析表可以看出，影響醇溶性成分提取的最大因素為提取次數(shù)，次序為D>B>C>A。通過比較各因素的均值，由直觀分析得醇提取最佳工藝為A3B3C2D3，即取9味中藥用10倍量70%乙醇浸泡45 min，再加熱回流提取3次，每次1.5 h。由于該實驗條件在正交試驗中沒有出現(xiàn)，因此按照這個條件進行驗證試驗。取9味中藥各3份，每份65.6 g，按確定的最佳提取條件操作，合并提取液，回收乙醇，濃縮后干燥，得3批干浸膏，按上述給定的色譜條件測定黃芩苷含量，得3批浸膏的黃芩苷平均含量為2.05%，RSD=3.68%；干浸膏平均得率為44.51%，RSD=3.24%，評判指標(biāo)為29.92%，達到了最大提取效果。表明該工藝穩(wěn)定，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

3 討論

無糖潤肺顆粒處方中9味中藥均含有醇溶性成分，其中黃芩含有黃芩苷等；天冬含β-谷甾醇、菝葜皂苷元、薯蕷皂苷元等[7]，麥冬含甾體皂苷、黃酮類[8]，玄參主要含有環(huán)烯醚萜類、苯丙素苷、糖類、肉桂酸、皂苷[9]等；桔梗主要含有皂苷類、遠志酸類，甾醇類等[10]，半夏主要成分為生物堿、β-谷甾醇、多糖、半夏蛋白、氨基酸、揮發(fā)油及無機元素等多種化學(xué)成分；枳殼主要含有黃酮類化合物、揮發(fā)油和少量的生物堿等成分[11]；淡竹葉含有黃酮類，用乙醇可以提取更完全。原合劑工藝采用加水煎煮，提取效率低，造成大量有效成分丟失。為此，改進的顆粒劑提取工藝將藥材先用70%乙醇提取，其藥渣加水煎煮提取水溶性成分，大大提高了有效成分的提取量，制成的顆粒劑質(zhì)量更穩(wěn)定，為新藥的開發(fā)與藥效學(xué)再評價提供更好的劑型。由表3可見，干浸膏中黃芩苷平均含量在1.59%～2.18%，干浸膏平均得率在25.37%～47.37%之間，2者差異較大。如果不增加黃芩苷含量的權(quán)重，直接與干浸膏得率進行計算，所得結(jié)果主要反映干浸膏得率的變化。為此，本實驗采取增加黃芩苷含量權(quán)重的方法，即通過將黃芩苷含量乘以10，再按照黃芩苷含量︰干浸膏得率(60︰40)進行計算，得到的評判指標(biāo)可充分反映黃芩苷含量與干浸膏得率2者的量，這樣得到的醇溶性成分既可獲得較高的黃芩苷含量，又可增加干浸膏的得率，可改進制劑質(zhì)量，提高療效。由于本處方的出膏率為44.5%，一次服用量即使在不加輔料情況下也很難制備成片劑或膠囊劑，故選擇制備成顆粒劑。

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(編校：王冬梅)

Optimizing ethanol extraction technology for no sugar runfei granules by orthogonal experiment design

SHEN Li-juan1, YANG Xing-ji2, DU Jing3, HE Yan2, FU Ying-hua2Δ

(1.Zhejiang Shapuaisi Pharmaceutical Co.Ltd., Pinghu 314200, China; 2.Department of Pharmacy, College of Medicine, Jiaxing University, Jiaxing 314001, China; 3.Department of Pharmacy, Hangzhou Red Cross Hospital, Hangzhou 310009, China)

ObjectiveTo optimize ethonal extraction technology for no sugar runfei granules.MethodsEthanol was used as a solvent to extract the ethanol dissolvable ingredients in 9 kinds of medicinal materials.The formula L9(34) table was used to examine the effects of 4 factors and 3 levels.The weighted sum of baicalin content and the dried extract quantity was used as quantitative index.ResultsThe maximize optimize condition for extraction of ethanol dissolvable ingredients was as follows: 9 kinds of medicinal materials, add of 10-fold 70% ethanol solution, soaked for 45 min, and extracted by heating reflux for 3 times,1.5 h each time.ConclusionThe method can maximize extraction of ethanol dissolvable effective ingredents in 9 kinds of medicinal materials and can be used as ethonal extraction technologgary of no sugar runfei granules.

no sugar runfei granules; ethanol extraction technology optimization; orthogonal experiment; baicalin

嘉興學(xué)院重點大學(xué)生研究訓(xùn)練計劃(NO.851714071)

沈麗娟，女，本科，工程師，研究方向：藥物制劑與質(zhì)量控制，E-mail:947859149@qq.com；傅應(yīng)華，通訊作者，女，本科，教授，研究方向：藥物制劑與質(zhì)量控制，E-mail:yaoji6217@ sohu.com。

R944.27

A

1005-1678(2015)09-0158-04