溶酶體和泛素-蛋白酶體途徑在前列腺癌中的研究進(jìn)展

鞏艷青，彭 鼎，郭應(yīng)祿

(北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科,北京大學(xué)泌尿外科研究所,國(guó)家泌尿男生殖系腫瘤研究中心，北京 100034)

·綜 述·

溶酶體和泛素-蛋白酶體途徑在前列腺癌中的研究進(jìn)展

鞏艷青，彭 鼎，郭應(yīng)祿

(北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科,北京大學(xué)泌尿外科研究所,國(guó)家泌尿男生殖系腫瘤研究中心，北京 100034)

前列腺癌是男性泌尿生殖系常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)的發(fā)病率雖然遠(yuǎn)低于西方，但隨著人口老齡化、生活水平和診斷技術(shù)的不斷提高，前列腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。泛素-蛋白酶體途徑(UPS)是細(xì)胞生理過(guò)程的一種重要調(diào)節(jié)機(jī)制，在細(xì)胞內(nèi)普遍存在；它與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如腫瘤、病毒感染、神經(jīng)變性疾病、代謝性疾病及炎癥等。本文對(duì)UPS在前列腺癌發(fā)生進(jìn)展中的作用及應(yīng)用進(jìn)行了相關(guān)綜述。

前列腺癌；UPS；治療靶點(diǎn)

溶酶體和泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin proteasome system, UPS)是真核細(xì)胞內(nèi)兩種不同的蛋白酶解系統(tǒng)。溶酶體途徑的主要功能是降解細(xì)胞內(nèi)膜相關(guān)蛋白以及一些由于應(yīng)激狀態(tài)而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，以及從胞外攝取的通過(guò)內(nèi)吞過(guò)程入胞的蛋白質(zhì)。UPS則是高選擇性地降解泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)；這些蛋白質(zhì)的產(chǎn)生可能是在應(yīng)激也可能是在非應(yīng)激條件下；UPS在細(xì)胞中發(fā)揮著重要的功能和作用。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等，均可以通過(guò)泛素化酶從而受到蛋白酶體的監(jiān)測(cè)。UPS甚至可以通過(guò)蛋白降解過(guò)程，調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性。

UPS通過(guò)對(duì)特殊蛋白質(zhì)的降解在真核細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、新陳代謝調(diào)節(jié)、免疫監(jiān)視等生命活動(dòng)中起至關(guān)重要的作用。UPS與疾病的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)，如腫瘤、病毒感染、神經(jīng)變性疾病、代謝性疾病及炎癥等。由于泛素化系統(tǒng)在細(xì)胞活動(dòng)中的重要作用，認(rèn)識(shí)細(xì)胞內(nèi)蛋白泛素化降解作用機(jī)制，對(duì)認(rèn)識(shí)由泛素系統(tǒng)失調(diào)引起的各種疾病尤其是惡性腫瘤具有重要意義。

1 UPS的組成及功能

泛素-蛋白酶體發(fā)揮作用是一個(gè)蛋白質(zhì)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其降解蛋白質(zhì)需要以下幾個(gè)步驟：①靶蛋白被識(shí)別；②泛素分子通過(guò)共價(jià)結(jié)合到蛋白質(zhì)底物上，并形成多泛素鏈；③靶蛋白被26 S蛋白酶體復(fù)合物降解，泛素分子可以被釋放并可參與下一次識(shí)別過(guò)程。通過(guò)這一過(guò)程，在真核細(xì)胞中可以實(shí)現(xiàn)兩方面的作用：一方面降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白；另一方面是非降解作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)不同蛋白的定位和活性。

泛素是真核細(xì)胞中普遍存在且序列高度保守的小分子球形蛋白質(zhì)，其分子質(zhì)量約8.5 ku，由76個(gè)氨基酸殘基組成，能夠共價(jià)結(jié)合細(xì)胞中的受體蛋白，在不同生物細(xì)胞中廣泛存在且保守性較高。蛋白質(zhì)泛素化過(guò)程就是指通過(guò)泛素共價(jià)結(jié)合到靶蛋白上，標(biāo)記靶蛋白，使靶蛋白最終被蛋白酶體降解的過(guò)程。細(xì)胞的多種生理過(guò)程都需要蛋白的泛素化作用參與，如：蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、各種細(xì)胞器的產(chǎn)生、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的調(diào)控、細(xì)胞周期過(guò)程、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、抗原提呈、DNA修復(fù)以及細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等[1]。

蛋白的泛素化需要3種酶，每種酶都有其特異性的作用。包括：泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2)、泛素連接酶(ubiquitin ligase, E3)。泛素化是將蛋白質(zhì)通過(guò)這一途徑降解的第一步，也是一個(gè)蛋白的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，三種酶依次作用，最終將泛素加到目標(biāo)蛋白質(zhì)上。在這個(gè)過(guò)程中，首先，在E1的作用下，通過(guò)消耗ATP，泛素被激活，之后結(jié)合到E2s的半胱氨酸活化位點(diǎn)，使E2s與泛素形成E2s-泛素的中間體；之后E3s可以將泛素與底物靶蛋白相結(jié)合。而泛素分子連接在蛋白質(zhì)上是依靠位于泛素C-末端的甘氨酸殘基與靶蛋白的賴(lài)氨酸殘基的ε氨基基團(tuán)之間形成的異肽鍵。在這個(gè)過(guò)程中，E3s起著關(guān)鍵的作用，人體細(xì)胞中存在著約1 000種不同的E3s，它們能夠特異性地識(shí)別底物蛋白并且將泛素從E2s上轉(zhuǎn)移到底物蛋白上。泛素分子連接到靶蛋白上后，之后的其他泛素分子在E3s的作用下相繼連接到其第48 位賴(lài)氨酸殘基，最終多個(gè)泛素分子形成多聚泛素化鏈。這一多聚泛素化鏈被26S蛋白酶體識(shí)別，可以促進(jìn)靶蛋白的降解。于是，泛素-底物蛋白質(zhì)復(fù)合體形成后，底物蛋白質(zhì)進(jìn)入26S蛋白酶體的催化中心，被20S蛋白酶體降解成多個(gè)短肽(圖1)。通常泛素化的信號(hào)被折疊在正常的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，所以在正常狀態(tài)下不被降解；但是一旦蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化或者受損，如折疊異常和突變蛋白，這些信號(hào)就會(huì)暴露出來(lái)，被泛素系統(tǒng)識(shí)別，激活接下來(lái)的泛素-蛋白酶體降解過(guò)程。與泛素化過(guò)程相對(duì)的，細(xì)胞內(nèi)還有泛素解離酶(DUBs)，其作用就是促進(jìn)蛋白的去泛素化。這兩個(gè)過(guò)程同時(shí)存在，構(gòu)成了一個(gè)相對(duì)的負(fù)向調(diào)節(jié)[2-3]。

正因?yàn)榉核鼗叭シ核鼗诩?xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)水平的重要作用，針對(duì)這一過(guò)程研究通過(guò)調(diào)節(jié)這一過(guò)程而影響蛋白質(zhì)的功能成為蛋白質(zhì)研究的熱點(diǎn)之一。例如，抑癌基因P53就可受到 MDM2的E3連接酶的作用，而被泛素化；同時(shí)，特異性的蛋白酶能使其去泛素化，減少P53的降解，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[4]。前列腺癌中SKP2的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)P27的UPS降解，從而使前列腺癌細(xì)胞不受P27的生長(zhǎng)控制[5]。

圖1 UPS[6]

2 UPS在前列腺癌去勢(shì)抵抗性進(jìn)展中的作用

腫瘤細(xì)胞在雄激素缺乏的環(huán)境中仍保持雄激素受體AR的轉(zhuǎn)錄促使前列腺癌去勢(shì)抵抗性的產(chǎn)生，此時(shí)的雄激素受體如同在正常生理狀態(tài)下一樣，仍進(jìn)行功能性轉(zhuǎn)錄。在剝奪雄激素的情況下，雄激素受體信號(hào)通路仍被激活提高的機(jī)制有：AR基因的擴(kuò)增、AR突變、AR輔助因子平衡的變化、類(lèi)固醇前體的增加、旁路信號(hào)通路的激活或異常等，表觀遺傳修飾的改變、microRNA和腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控同樣參與了去勢(shì)抵抗前列腺癌的進(jìn)展過(guò)程[7-9]。UPS作為其中的一部分，與多種蛋白相互作用，促進(jìn)AR的核轉(zhuǎn)錄，清除共抑制子以促使起始復(fù)合物的形成?；蛟SUPS的功能失活，使得去勢(shì)抵抗前列腺癌細(xì)胞系中AR的蛋白穩(wěn)定性增加，進(jìn)而對(duì)低濃度雄激素產(chǎn)生應(yīng)答[10]。

前列腺癌去勢(shì)抵抗產(chǎn)生的機(jī)制之一是通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，轉(zhuǎn)導(dǎo)生長(zhǎng)信號(hào)，或在無(wú)需配體存在的情況下激活A(yù)R，或者不通過(guò)AR而激活腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。神經(jīng)肽，如內(nèi)皮素、蛙皮素及其它們的膜受體，是這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的啟動(dòng)元素之一，與神經(jīng)-內(nèi)分泌特質(zhì)相關(guān)，同時(shí)與前列腺癌去勢(shì)抵抗性的產(chǎn)生有關(guān)[11-12]。細(xì)胞膜相關(guān)的切割并使細(xì)胞外神經(jīng)肽失活的中性肽鏈內(nèi)切酶(neprilysin，NEP)的缺失，使得內(nèi)皮素1、蛙皮素、胃泌素釋放肽、神經(jīng)肽這些多肽的自分泌和旁分泌增加，結(jié)合各自的受體后啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞的遷移[13]。神經(jīng)肽啟動(dòng)的促生長(zhǎng)信號(hào)包括了PI3K和Akt激酶的激活，進(jìn)而磷酸化I-κB后激活促生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB；磷酸化的I-κB通過(guò)UPS被降解，以使NF-κB進(jìn)核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性[13-14]。NEP和腫瘤抑制子PTEN的直接相互作用在去勢(shì)抵抗前列腺癌中也有所研究；它們之間的相互作用將PTEN帶到細(xì)胞質(zhì)膜附近，抑制靶蛋白Akt激酶[15]。AKT激酶也是蛋白酶體的作用底物，可以磷酸化AR，使得AR在沒(méi)有雄激素結(jié)合的情況下轉(zhuǎn)錄激活。抑癌基因PTEN調(diào)節(jié)許多生理過(guò)程包括生存、增殖、能量代謝、細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞命運(yùn)；通過(guò)其脂磷酸酶活性抑制磷脂酰肌醇三激酶(PI3K)-AKT-mTOR(mammalian target of rapamycin )通路[16]。在前列腺癌中PTEN經(jīng)常缺失，它可以通過(guò)UPS途徑受到E3連接酶介導(dǎo)的蛋白酶體降解的調(diào)控，已報(bào)道的Nedd 4-1, XIAP和WWP2 都可以介導(dǎo)其降解；進(jìn)而使AKT活性增加，凋亡蛋白BAD、procaspase-9等水平下降，P27水平下調(diào)，最終抑制前列腺癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)增殖[17]。CHIP, 是分子伴侶相關(guān)的E3連接酶，也可以導(dǎo)致PTEN降解；過(guò)表達(dá)CHIP可以導(dǎo)致PTEN泛素化增加并使其半衰期縮短[18]。NEP還可以增加去勢(shì)抵抗前列腺癌細(xì)胞PC3中PKC的同工型PKCδ，它可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并增加細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性；PKCδ是各種刺激誘導(dǎo)磷酸化后的泛素化靶點(diǎn)，進(jìn)而被蛋白酶體降解[29]；研究已發(fā)現(xiàn)PC3細(xì)胞中的PKCδ蛋白的穩(wěn)定性降低，可能是因?yàn)镻C3細(xì)胞中蛋白酶體的活性，與LNCaP細(xì)胞相比有所增加[20]。因此，神經(jīng)肽啟動(dòng)的信號(hào)通路促進(jìn)了去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，不管其是AR依賴(lài)還是非依賴(lài)的。其他起始于受體的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如EGFR和IGF-1R，其最終也是激活PI3K/Akt，以一種病理生理過(guò)程類(lèi)似于神經(jīng)肽的方式促進(jìn)去勢(shì)抵抗前列腺癌的生長(zhǎng)；這些級(jí)聯(lián)信號(hào)通路中的多種成分蛋白是蛋白酶體降解的底物。UPS還調(diào)控了Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活轉(zhuǎn)錄因子β-catenin的Wnt-1信號(hào)通路，在胚胎發(fā)育過(guò)程中具有非常重要的作用，同時(shí)在許多腫瘤病變中表達(dá)下調(diào)[21]。

產(chǎn)生去勢(shì)抵抗的另外一種機(jī)制是脅迫反應(yīng)的激活。在雄激素受到抑制的環(huán)境下，這種反應(yīng)將上調(diào)伴侶分子，如hsp27和分泌型 clusterin，以保護(hù)腫瘤細(xì)胞避免凋亡[22-23]。這種抗凋亡產(chǎn)生的機(jī)制包括I-κB被蛋白酶體降解的促進(jìn)，從而激活促生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB；還有變性蛋白的再折疊和逃脫蛋白酶體的破壞[24-25]?？傊贏R的轉(zhuǎn)錄仍舊對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活很重要的情況下和其他轉(zhuǎn)錄途徑激活并發(fā)揮功能的情況下，UPS在前列腺癌向去勢(shì)抵抗性轉(zhuǎn)變過(guò)程中具有非常重要的作用。

3 UPS在前列腺癌治療中的應(yīng)用及前景

目前針對(duì)局限性前列腺癌的治療(如雄激素剝奪、根治性切除術(shù)、放療、近距離放療等)對(duì)晚期前列腺癌效果有限，而轉(zhuǎn)移性激素抵抗的前列腺癌目前仍難治愈。UPS在細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡和前列腺癌的進(jìn)展相關(guān)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，UPS的抑制在前列腺中具有抗腫瘤效用，并成為前列腺癌治療的靶標(biāo)[26]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，惡性增殖細(xì)胞對(duì)蛋白酶體阻斷的敏感性比非腫瘤細(xì)胞更為強(qiáng)烈，如乳胞素(lactacystin)對(duì)正常的淋巴細(xì)胞無(wú)明顯的作用[27]。研究結(jié)果顯示，蛋白酶體抑制劑通過(guò)影響NF-κB、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及Bcl-2蛋白，上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子，下調(diào)抗凋亡分子和粘附分子來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)抗化療藥物而啟動(dòng)的抗凋亡作用。

第一個(gè)臨床應(yīng)用的蛋白酶體抑制劑是硼替佐米(Bortezomib)，也是體外研究最為廣泛的蛋白酶體抑制劑。硼替佐米能直接抑制蛋白酶體糜蛋白酶樣酶的活性，穩(wěn)定各種重要的細(xì)胞凋亡蛋白，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡通路[28]。硼替佐米可以降低前列腺癌細(xì)胞中的E3泛素連接酶 WWP1、Smurf1、Smurf2的表達(dá)[29]。硼替佐米處理前列腺癌細(xì)胞系和原發(fā)性前列腺上皮細(xì)胞后，caspase 8 P18的半衰期由底線22 min延長(zhǎng)至2 h，活性caspase 8的穩(wěn)定增加了細(xì)胞對(duì)死亡受體介導(dǎo)的凋亡誘導(dǎo)的敏感性[30]。硼替佐米處理前列腺癌腫瘤細(xì)胞LNCaP時(shí)，通過(guò)穩(wěn)定死亡受體DR5的mRNA，而使其表達(dá)上調(diào)[31]。裸鼠前列腺癌細(xì)胞PC3-M異種移植模型中發(fā)現(xiàn)，與未接受處理的腫瘤相比，接受硼替佐米處理的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低，凋亡增加[32]。目前，體外和臨床前體內(nèi)的研究結(jié)果均證實(shí)了蛋白酶體抑制對(duì)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；以Bortezomib為代表的蛋白酶體抑制劑，在臨床腫瘤治療中顯示出良好的療效，但也可誘導(dǎo)熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)的表達(dá)?；罨腍SP能在細(xì)胞受強(qiáng)烈刺激時(shí)提供保護(hù)，因此會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥性。因此，為了減弱腫瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑的耐藥性，可以適當(dāng)聯(lián)合使用HSP抑制劑[33]。此外，蛋白酶體抑制劑結(jié)合目前的激素療法(如雌激素)或許是研究方向之一。蛋白酶體在雌激素誘導(dǎo)的AR下調(diào)過(guò)程中發(fā)揮作用，可能促進(jìn)AR非依賴(lài)性的產(chǎn)生，而它的逆轉(zhuǎn)也或許能使前列腺癌重新成為雄激素依賴(lài)的狀態(tài)。UPS在前列腺癌治療中的另一種應(yīng)用方式，是促進(jìn)腫瘤相關(guān)蛋白通過(guò)UPS途徑介導(dǎo)的降解[34]。TANG[35]等利用雙氫睪酮-蛋白靶向降解嵌合分子(DHT-PROTAC)通過(guò)UPS降解前列腺癌LNCaP細(xì)胞表達(dá)的雄激素受體，并抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。

在去勢(shì)抵抗性前列腺癌中，泛素連接酶Siah2高表達(dá)，并在NCRO1-雄激素受體復(fù)合物標(biāo)上降解的標(biāo)記，從而除去對(duì)雄激素的制約，允許沒(méi)有活性的雄激素受體進(jìn)入活性狀態(tài)；由此前列腺癌產(chǎn)生更多的有活性的雄激素受體，并使它們對(duì)激素療法產(chǎn)生抵抗性[36]?；谶@種新的信息，將Siah2作為一種生物標(biāo)志物，以便用于追蹤前列腺癌患者對(duì)治療的反應(yīng)；抑制Siah2與雄激素受體復(fù)合物之間的相互作用也將可能提供一種新的方法來(lái)再次使去勢(shì)抵抗性前列腺癌恢復(fù)對(duì)激素療法的敏感性。

此外，越來(lái)越多的自然產(chǎn)物也被發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)UPS，對(duì)前列腺癌具有治療作用。在前列腺癌細(xì)胞中，姜黃素(Curcumin)可以降低MDM2(P53的主要的泛素E3連接酶)蛋白，增加抑癌基因P21的表達(dá)，促進(jìn)原癌基因cyclin E的降解，促進(jìn)凋亡，抑制增殖[37-38]。白樺脂酸(Betulinic Acid)能抑制多種去泛素化酶(DUBs)從而導(dǎo)致多聚泛素化，促進(jìn)癌蛋白的降解，細(xì)胞凋亡增加，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響；同時(shí)還抑制原發(fā)腫瘤及血管形成[39]。一些金屬衍生物也被發(fā)現(xiàn)可抑制前列腺癌中UPS活性。二氫吲哚二酮(2, 3-indolinedione)的幾個(gè)金屬衍生物可以抑制UPS活性，尤其是26S蛋白酶體的糜蛋白酶樣酶活性，導(dǎo)致Bax的累積，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[40]。

綜上所述，UPS在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，而且有可能作為一種新的治療靶點(diǎn)。在研究應(yīng)用蛋白酶體抑制劑的同時(shí)，泛素活化酶、結(jié)合酶、連接酶和去泛素化酶也將成為將來(lái)潛在的治療靶點(diǎn)，為前列腺癌及其他腫瘤的治療提供新的策略！

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(編輯 何宏靈)

2015-01-19

2015-03-31

國(guó)家自然科學(xué)基金資助(No.81402083)

郭應(yīng)祿，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師.E-mail: gyl07@sina.com.

鞏艷青(1981-)，女(漢族)，博士，助理研究員.研究方向：泌尿系腫瘤.E-mail: yqgong@bjmu.edu.cn

R737

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.06.021