雄激素受體基因CAG多態(tài)性對前列腺癌惡性程度的影響

梁國慶, 顧燕青, 沈 薇, 陳偉杰, 江寧東, 陳春雷, 沙建軍

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院泌尿外科,上海 200071；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院泌尿外科,上海 202150；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科, 4.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科,上海 200127)

·基礎(chǔ)研究·

雄激素受體基因CAG多態(tài)性對前列腺癌惡性程度的影響

梁國慶1, 顧燕青2, 沈 薇3, 陳偉杰1, 江寧東1, 陳春雷1, 沙建軍4

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院泌尿外科,上海 200071；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院泌尿外科,上海 202150；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科, 4.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科,上海 200127)

目的 檢測正常人群、前列腺癌(PCa)低危和高危組雄激素受體(AR)基因(CAG)n微衛(wèi)星多態(tài)性，探討該重復(fù)序列長度對PCa惡性程度的影響。方法 應(yīng)用PCR和雙鏈循環(huán)DNA測序技術(shù)，對98例正常人群(對照組)和95例經(jīng)前列腺穿刺活檢證實(shí)為PCa的患者，進(jìn)行外周血標(biāo)本(CAG)n串聯(lián)重復(fù)序列檢測，分析該微衛(wèi)星多態(tài)性與PCa惡性程度的影響。 結(jié)果 PCa組CAG重復(fù)序列為15～31，平均(23.21±3.07)；參照組重復(fù)序列為14～34，平均(24.20±3.50)，兩者比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)PCa患者腫瘤Gleason評分進(jìn)行分級，≤7分為低危，共68例，≥8分為高危，27例。低危組的CAG重復(fù)序列為18～31，平均(23.65±2.92)，高危組CAG重復(fù)序列為15～27，平均(22.11±3.21)，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，高危組與參照組比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 結(jié)論 受試者AR基因(CAG)n重復(fù)序列呈現(xiàn)多態(tài)性，該重復(fù)序列長度與PCa的發(fā)生有關(guān)，較短的CAG重復(fù)序列預(yù)示發(fā)生PCa的可能性較大，惡性程度更高。

基因；多態(tài)性；CAG重復(fù)序列；雄激素受體；前列腺癌；惡性程度

前列腺癌( prostate cancer, PCa)是老年男性的常見惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，目前認(rèn)為，遺傳因素是其最重要病因之一?；蚪M學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，57%的PCa發(fā)病病因取決于其基因方面的因素[1]。雄激素受體(androgen receptor, AR)基因的過表達(dá)可以引起PCa的發(fā)生和發(fā)展[2]。本研究采用PCR和雙鏈循環(huán)DNA測序方法進(jìn)行外周血標(biāo)本AR基因CAG 串聯(lián)重復(fù)序列(CAG short tandem repeat, CAG-STR)檢測，探討CAG重復(fù)序列長度與PCa惡性程度的相關(guān)性，為基因水平篩選PCa易感人群尋找理想的分子標(biāo)志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象 95例PCa患者和98例正常男性(參照組)血樣標(biāo)本均來自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院和上海市中醫(yī)醫(yī)院泌尿外科。PCa患者均經(jīng)前列腺穿刺活檢病理證實(shí)，年齡47～86歲，中位年齡64歲，按照PCa腫瘤的Gleason評分進(jìn)行分級，8～10分為高危組計27例，≤7分為低危組68例。對照組人群年齡51～65歲，中位年齡58歲。

1.2 基因組DNA 提取及引物設(shè)計與合成 靜脈采血10 mL注入含EDTA的試管內(nèi)，運(yùn)用廈門百維信生物科技有限公司提供的試劑盒提取DNA。PCR方法擴(kuò)增AR基因外顯子1 NH2端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)350 bp片段，引物設(shè)計采用Primer 5.0軟件完成，由英濰捷基上海貿(mào)易有限公司合成，上游引物序列： 5′-CAGTTAGGGCTGGGAAGGGTC-3′，下游引物序列：5′-TGCGGCTGTGAAGGTTGCT-3′。

1.3 PCR反應(yīng) 總體積為 25 μL，內(nèi)含2×PCR緩沖液，終濃度為200 μmol/L的dNTP，終濃度為2 mmol/L 的MgCl2，引物終濃度為0.5 μmol/L，模板DNA約200 ng，TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)1.25 U。擴(kuò)增條件: 95 ℃預(yù)變性，2 min后進(jìn)入循環(huán)(96 ℃變性30 s，65 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次)，72 ℃再延伸4 min。

1.4 目的片段測序 PCR產(chǎn)物用10 μL載樣緩沖液，混勻，加于8 g/L瓊脂糖凝膠(含溴乙錠)中電泳后，紫外燈下切取特異性的PCR條帶。擴(kuò)增片段送北京六合華大基因公司上海測序部檢測(CAG)n雙鏈DNA循環(huán)序列。

2 結(jié) 果

2.1 AR基因CAG重復(fù)序列長度 由圖1 顯示，三組對象共193例CAG重復(fù)次數(shù)介于14～34，平均23.72±3.32，中位數(shù)為23.0，與文獻(xiàn)報道一致[3]。

2.2 CAG重復(fù)序列長度與PCa惡性程度的相關(guān)關(guān)系 三組CAG 重復(fù)序列長度比較(表1)，分別為對照組(98例，24.20±3.50)，PCa組(95例，23.21±3.07)；其中低危組(68例，23.65±2.92)，高危組(27例，22.11±3.21)，對照組長度高于PCa組(P<0.05)，PCa高危組長度顯著低于對照組(P<0.01)，PCa高危組長度則低于PCa低危組(P<0.05)，但對照組與PCa低危組比較，差異變化沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。

圖1 AR 基因CAG 重復(fù)序列長度分布條狀圖

表1 三組間CAG 重復(fù)序列長度比較

與對照組比較,*P>0.05；與低危組比較,#P <0.05；與高危組比較,ΔP<0.01。

3 討 論

AR是雄激素的主要分子靶標(biāo)，通過與雄激素結(jié)合并作用于相應(yīng)的靶組織和器官而發(fā)揮效應(yīng)，所以AR是介導(dǎo)雄激素作用的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)。AR是類固醇激素受體家族的一員，其編碼基因位于X 染色體的q11～12區(qū)，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成。AR的一級結(jié)構(gòu)分為三個不同功能區(qū)：①具有轉(zhuǎn)錄激活功能的N-端區(qū)(N-terminal domain, NTD)；②與靶基因上雄激素反應(yīng)元件(androgen response element, ARE)特異性結(jié)合的DNA結(jié)合區(qū)(DNA binding domain, DBD)；③C端的配體結(jié)合區(qū)(ligand binding domain，LBD)。AR的轉(zhuǎn)錄活性細(xì)微調(diào)節(jié)由其第一外顯子1 NH2重復(fù)序列(CAG)n編碼，即CAG重復(fù)次數(shù)(n值)與AR的轉(zhuǎn)錄活性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，n值越小，AR的轉(zhuǎn)錄活性越強(qiáng)大[3]。AR基因(CAG)n編碼谷氨酰胺重復(fù)序列數(shù)量在16～29時，方能維持AR分子結(jié)構(gòu)以及AR與協(xié)同因子間的正常作用，但伴隨著重復(fù)序列的增加，AR與其協(xié)同因子的作用將受到抑制，導(dǎo)致AR信號傳導(dǎo)通路出現(xiàn)異常[4]。

前列腺是雄激素依賴性器官，AR存在于成人前列腺間質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，AR信號系統(tǒng)對前列腺的生長、發(fā)育以及維持其功能起著至關(guān)重要的作用[5]。AR通過直接與DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，在男性生殖器官的形成、第二性征發(fā)育、蛋白質(zhì)合成代謝、骨骼和肌肉發(fā)育等方面發(fā)揮著重要功能[6-7]。研究顯示，PCa與AR的表達(dá)改變存在著某些關(guān)聯(lián)，AR的過量表達(dá)將促進(jìn)前列腺上皮細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致PCa的發(fā)生[8]。盡管目前對于PCa組織中AR表達(dá)情況的研究結(jié)果并不統(tǒng)一，但AR在PCa疾病的激素依賴向激素非依賴性的轉(zhuǎn)化過程中存在著重要作用卻是具有共識的[9]。在PCa發(fā)生的早期階段，AR的表達(dá)較BPH組織顯著增加，但伴隨腫瘤臨床分期的增高，AR的表達(dá)卻呈遞減趨勢，甚至低于BPH組織中[10]。

有研究證實(shí)，AR基因(CAG)n多態(tài)序列長度與冠心病[11]、婦女乳腺癌[12]和中老年男性遲發(fā)性性腺功能減退癥[13]等多種疾病的發(fā)生有關(guān)。TONG等[14]研究了中國漢族PCOS婦女時發(fā)現(xiàn)，PCOS人群(CAG)n重復(fù)序列長度明顯短于正常人群，提示較短CAG者AR的表達(dá)量增加，組織對雄激素敏感性增強(qiáng)，較長CAG重復(fù)序列者AR表達(dá)量減少，雄激素敏感性下降。最新研究發(fā)現(xiàn)，短的(CAG)n(n≤24)重復(fù)序列與印度男性PCa和BPH疾病的發(fā)生有關(guān)[15]。

本研究結(jié)果顯示，受試者(CAG)n重復(fù)數(shù)分布呈現(xiàn)多態(tài)性，分布范圍為14～34。PCa組的CAG-STR重復(fù)次數(shù)(n值)低于參照組(P<0.05)，PCa高危組的長度亦低于PCa低危組(P<0.05)，而參照組的CAG重復(fù)長度則顯著高于PCa高危組(P<0.01)，PCa低危組長度略低于參照組，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此研究提示較短的CAG重復(fù)序列可能使前列腺上皮細(xì)胞更容易受到損傷，從而增加了PCa疾病的易患性。CAG-STR重復(fù)次數(shù)的減少將降低AR基因的轉(zhuǎn)錄活性，使雄激素的作用不能很好發(fā)揮。由此可以推斷，AR基因的CAG重復(fù)序列長度可能是PCa發(fā)病的危險因素，CAG重復(fù)序列越短，則發(fā)生PCa疾病的可能性越大，PCa的惡性程度更高。

關(guān)于基因多態(tài)性與PCa易患性的研究，各研究者的結(jié)論仍存在著諸多爭議，可能源于受試者人種的差異、生物學(xué)差異及實(shí)驗(yàn)者的實(shí)驗(yàn)技術(shù)、統(tǒng)計方面局限性等因素的影響。需要進(jìn)一步統(tǒng)計全面的大樣本、多中心研究，以期明確基因多態(tài)性與PCa易患性之間更直觀全面的關(guān)聯(lián)。

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(編輯 何宏靈)

Effect of androgen receptor gene (CAG)npolymorphism repeats on the severity of prostate cancer

LIANG Guo-qing1, GU Yan-qing2, SHEN Wei3, CHEN Wei-jie1, JIANG Ning-dong1, CHEN Chun-lei1, SHA Jian-jun4

(1.Department of Urology, Shanghai Municipal Hospital of TCM Affiliated to Shanghai Traditional Chinese Medical University, Shanghai 200071; 2.Department of Urology, Chongming Branch of Xinhua Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 202150;3.Department of Laboratory Medicine; 4.Department of Urology, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200127, China)

Objective To screen the (CAG)npolymorphism of androgen receptor (AR) gene in healthy men, patients with mild prostate cancer (PCa) and severe PCa, and to explore the relationship between the polymorphism with PCa severity.Methods A total of 98 healthy men (control group) and 95 PCa patients were enrolled. The length of AR gene CAG short tandem repeat (CAG-STR) sequences were detected by PCR and dsDNA cycle sequencing, and the effect of (CAG)npolymorphism on PCa severity was analyzed. Results The number of CAG repeats for the PCa group and the control group were 15～31 (23.21±3.07) and 14～34 (24.20±3.50) respectively, with statistically significant difference between them (P< 0.05). According to PCa Gleason level, 68 cases were mild PCa (≤7) and 27 cases were severe PCa (≥8). The number of CAG repeats for the mild and severe PCa groups were 18～31(23.65±2.92) and 15～27(22.11±3.21), respectively, with a significant difference. The number of CAG repeats in the severe PCa group was fewer than that in the control group (P< 0.01). Conclusions The length of AR gene CAG repeat sequences present polymorphism in the subjects and may be one of the risk factors for PCa. Shorter CAG repeat sequences suggest severer PCa.

genes; polymorphism; (CAG)nsequence repeat; androgen receptor; prostate cancer; severity degree

2014-11-10

2015-01-14

上海市衛(wèi)生局課題(No.20134392)

沙建軍，主治醫(yī)師. E-mail: shajianjunrj@126.com

梁國慶(1977- )，男(漢族)，碩士學(xué)位，主治醫(yī)師，從事泌尿外科和男科學(xué)專業(yè)工作.E-mail: applessw@163.com 顧燕青(1977-)，男(漢族)，學(xué)士學(xué)位，主治醫(yī)師，從事泌尿外科專業(yè).E-mail: gyqsnake1996@126.com, 系共同第一作者.

R737.25

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.06.016