PAK1基因3′-UTR區(qū)熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建及鑒定

劉 偉，寇 博，賀大林，郭 鵬

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061)

·基礎(chǔ)研究·

PAK1基因3′-UTR區(qū)熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建及鑒定

劉 偉，寇 博，賀大林，郭 鵬

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061)

目的 針對人p21小GTP酶活化激酶1(p21-activated kinase-1, PAK1)基因的3′端非翻譯區(qū)(3′-untranslated region, 3′-UTR)構(gòu)建PAK1的熒光素酶報告基因載體，并對其進行鑒定和篩選，為后續(xù)PAK1與microRNA-145(miR-145)的功能和機制研究提供實驗基礎(chǔ)。方法 用PCR法擴增出PAK1基因3′-UTR片段，經(jīng)連接、酶切插入到pGL3載體上，構(gòu)建了PAK1 3′-UTR熒光素酶報告基因載體。通過生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-145可能靶向作用于PAK1基因的3′-UTR，后將上述重組質(zhì)粒以及miRNA mimics(miRNA模擬物)、miRNA-Con(miRNA control，miRNA 陰性對照)瞬轉(zhuǎn)到膀胱癌T24和J82細胞系中，并檢測其相對熒光素酶活性。另外，利用實時定量PCR法檢測不同實驗組中PAK1的表達情況。結(jié)果 成功構(gòu)建了重組pGL3-PAK1 3′-UTR WT質(zhì)粒，并通過雙酶切以及測序的方法驗證所得結(jié)果的正確性。且轉(zhuǎn)染pGL3-PAK1 3′-UTR WT質(zhì)粒后，T24/miR-145組和J82/miR-145的相對熒光素酶活性顯著低于T24/miR-con 和J82/miR-con組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 另外，通過實時定量PCR法發(fā)現(xiàn), miR-145 mimics組的PAK1表達水平顯著低于miR-145 con組。結(jié)論 成功構(gòu)建了PAK1基因3’-UTR區(qū)熒光素酶報告載體，且miR-145能夠顯著降低其熒光素酶活性，提示miR-145能靶向負調(diào)控 PAK1的表達。

p21小GTP酶活化激酶1；3′端非翻譯區(qū)；熒光素酶報告基因；microRNA-145；膀胱癌

近年來蛋白激酶成為腫瘤研究的熱點之一，因其可影響腫瘤細胞的生長和侵襲，而作為腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要生物靶點。PAK1 (p21-activated kinase-1)即p21小GTP酶活化激酶1，只在腦、肌肉等正常組織中表達，在其他組織中的表達很少[1]。但近年來多項研究報道，多種人腫瘤細胞均高表達PAK1[2]，尤其是在乳腺癌和卵巢癌細胞中PAK1的表達遠高于其他腫瘤細胞，且PAK1的表達與乳腺癌、卵巢癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。這說明PAK1與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有著緊密聯(lián)系，提示PAK1在腫瘤的進展中發(fā)揮一定的作用。

miRNAs(microRNAs)是一類內(nèi)源性的單鏈小分子 RNA，大小約為 20～25 nt，研究表明 miRNA 在各種真核細胞中廣泛存在，參與生物體的生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、組織分化、疾病發(fā)生等過程，還決定其他很多生物體發(fā)育和行為的變化[3]。其可通過靶向mRNA的3′端非翻譯區(qū)(3′-untranslated region, 3′-UTR)調(diào)控多個癌基因并抑制其表達，從而發(fā)揮抑癌基因的功能[4]。為了探究可能參與PAK1基因調(diào)控的miRNA，本研究構(gòu)建了PAK1基因3′-UTR 熒光素酶報告載體，并通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)預(yù)測相關(guān)miRNA與PAK1基因3′-UTR的生物靶向性，為接下來研究PAK1與相關(guān)miRNA的功能與作用機制奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌細胞株T24和J82均在西安交通大學(xué)泌尿外科研究所保存；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司；熒光素酶報告基因載體pGL3購自深圳華安平康公司；miRNA-NC及miRNA-145 mimics由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；限制性內(nèi)切酶XhoI、HindⅢ、T4連接酶，Taq酶、T-Vector、DNA純化試劑盒，膠回收試劑盒均購自TaKaRa 公司；DH5α感受態(tài)細菌，PrimeScript RT Reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq II均購自TaKaRa公司；總RNA抽提試劑盒RNAfast200購自上海飛捷公司；DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO 公司；胎牛血清購自Hyclone及杭州四季青公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人膀胱癌細胞株T24和J82為加入10%四季青胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 擴增PAK1 mRNA 3′-UTR序列 在NCBI(National Center of Biotechnology Information,美國國家生物技術(shù)信息中心)基因庫查找PAK1 3′-UTR序列(NM_001128620.1)，利用引物設(shè)計軟件輔助設(shè)計合成PCR引物，用于擴增PAK1 3′-UTR序列的上游引物為5′-CACAATCTAGAGCAAATGCTAGTGCCACCAC-3′，包含XhoI酶切位點；而下游引物為5′-AAGGATCCGGTTACTGTCACAAACTGC-3′，包含HindⅢ酶切位點。預(yù)計擴增片段長度為748 bp。選取PAK1表達水平較高的對數(shù)生長期膀胱癌細胞株T24和J82，DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，收取細胞用RNAfast200提取RNA，之后用PrimeScript RT Reagent Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。合成的該cDNA作為模板并使用設(shè)計的引物擴增PAK1 mRNA 3′-UTR序列，擴增后PCR產(chǎn)物行DNA定量，于-20℃儲存。

1.2.3 熒光素酶報告載體構(gòu)建 PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠回收試劑盒提純并獲取膠回收片段，再將其連接于T-Vector載體上，之后以低溫CaCl2(氯化鈣)法轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細菌，使用氨芐霉素進行抗藥篩選，搖菌過夜后挑選單克隆菌落，后提取連接質(zhì)粒和pGL3空質(zhì)粒并進行XhoI、HindⅢ雙酶切分析鑒定，所得產(chǎn)物用DNA連接酶、反應(yīng)緩沖液等按一定體系進行連接，16 ℃過夜。檢測重組質(zhì)粒的表達情況，最后獲得重組的報告基因載體pGL3-PAK1 3′-UTR WT。

1.2.4 PAK1基因3′-UTR的靶miRNA預(yù)測 采用生物信息學(xué)預(yù)測軟件Targetscan (http://www.targetscan.org) 和miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/) 等預(yù)測與PAK1基因3′-UTR相互作用的miRNA。

1.2.5 共轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞系 轉(zhuǎn)染前1 d將T24和J82細胞以相同數(shù)目接種于24孔板(細胞密度占孔底的60%～70%)，并設(shè)置3個復(fù)孔。將50 μL無血清培養(yǎng)基與1 μL Lipofectamine 2000(脂質(zhì)體2000) 混合，配制成溶液1；將50 μL無血清培養(yǎng)基與1 μL質(zhì)?；旌希渲瞥扇芤?；溶液1與溶液2均靜置5 min，后將溶液1與溶液2混合，并加入6 μL三種不同實驗組，即空白對照組、miRNA-Con組(miRNA陰性對照)、miRNA-145 mimics組(miRNA-145 模擬物)，靜置15 min。后將上述約100 μL的混合液逐滴加入各孔中，置于37 ℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)4 h，棄去廢液，換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.2.6 檢測報告基因 將5×細胞裂解液(5×lysis buffer)用雙蒸水稀釋至1×的工作液，吸除轉(zhuǎn)染各孔內(nèi)的培養(yǎng)基，于各孔(需預(yù)先用PBS緩沖液洗滌1～2次)中加入100 μL稀釋好的1×細胞裂解液，置于搖床上震蕩15 min，將各孔的細胞裂解液移至新的離心管內(nèi)，12 000轉(zhuǎn)，離心1 min沉淀雜質(zhì)。取20 μL上述細胞裂解液于不透明96孔板各孔中，加入100 μL LARⅡ檢測Firefly Luciferase(螢火蟲熒光素酶)活性，后加入100 μL Stop&Glo試劑檢測Renilla Luciferase(海腎熒光素酶)活性，并計算兩者比值，同時以空載體pGL3作為對照, 從而判斷熒光素酶活性。

1.2.7 miR-con或miR-145 mimics瞬時轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞系 將T24和J82細胞接種于24孔板中，待細胞密度長至孔底的60%左右，通過Lipofectamine 2000(脂質(zhì)體2000)轉(zhuǎn)染miR-con或miR-145 mimics至上述兩種膀胱癌T24和J82細胞系中，分別獲得T24/miR-con、T24/miR-145、J82/miR-con、J82/miR-145。

1.2.8 實時定量PCR檢測PAK1的表達 通過實時定量PCR檢測不同實驗組(T24/miR-con、T24/miR-145、J82/miR-con、J82/miR-145)中PAK1的表達情況。利用Trizol(一種新型總RNA抽提試劑)提取不同實驗組細胞的總mRNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，后通過SYBR Premix Ex Taq Ⅱ行PCR檢測PAK1的表達水平。其中PAK1的上游引物為5′-CAGCCCCTCCGATGAGAAATA-3′；下游引物為5′- CAAAACCGACATGAATTGTGTGT-3′；用作內(nèi)參的GAPDH，其上游引物為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′； 下游引物為5′- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進行t檢驗，所得結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。當(dāng)P值小于0.05，評定為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 與PAK1基因3′-UTR有靶向作用的miRNA 通過miRBase和Targetscan軟件預(yù)測, miRNA-145 可與PAK1基因3′-UTR 互補配對(圖1)。

圖1 軟件預(yù)測miRNA-145與PAK1 基因3′-UTR 互補配對

2.2 PAK1基因3′-UTR熒光素酶報告載體的構(gòu)建 通過PCR擴增PAK1 3′-UTR(片段長度為748 bp)，所得產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上跑膠(圖2)。 PCR產(chǎn)物經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、抗藥篩選、雙酶切等一系列過程，將酶切產(chǎn)物進行跑膠(圖3)并送公司測序鑒定，最終獲得所需的重組載體質(zhì)粒(圖4)。

圖2 PAK1 基因3′-UTR PCR擴增產(chǎn)物

2.3 miR-145靶向負調(diào)控PAK1基因的3′-UTR 通過共轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞系T24和J82, 我們檢測了不同實驗組的雙熒光素酶活性。轉(zhuǎn)染pGL3-PAK1 3′-UTR WT質(zhì)粒后，T24/miR-145組的相對熒光素酶活性較T24/miR-con組顯著降低(圖5A)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同樣的結(jié)果見于J82細胞系中(圖5B)。

2.4 實時定量PCR檢測PAK1的表達 實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，瞬轉(zhuǎn)miR-145 mimics的T24和J82細胞系，其PAK1 mRNA的表達水平比瞬轉(zhuǎn)miR-145 control組降低一倍以上(圖6)。

圖3 pGL3-PAK1 3′-UTR WT重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物電泳圖

圖4 pGL3-PAK1 3′-UTR WT質(zhì)粒測序圖譜

圖5 不同實驗組的相對熒光素酶活性

A:為T24細胞系中不同實驗處理組；B:為J82細胞系中不同實驗處理組;Vehicle：空白對照組；miR-con：陰性對照組；miR-145：miR-145 mimics處理組。

圖6 實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-145 mimics后PAK1 mRNA水平

3 討 論

p21-activated kinase-1(PAK1)即p21小GTP酶活化激酶1，是第一個被克隆和驗證的的絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸化激酶家族成員。PAK1作為PAK家族中的一員，其與腫瘤的關(guān)系較為密切，在修復(fù)細胞骨架、延長細胞的壽命以及調(diào)節(jié)部分正常的生理代謝等多個方面都有著重要的作用[5]。盡管PAK1僅在腦、肌肉、脾臟等少數(shù)組織中表達，然而其在多種人類腫瘤細胞內(nèi)均有高表達，且PAK1的表達與乳腺癌、卵巢癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。此外，PAK1還能調(diào)控BAD(Bcl-2家族同源蛋白中的一種，可以促進凋亡)的活性。在大腸癌的研究中，PAKs的兩個亞群均可以促使細胞內(nèi)肌動蛋白的重新形成。比如PAK1可以促進片狀偽足的形成，且還能定位于成纖維細胞的膜皺褶上[6]。研究表明，經(jīng)過免疫組化和多元分析表明，PAK1基因表達統(tǒng)計學(xué)與膀胱移行細胞癌復(fù)發(fā)的危險性具有相關(guān)性[7]。高PAK1蛋白表達的是一個獨立的膀胱移行細胞癌復(fù)發(fā)相關(guān)因素[8]。

在正常情況下, 多種組織中存在miR-145的廣泛表達[9]。2003年MICHEAL等[10]學(xué)者發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸腫瘤中miR-145的表達呈下調(diào)趨勢，認為miR-145可能與結(jié)腸腫瘤的發(fā)生存在密切關(guān)系。CHIYOMARU等[11]學(xué)者后來發(fā)現(xiàn)miR-145位于人類第5號染色體(5q32～33),而SACHDEVA等學(xué)者證實，miR-145對腫瘤細胞生長的抑制作用具有一定的細胞特異性：在具有一定轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細胞中，miR-145對癌細胞生長的抑制作用顯著減弱，但能顯著地抑制此類細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。這些研究均提示miR-145可能在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，但miR-145在膀胱癌中的具體作用和機制尚不清楚。通過雙熒光素酶報告基因檢測得出miR-145可靶向于PAK1的3′非翻譯區(qū)，這有助于我們進一步探究miR-145在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中所扮演的作用，同時這也為膀胱癌的臨床治療用藥提供了一定的理論依據(jù)。

總而言之，本研究通過構(gòu)建PAK1基因3′-UTR熒光素酶報告載體，初步證實了miR-145能夠靶向作用于PAK1的3′-UTR，這為后續(xù)miR-145和PAK1的功能及機制研究打下了夯實的基礎(chǔ)。

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(編輯 王 瑋)

Construction of PAK1 3′-UTR luciferase reporter vector and identification of its activity

LIU Wei, KOU Bo, HE Da-lin, GUO Peng

(Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Health Science center, Xi’an 710061, China)

Objective To construct the luciferase reporter gene vector containing 3′-untranslated region (3′-UTR) of p21-activated kinase-1 (PAK1), which will provide basis for subsequent function and mechanism research on PAK1 and microRNA-145. Methods The 3′-UTR of PAK1 gene was amplified by PCR, and inserted into pGL3 control reporter vector after link and restriction enzyme digestion. It was predicted by bioinformation method that miR-145 could target the 3′-UTR of PAK1. The recombinant plasmid with microRNA mimics or microRNA control were transfected into T24 or J82 cells using Lipofectamine 2000 to detect the relative luciferase activity. In addition, the expression of PAK1 was analysed by real-time PCR. Results The recombinant plasmid was constructed and confirmed by enzyme digestion and sequence reaction. After transfection with the plasmid pGL3-PAK1 3′-UTR WT, we found that compared with T24 or J82 cells treated with miRNA con, the luciferase activity of T24 or J82 cells transfected with miRNA mimics was significantly decreased with statistic significance. Futhermore, the expression of PAK1 in miR-145 mimics group was remarkably lower than that in miR-145 control group. Conclusions The PAK1 3′-UTR luciferase reporter vector was constructed successfully, and the luciferase activity of the recombinant plasmid could be dramatically reduced by miR-145. It indicated that miR-145 could downregulates PAK1 expression by targeting its 3′-UTR.

p21-activated kinase-1; 3′-untranslated region; luciferase reporter gene; microRNA-145; bladder cancer

2014-12-29

2015-03-04

國家自然科學(xué)基金項目(No.81372279)

賀大林，教授.E-mail:hedl@mail.xjtu.edu.cn; 郭鵬，教授.E-mail：guopeng661@mail.xjtu.edu.cn

劉偉(1988-)，男(漢族)，在讀博士研究生.E-mail：lizhang1988617@163.com。 寇博(1984-)，女(漢族)，博士.E-mail：492526094@qq.com.系共同第一作者。

R737.14

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.06.015