丙型肝炎病毒感染人肝細(xì)胞系對(duì)多種唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響

劉曉宇，章曉聯(lián)

(武漢大學(xué)病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省過(guò)敏及免疫相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院/武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系，湖北 武漢 430071)

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丙型肝炎病毒感染人肝細(xì)胞系對(duì)多種唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響

劉曉宇，章曉聯(lián)Δ

(武漢大學(xué)病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省過(guò)敏及免疫相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院/武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系，湖北 武漢 430071)

目的 探討丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染人肝癌細(xì)胞系Huh7.5.1細(xì)胞后與腫瘤相關(guān)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶家族的35個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)變化。方法 利用HCV感染的Huh7.5.1肝細(xì)胞模型，采用Western blot檢測(cè)HCV感染后HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的表達(dá),定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)HCV感染后HCV-RNA的表達(dá)及HCV感染對(duì)Huh7.5.1細(xì)胞中35個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)水平的影響。凝集素染色實(shí)驗(yàn)測(cè)定HCV感染對(duì)Huh7.5.1細(xì)胞中糖苷表達(dá)水平的影響。結(jié)果 在HCV感染后的Huh7.5.1細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)4個(gè)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST3Gal III、ST6GalNAC III、ST8Sia III和ST8Sia IV)和5個(gè)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(B3GALT 1、B3GALT 2、B3GALT 3、B3GALT 4和B4GALNT 2)的mRNA水平明顯升高11～45倍，其中變化最大的是B3GALT 1，上升45倍，其次是ST8Sia III和ST8Sia IV,分別上升37倍和39倍。進(jìn)一步采用凝集素染色實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)結(jié)合末端唾液酸糖苷Neu5Acα6Gal的接骨木凝集素(elderberry lectin，EBL)在HCV感染后升高1.97倍，結(jié)合末端半乳糖苷Galβ1,3GalNAc的尾穗莧凝集素(amaranthus caudatus agglutinin，ACA)和結(jié)合Galβ1,4GalNAc的雞冠刺桐凝集素(erythrina cristagalli agglutinin，ECA)分別升高3倍和4.3倍。結(jié)論 HCV感染導(dǎo)致人肝細(xì)胞中特定唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶及其相應(yīng)糖苷表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯上升。這些結(jié)果對(duì)研究HCV感染的治療靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物具有一定參考價(jià)值。

丙型肝炎病毒；唾液酸轉(zhuǎn)移酶；半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；HCV感染；糖苷標(biāo)志物

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)屬于黃病毒家族的肝炎病毒屬[1]，是9.6 kb大小的單股正鏈RNA病毒，編碼3010個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多聚蛋白，分為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。目前全球約有1.8億人感染丙型肝炎病毒HCV[3]，其感染易慢性化，部分慢性丙型肝炎患者最終可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌[4]。HCV感染導(dǎo)致的肝癌嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，但其具體機(jī)制并不明確。

近年來(lái)，尋找參與HCV免疫致病的關(guān)鍵性宿主因子和翻譯后修飾調(diào)控因子成為研究的熱點(diǎn)。眾所周知，很多宿主細(xì)胞膜蛋白和幾乎所有的免疫分子都是糖蛋白[5]，而糖鏈?zhǔn)窃谔腔D(zhuǎn)移酶的催化下由每一個(gè)單糖連接而形成的，因此其可作為HCV研究感染和糖基轉(zhuǎn)移酶之間的橋梁。一些糖基轉(zhuǎn)移酶的異常表達(dá)是某些特定腫瘤的重要標(biāo)志，也是目前病毒感染和腫瘤診斷與治療研究中的一個(gè)新靶點(diǎn)。

糖基化是一種很普遍的蛋白翻譯后修飾，異常的糖基化常發(fā)生于多種人類(lèi)癌癥，大量的糖基表位被劃分為腫瘤相關(guān)糖抗原[6]，如在肺癌[7]、乳腺癌[8]、腦膜炎[9]中發(fā)現(xiàn)β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是異常表達(dá)的。在人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中發(fā)現(xiàn)其凋亡與B4GALT1的表達(dá)密切相關(guān)[10]。在原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的研究發(fā)現(xiàn)，唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3Gal IV和ST6Gal I分別是導(dǎo)致人肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721細(xì)胞膜表面α2,3-和α2,6-唾液酸高表達(dá)的關(guān)鍵酶之一[11]。

目前被確認(rèn)的糖基轉(zhuǎn)移酶大約有300種，糖基轉(zhuǎn)移酶是催化糖鏈合成及糖鏈與蛋白質(zhì)或者脂質(zhì)形成復(fù)合物的一大類(lèi)酶家族，分為O-糖基轉(zhuǎn)移酶、N-糖基轉(zhuǎn)移酶、C-糖基轉(zhuǎn)移酶、S-糖基轉(zhuǎn)移酶。最新研究表明，糖基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)、分化、增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等細(xì)胞基本活動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，其異常表達(dá)或活性變化與細(xì)胞癌變、轉(zhuǎn)移、抗原遞呈、免疫逃逸等腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)[12]。N-糖苷主要是由N-糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)合成的，在所有糖蛋白中有50%是N-糖苷修飾的糖蛋白[13]，唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是在介導(dǎo)N-糖苷合成中的2種重要的N-糖基轉(zhuǎn)移酶。

唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族是以胞苷一磷酸-β-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-β-N-acetylneuramic acid,CMP-Neu5Ac,胞嘧啶核苷-5’-單磷酸鈉鹽)為底物，將唾液酸殘基轉(zhuǎn)移至新的糖基接受體，形成唾液酸糖基化合物的酶。其在炎癥、細(xì)胞粘附等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前發(fā)現(xiàn)共有20種唾液酸轉(zhuǎn)移酶，以與糖殘基的不同連接方式分為ST3Gal I-VI、ST6Gal I-II和ST6GalNAc I-VI、ST8Gal I-VI 3個(gè)亞家族，分別將CMP-Neu5Ac中的Neu5Ac以α2,3、α2,6或α2,8糖苷鍵的形式轉(zhuǎn)移至半乳糖、N-乙酰半乳糖胺或唾液酸上[14]。

半乳糖基轉(zhuǎn)移酶家族中，β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(B4GALT)家族，是一類(lèi)Ⅱ型跨膜蛋白，將β-1,4連接處的半乳糖轉(zhuǎn)移至相似的糖類(lèi)受體。目前發(fā)現(xiàn)共有6個(gè)成員(B4GALT 1-6)，且表達(dá)具有組織特異性[15]，在形態(tài)發(fā)生[16]、哺乳動(dòng)物受精[17]、大腦發(fā)育[18]、細(xì)胞粘附[19]等過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。而β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(B3GALT)是一類(lèi)將糖類(lèi)或脂類(lèi)底物半乳糖化，并以β-GlcNAc作為末端的一類(lèi)糖基化轉(zhuǎn)移酶[20]。

凝集素(lectin)是一種非免疫來(lái)源、對(duì)糖及其綴合物可逆專(zhuān)一識(shí)別的蛋白質(zhì)分子，是對(duì)各種糖復(fù)合物具有高度特異性結(jié)合能力的蛋白質(zhì)，其可用于糖復(fù)合物的檢測(cè)與鑒定。凝集素廣泛分布于植物、動(dòng)物和微生物中，其中植物凝集素可以分為7組：巖藻糖組、半乳糖/N-乙酰半乳糖胺組、N-乙酰葡萄糖胺組、甘露糖組、唾液酸組、復(fù)合糖組。雞冠刺桐凝集素(erythrina cristagalli agglutinin，ECA)和尾穗莧凝集素(amaranthus caudatus agglutinin，ACA)屬于半乳糖/N-乙酰半乳糖胺組凝集素，接骨木凝集素(elderberry lectin，EBL)屬于唾液酸組凝集素[21]。

目前國(guó)內(nèi)外尚未有HCV感染肝細(xì)胞Huh7.5.1模型后研究唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的相關(guān)性報(bào)道。本課題旨在系統(tǒng)地針對(duì)唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶家族進(jìn)行研究，探索HCV感染人肝癌細(xì)胞系Huh7.5.1后糖基轉(zhuǎn)移酶基因水平的表達(dá)，以進(jìn)一步闡明HCV感染的分子機(jī)制，為HCV感染治療和診斷提供靶點(diǎn)和標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒:Huh7.5.1細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞系[22]，由本實(shí)驗(yàn)室保存)；HCVcc (cell cultured derived HCV，genotype 2a，JFH1 isolate，由本實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.1.2 試劑、儀器：DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))；胎牛血清(Gibco，美國(guó))；Trizol Reagent(Invitrogen，美國(guó))；ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo，日本)；SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Toyobo，日本)；小鼠抗NS3單抗及HRP-羊抗鼠IgG(Abcam，英國(guó))；定量實(shí)時(shí)PCR儀(step one plus)(ABI，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及HCV病毒感染：Huh7.5.1細(xì)胞接種于含10%滅活胎牛血清、抗生素(100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Huh7.5.1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度以2×105細(xì)胞/孔接種6孔板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；將107copies/mL的HCVcc加到每個(gè)孔中，培養(yǎng)4 h后將細(xì)胞培養(yǎng)基換為新鮮的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)HCV-RNA及35個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶的mRNA水平：采用Trizol法提取HCVcc(107copies/mL)感染3d的Huh7.5.1細(xì)胞(2×105細(xì)胞)總RNA；按ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，取1μg RNA，以隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)做內(nèi)參，定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)HCV-RNA及35個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA的表達(dá)。反應(yīng)體系如下：2μL cDNA、0.8μL上游引物(10μm)、0.8μL下游引物(10μm)、10μL 2×SYBR Green mix、6.4μL無(wú)RNA酶水；反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；58 ℃ 15 s； 72 ℃ 45 s，40次循環(huán)。按ΔΔCT=2-(CtTarget gene-CtGAPDH)計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

HCV上游引物：5’-AGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTC-3’， 下游引物：5’-ACAAGGCCTTTCGCAACCCAA-3’；GAPDH上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’；35個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶序列根據(jù)他們?cè)贜CBI中基因編號(hào)，采用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物。

1.2.3 Western blot檢測(cè)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的表達(dá)：收集HCV(107copies/mL)感染72 h的Huh7.5.1細(xì)胞(2×105細(xì)胞)；細(xì)胞裂解液[20 mM Tris(pH7.5)，150 mM NaCl，1%Triton X-100，1%蛋白酶抑制劑(cocktail)]裂解細(xì)胞得到總蛋白；BCA法測(cè)定總蛋白的濃度；SDS-PAGE凝膠電泳；5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h；然后加1:2000稀釋的小鼠抗NS3單抗，室溫孵育1 h；TBST洗5 min，重復(fù)3次，加1:3000稀釋的二抗HRP-羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h；TBST洗5 min，重復(fù)6次；ECL發(fā)光顯影：將等體積的ECL試劑A液、B液，混合均勻加到轉(zhuǎn)印膜上，反應(yīng)5 min，暗室曝光1 min。

1.2.4 凝集素染色檢測(cè)糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)應(yīng)的凝集素表達(dá)：收集HCV(107copies/mL)感染72 h的Huh7.5.1細(xì)胞(2×105細(xì)胞)；RIPA裂解液獲取蛋白樣品，定量并調(diào)整樣品濃度一致，經(jīng)碳酸鹽緩沖液調(diào)整pH至8.8后用CY3標(biāo)記(1 mL樣品/1μL染料)；分別取1 mg/mL的EBL、ECA、ACA以20μL/孔包被于不透明黑色384孔熒光酶標(biāo)板，濕盒4 ℃孵育過(guò)夜；PBST洗2 min，重復(fù)2次；無(wú)蛋白封閉液封閉，濕盒37 ℃ 1h；PBST洗2 min，重復(fù)2次；取濃度為1 mg/mL的Cy3標(biāo)記的細(xì)胞膜糖蛋白，以20 μL/孔加入熒光酶標(biāo)板，濕盒37 ℃ 1 h；PBST洗2 min，重復(fù)2次；上機(jī)檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)550，發(fā)射波長(zhǎng)570)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

2 結(jié)果

2.1 人肝癌細(xì)胞Huh7.5.1中HCV的感染及其表達(dá)檢測(cè) qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示：與未感染的Huh7.5.1細(xì)胞相比，HCVcc感染Huh7.5.1細(xì)胞后，HCV-RNA的水平明顯增加(見(jiàn)圖1A，P<0.05)；HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的表達(dá)量顯著積累(見(jiàn)圖1B)。提示Huh7.5.1成功感染HCV。

圖1 HCVcc感染對(duì)Huh7.5.1細(xì)胞HCV mRNA(A)以及NS3蛋白(B)的表達(dá)1：未感染Huh7.5.1細(xì)胞；2：HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞Fig.1 Eflect of HCVcc infection on expressions of HCV mRNA (A) and NS3 protein (B)in Huh7.5.1 cells1:Huh7.5.1 cells without infection;2:HCVcc infected Huh7.5.1 cells

2.2 HCVcc感染人肝癌細(xì)胞Huh7.5.1后差異表達(dá)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的篩選與鑒定 根據(jù)20個(gè)人唾液酸轉(zhuǎn)移酶相對(duì)應(yīng)的NCBI中基因編號(hào)設(shè)計(jì)的引物序列見(jiàn)表1。采用qRT-PCR對(duì)20個(gè)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：與未感染Huh7.5.1細(xì)胞相比，HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞中唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3Gal III、ST6GalNAC III、ST8Sia III、ST8SiaIV的mRNA表達(dá)均明顯增高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。其中ST3Gal III約上升11倍，ST6GalNAC III約上升24倍，ST8Sia III約上升37倍，ST8SiaIV約上升39倍，見(jiàn)表2。

編號(hào)糖基轉(zhuǎn)移酶倍數(shù)編號(hào)糖基轉(zhuǎn)移酶倍數(shù)1ST3GalI0.10±0.1019ST8SiaV6.12±0.312ST3GalII3.28±0.9020ST8SiaVI0.66±0.823ST3GalIII11.57±1.8521B4GALT12.28±0.014ST3GalIV4.91±0.2922B4GALT20.14±0.115ST3GalV0.10±0.1023B4GALT30.01±0.016ST3GalVI4.28±0.6524B4GALT40.18±0.057ST6GalI1.69±0.2325B4GALT54.16±4.578ST6GalII5.26±7.0826B4GALT67.02±2.039ST6GalNACI6.23±0.1327B3GALT145.86±9.5710ST6GalNACII1.94±0.1328B3GALT225.42±7.8311ST6GalNACIII24.80±0.5529B3GALT319.38±0.3712ST6GalNACIV1.11±0.0230B3GALT411.33±1.1713ST6GalNACV0.29±0.4031B3GALT52.94±2.4214ST6GalNACVI0.09±0.0232B4GALNT12.29±0.4215ST8SiaI0.07±0.1033B4GALNT216.98±4.5316ST8SiaII0.01±0.0134B4GALNT35.38±1.7917ST8SiaIII37.68±4.3935B4GALNT41.32±0.2218ST8SiaIV39.69±1.36

2.3 HCVcc感染人肝癌細(xì)胞Huh7.5.1后差異表達(dá)的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶的篩選與鑒定 根據(jù)15個(gè)人半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶相對(duì)應(yīng)的NCBI中基因編號(hào)設(shè)計(jì)的引物序列見(jiàn)表3。采用qRT-PCR對(duì)15個(gè)半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：與未感染Huh7.5.1細(xì)胞相比，HCVcc感染Huh7.5.1細(xì)胞后，細(xì)胞中半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶B3GALT 1、B3GALT 2、B3GALT 3、B3GALT 4以及B4GALNT 2的mRNA表達(dá)均明顯增高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。其中B3GALT 1約上升45倍，B3GALT 2、B3GALT 3、B3GALT 4以及B4GALNT 2分別約上升25、19、11、17倍，見(jiàn)表2。

表3 15個(gè)半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶引物的設(shè)計(jì)與序列

圖3 HCVcc感染對(duì)Huh7.5.1細(xì)胞15個(gè)半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)的影響(n=6)*P<0.05，與Huh7.5.1相比較Fig.3 Effect of HCVcc infection on mRNA expressions of 15 kinds of galactosyltransferases in Huh7.5.1 cells (n=6)*P< 0.05, compared with Huh7.5.1 cells

2.4 凝集素染色檢測(cè)HCVcc感染人肝癌細(xì)胞Huh7.5.1的差異表達(dá)糖蛋白 凝集素染色結(jié)果顯示：與未感染的Huh7.5.1細(xì)胞相比，HCVcc感染Huh7.5.1細(xì)胞后，EBL、ECA和ACA的結(jié)合都發(fā)生不同程度的增高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。其中EBL在HCV感染后其結(jié)合約增加1.97倍，ECA和ACA的結(jié)合分別增加了約4.3倍和3倍，見(jiàn)表4。結(jié)果表明HCV感染人肝癌細(xì)胞Huh7.5.1導(dǎo)致唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)升高，影響了唾液酸基及半乳糖基修飾的糖蛋白，從而影響了識(shí)別唾液酸基和半乳糖基修飾的糖蛋白的凝集素的結(jié)合。

圖4 凝集素染色檢測(cè)HCVcc感染Huh7.5.1細(xì)胞后差異表達(dá)的糖蛋白(n=6)Fig.4 Expression levels assessed by lectin binding analysis of membrane glycoproteins when Huh7.5.1 cells were infected with HCVcc(n=6) 表4 HCVcc感染Huh7.5.1細(xì)胞后差異表達(dá)的糖蛋白(n=6)Tab.4 Fold changes of glycan profiles after Huh7.5.1 cells were infected with HCVcc(n=6)

糖基轉(zhuǎn)移酶凝集素來(lái)源糖特異性倍數(shù)sialyltransferaseEBLSambucusNigraLectinAmaranthusNeu5Acα6Gal/GalNAc1.97±0.03galactosyltransferaseACACaudatusLectinGalβ1-3GalNac3.00±0.28ECAErythrinaCristagalliLectinGalβ1,4GalNac4.30±0.98

3 討論

有關(guān)肝癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，已有研究表明[23]，在肝癌發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)及活性均發(fā)生很大改變，對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的研究可以為肝癌臨床診斷以及抗藥物作用靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

據(jù)Zhang等[11]報(bào)道，與正常肝細(xì)胞系L-02相比，人肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721中ST3Gal IV、ST6Gal I表達(dá)上調(diào)；ST3Gal I、ST3Gal V、ST3Gal VI表達(dá)下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，與未感染人肝癌細(xì)胞Huh7.5.1相比，HCV感染的Huh7.5.1細(xì)胞中ST3Gal IV的mRNA的表達(dá)上升了約5倍，表達(dá)上調(diào)，與Zhang等報(bào)道的肝癌細(xì)胞中ST3Gal IV表達(dá)上調(diào)相一致；結(jié)果還發(fā)現(xiàn)HCV感染的Huh7.5.1細(xì)胞中ST3Gal VI的mRNA表達(dá)上升了約4倍，是高表達(dá)的，與Zhang等報(bào)道的肝癌細(xì)胞中ST3Gal VI低表達(dá)不一致。本研究結(jié)果表明ST3Gal IV、ST3Gal VI在HCV感染的肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)可能是由于特異HCV感染導(dǎo)致的結(jié)果。

有報(bào)道顯示在人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中發(fā)現(xiàn)B4GALT1可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]，采用放線(xiàn)菌酮誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)B4GALT1的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)；而將蛋白激酶B(抗凋亡)轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，則細(xì)胞凋亡受到抑制，B4GALT1的mRNA表達(dá)水平和酶活性均下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)在HCV感染的人肝癌細(xì)胞Huh7.5.1中，B4GALT1的mRNA表達(dá)上升了約2倍，可以猜測(cè)HCV感染可能也會(huì)促進(jìn)Huh7.5.1細(xì)胞的凋亡，HCV感染導(dǎo)致B4GALT1表達(dá)上調(diào)是否促進(jìn)Huh7.5.1細(xì)胞凋亡需進(jìn)一步研究。。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HCV感染人肝癌細(xì)胞系Huh7.5.1細(xì)胞后，ST8Sia III、ST8SiaIV、B3GALT 1的基因表達(dá)水平明顯增高，提示這些糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)增高很可能是HCV感染所致。此外，這些糖基轉(zhuǎn)移酶修飾的糖苷所對(duì)應(yīng)的凝集素的結(jié)合也發(fā)生了不同程度的升高。因此，當(dāng)HCV感染人肝細(xì)胞時(shí)，唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是顯著增高的。

目前尚未有肝癌細(xì)胞系Huh7.5.1細(xì)胞中唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)與HCV感染的相關(guān)性報(bào)道，本研究從糖免疫學(xué)角度出發(fā)，為進(jìn)一步探討HCV感染與唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶之間的關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)，為研究HCV感染機(jī)制以及治療提供了新的思路；為深入闡釋HCV感染導(dǎo)致肝臟病變的免疫病理機(jī)制和抗病毒藥物的研究提供了新的作用靶點(diǎn)。接下來(lái)的研究將集中在HCV感染與唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶表達(dá)增高的內(nèi)在關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制：如糖基轉(zhuǎn)移酶的升高是否促進(jìn)HCV的復(fù)制、感染、耐藥等；HCV感染是如何影響糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)等；并對(duì)本研究中發(fā)現(xiàn)的HCV感染后表達(dá)量明顯升高的3種糖基轉(zhuǎn)移酶(ST8Sia III、 ST8SiaIV、B3GALT 1)在用于臨床診斷HCV感染的肝癌患者中進(jìn)行驗(yàn)證，以期能找到HCV感染人肝細(xì)胞的作用靶點(diǎn)。

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(編校：吳茜)

Effect of hepatitis C virus infection on the expressions of multiple sialyltransferases and galactosyltransferases in Huh7.5.1 cell

LIU Xiao-yu, ZHANG Xiao-LianΔ

(State Key Laboratory of Virology/Hubei Province Key Laboratory of Allergy and Immunology/Medical Research Institute, Wuhan University/Department of Immunology, Wuhan University School of Basic Medical Sciences, Wuhan 430071, China)

ObjectiveTo investigate the altered glycotransferases and glycan profile in HCV-infected cells, the expression levels of 35 kinds of sialyltransferases and galactosyltransferases were evaluated in hepatitis C virus (HCV) infected Huh7.5.1 cell cultured model.MethodsWestern blot was used to measure the expressions of HCV-nonstructural protein NS3 and and quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was performed to determine HCV-RNA levels and mRNA levels of 35 kinds of sialyltransferases and galactosyltransferases.Lectin microarray was used to compare the glycan profiles of sialyltransferases-and galactosyltransferases-associated glycan-profile in Huh7.5.1 cells and HCV infected Huh7.5.1 cells.ResultsAmong the 35 kinds of sialyltransferases and galactosyltransferases, the mRNA levels of four sialyltransferases (including ST3Gal III, ST6GalNAC III, ST8Sia III and ST8SiaIV) and five galactosyltransferases (including B3GALT1, B3GALT 2, B3GALT3, B3GALT 4 and B4GALNT2) were found to be 11-45 fold higher in HCV-infected cells compared with naive Huh7.5.1 cells.The up-regulated level of B3GALT 1 was the most evident (45-fold change), followed by ST8Sia IV and ST8Sia III, with 39-and 37-fold respectively.Consistently, lectin microarray showed that glycans recognized by EBL (binding terminal sialic acid, Neu5Acα6Gal, 1.97-fold change), ECA letin (binding terminal galactose, Galβ1,4GalNAc,4.3-fold change), and ACA(binding terminal galactose, Galβ1-3GalNAc, 3-fold change) were elevated in glycoprotein products of sialyltransferase and galactosyltransferase respectively.ConclusionHCV infection causes the increased expression levels of mutiple sialyltransferases and galactosyltransferases in Huh7.5.1 cell line and hence the upregulation of glycan profiles of the glycoproteins.These results provide potential therapeutic targets and diagnostic markers for HCV infection and insights on the molecular mechanism of HCV infection.

hepatitis C virus; sialyltransferase; galactosyltransferase; HCV infection; biomarker

國(guó)家自然科學(xué)基金(21572173，31370197);湖北省醫(yī)學(xué)領(lǐng)軍人才計(jì)劃(523-276003);973課題(2012CB720604)

劉曉宇，女，碩士在讀，研究方向：感染與分子免疫，E-mail：xiaoyu_liu@yeah.net；章曉聯(lián)，通信作者，女，博士，教授，研究方向：病原微生物糖生物學(xué)與感染免疫，E-mail：zhangxiaolian@whu.edu.cn。

R373.2

B

1005-1678(2015)10-0005-06