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    偽狂犬病病毒gB基因的原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立

    2015-06-18 11:28:00吉藝寬張寶石向柯宇琚春梅
    動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2015年6期
    關(guān)鍵詞:表位狂犬病抗原

    王 雨,吉藝寬,程 藝,張寶石,向柯宇,琚春梅

    (華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

    偽狂犬?。≒seudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)引起的動物以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要特征的傳染病,豬為其儲存宿主,并可引起豬的潛伏感染。本病在世界范圍內(nèi)廣泛流行,給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。我國從20世紀(jì)90年代開始在規(guī)?;i場廣泛使用PRV基因缺失疫苗,很好地控制了該病造成的危害,但自2011年以來,該病又有暴發(fā)流行趨勢,因此加強(qiáng)該病的防控對我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要。

    PRV基因組為線狀雙鏈DNA,大小約為180 kb,G+C含量高達(dá)74%,可以編碼70種蛋白,其中糖蛋白有g(shù)B、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM、gN 11種[3]。gB作為病毒的一個重要囊膜組分和中和抗原,對于病毒的感染起到重要作用,并參與病毒特異性體液免疫和細(xì)胞免疫[4]。gB基因?qū)儆诎捳畈《局斜J氐奶堑鞍谆?,編碼913個氨基酸,gB蛋白分別在59-126aa、214-289aa、507-734aa處存在優(yōu)勢抗原表位,其中59-126aa之間有3個連續(xù)的抗原表位,在214-279aa之間有一個連續(xù)的抗原表位,在540-734aa區(qū)間有8個潛在的非連續(xù)抗原表位[4]。根據(jù)gB基因的以上特點,本研究針對其中的優(yōu)勢抗原表位,應(yīng)用PCR擴(kuò)增gB基因的主要抗原表位區(qū),構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒,并在大腸埃希菌中進(jìn)行表達(dá),利用表達(dá)蛋白作為抗原建立gB768-ELISA診斷方法,為偽狂犬病疫苗免疫效果的評估提供技術(shù)方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 病毒及菌株 偽狂犬病病毒,大腸埃希菌TOP10及BL21(DE3),表達(dá)載體pET-32a(+)均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室保存。

    1.1.2 工具酶和試劑 LATaq酶、限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ、HindⅢ)、T4DNA 連接酶、DNA Marker、IPTG、瓊脂糖均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;蛋白質(zhì)Marker為Fermentas公司產(chǎn)品;DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒為Omega公司產(chǎn)品;HisTrapFF crude預(yù)裝柱為GE公司產(chǎn)品;羊抗豬IgG-HRP為廣州健陽生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;偽狂犬病毒陽性血清、陰性血清及口蹄疫病毒(FMDV)、豬瘟病毒(CSFV)、日本腦炎病毒(JEV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陽性血清由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室保存;128份臨床血清樣本為豬場送檢;PRV gB抗體檢測試劑盒為美國IDEXX公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 gB768的PCR擴(kuò)增 參考GenBank登錄的偽狂犬病毒gB序列(序列號A 68929),設(shè)計一對引物擴(kuò)增gB基因主要抗原表位區(qū)。引物如下:gB-F:5′-CGCGGATCCGCGCTGCTGCTGCTGGC-3′(下劃 線 部 分 為BamH Ⅰ 酶 切 位 點 ),gB-R:5′-CCCAAGCTTGGCGAAGGAGTCGTAGGGGTA-3′(下劃線部分為HindⅢ酶切位點),利用PCR擴(kuò)增包含59-289aa優(yōu)勢抗原表位區(qū)基因序列,大小為768bp,命名為gB768。

    PCR反應(yīng)參數(shù):95℃5min;95 ℃35s,53℃45s,72℃1min,30個循環(huán);72℃10min。該PCR反應(yīng)以抽提的豬偽狂犬病毒的DNA作為模板擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測并回收。

    1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物,連接經(jīng)同樣雙酶切處理的pET-32a(+),轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒并對其應(yīng)用酶切和PCR兩種方法鑒定,對鑒定正確的重組質(zhì)粒由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因序列測定,測定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-gB768。

    1.2.3 重組蛋白的表達(dá)、純化及 Western blot鑒定陽性重組質(zhì)粒pET-gB768轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)。最佳誘導(dǎo)條件下表達(dá)目的蛋白,經(jīng) His-TrapFF crude預(yù)裝柱純化后,采用SDS-PAGE電泳和 Western blot進(jìn)行檢測[5]。

    1.2.4 間接gB-ELISA檢測方法的建立

    1.2.4.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 方陣滴定法確定重組蛋白gB的最佳包被濃度及血清的最佳稀釋度,并對封閉液的選擇及其作用時間,二抗稀釋度及其作用時間,TMB顯色時間分別進(jìn)行優(yōu)化。

    1.2.4.2 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 取30份PRV陰性豬血清樣本,用建立的間接gB768-ELISA方法檢測,以30份血清的平均OD 450nm值+3×SD作為判定陰陽性的臨界值。

    1.2.4.3 特異性試驗 用建立的間接gB768-ELISA方法檢測PRRSV、CSFV、JEV、PCV-2、FMDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。同時設(shè)豬偽狂犬病毒陽性血清、陰性血清對照,判定血清交叉反應(yīng)情況。

    1.2.4.4 敏感性試驗 將PRV陽性血清作平行倍比稀釋,用建立的間接gB768-ELISA方法檢測血清中抗體的含量并判定其抗體檢出效價。

    1.2.4.5 重復(fù)性試驗 取5份抗體水平不同的血清,用8塊不同批次包被的酶標(biāo)板按優(yōu)化的ELISA操作程序進(jìn)行試驗,通過OD 450nm值計算變異系數(shù)確定方法的批間重復(fù)性。另取5份抗體水平不同的血清,在包被的同一批次酶標(biāo)板中按優(yōu)化ELISA操作程序進(jìn)行試驗,樣品每份重復(fù)8個孔,通過OD 450nm值計算變異系數(shù)確定方法的批內(nèi)重復(fù)性。

    1.2.4.6 臨床樣品檢測 使用間接gB768-ELISA方法對不同豬場送檢的128份豬血清樣本進(jìn)行檢測,并與商品化ELISA試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析。

    2 結(jié)果

    2.1 PCR擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

    經(jīng)PCR擴(kuò)增出大小約為768bp的目的條帶(圖1)。重組質(zhì)粒pET-gB768經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后,可得到約768bp和約5 800bp兩個片段,與預(yù)期結(jié)果相符(圖2),基因序列測定結(jié)果與參考的序列一致。

    圖1 PRV gB768PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of gB768of PRV by PCR

    圖2 重組質(zhì)粒pET-gB768的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-gB768 by enzyme digestion

    2.2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳及 Western blot分析

    重組質(zhì)粒pET-gB768轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3),經(jīng)誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,表達(dá)蛋白大小約為47ku。通過HisTrapFF crude預(yù)裝柱親和層析對重組蛋白進(jìn)行純化,Western blot結(jié)果表明目的蛋白可與PRV陽性血清反應(yīng)(圖3和圖4),具有良好的反應(yīng)原性。

    圖3 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 Identification of the recombinant protein by SDS-PAGE

    2.3 間接gB768-ELISA最佳反應(yīng)條件的確定

    經(jīng)過方陣滴定確定重組抗原最佳包被濃度為2 μg/mL,陰、陽性血清的最佳稀釋度為1∶320,作用時間為37℃50min;最佳封閉液為10mL/L的BSA,封閉時間為37℃2h;二抗的最佳稀釋度為1∶5 000,作用時間為37℃1h;底物最佳顯色時間為室溫15min。

    2.4 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

    用建立的間接gB768-ELISA檢測30份陰性血清,計算出平均OD450nm=0.111,標(biāo)準(zhǔn)差SD=0.034,從而計算出陰陽臨界值為0.213,因此,若樣本OD450nm 值≥0.213,判定為陽性;若樣本OD450nm值<0.213,判定為陰性。

    圖4 重組蛋白的Western blot分析Fig.4 Identification of the recombinant protein by Western blot

    2.5 特異性試驗

    用建立的間接gB768-ELISA方法檢測PRV、FMDV、PRRSV、JEV、CSFV、PCV-2標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,結(jié)果顯示除豬偽狂犬病病毒陽性血清為陽性外,其余血清的OD450nm均低于0.213,判定為陰性,表明本試驗建立的gB768-ELISA方法對PRV有良好的特異性(表1)。

    2.6 敏感性試驗

    用建立的間接gB768-ELISA方法檢測PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,血清稀釋1∶6 400時,檢測結(jié)果仍為陽性(OD 450nm=0.307)(表2),表明建立的方法敏感性良好。

    表1 間接gB768-ELISA方法特異性試驗Table 1 The specificity test of indirect gB768-ELISA

    表2 間接gB768-ELISA方法敏感性試驗Table 2 The sensitivity test of indirect gB768-ELISA

    2.7 重復(fù)性試驗

    利用建立的間接gB768-ELISA方法對5份血清進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗,結(jié)果(表3)顯示變異系數(shù)小于10%,用8塊不同批次的酶標(biāo)板對5份血清進(jìn)行批間重復(fù)性試驗,結(jié)果(表4)顯示變異系數(shù)小于10%,表明所建立的gB768-ELISA檢測方法具有較好的重復(fù)性。

    表3 間接gB768-ELISA方法批內(nèi)重復(fù)性試驗Table 3 The intra repeatability test of indirect gB768-ELISA

    表4 間接gB768-ELISA檢測方法批間重復(fù)性試驗Table 4 The inter repeatability test of indirect gB768-ELISA

    2.8 臨床樣品檢測

    利用建立的間接gB768-ELISA方法檢測不同豬場送檢的128份豬血清樣本,并與商品化ELISA試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行比較(表5)。從表5中可以看出,用IDEXX ELISA試劑盒檢測為陽性的114份血清中,間接gB768-ELISA檢出106份陽性,陽性符合率為93.0%(106/114);IDEXX ELISA 試劑盒檢測為陰性的14份血清中,間接gB768-ELISA檢14份陰性,陰性符合率為100%;間接gB768-ELISA檢測方法與IDEXX ELISA試劑盒的總符合率為93.8%((106+14)/128)。

    表5 臨床樣品檢測結(jié)果Table 5 The detection result of clinical samples by gB768-ELISA and IDEXX ELISA Kit

    3 討論

    20世紀(jì)90年代起,PRV基因缺失疫苗在全國得到推廣使用,使偽狂犬病總體上得到了控制[6-7],但自2011年以來我國多省報道新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和死亡的現(xiàn)象,經(jīng)PCR檢測均為偽狂犬病病毒野毒的感染[8-9]。對分離病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行分析,結(jié)果表明新分離毒株與以前分離株的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)并且毒力更強(qiáng),現(xiàn)階段使用的Bartha-K61弱毒疫苗免疫豬后產(chǎn)生的中和抗體對新分離毒株的中和能力較差[9-12],表明新分離株可能存在一定抗原變異。

    gB糖蛋白是PRV的主要囊膜糖蛋白,在PRV病毒的感染中必不可少,同時它還在膜融合中起重要作用,介導(dǎo)病毒穿入過程中囊膜與細(xì)胞膜的融合,以及介導(dǎo)感染細(xì)胞與非感染細(xì)胞之間細(xì)胞膜的融合[13-14]。此外在PRV感染中,gB也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要糖蛋白之一,不僅可以刺激機(jī)體產(chǎn)生補(bǔ)體依賴性和補(bǔ)體非依賴性中和抗體,也可以刺激淋巴細(xì)胞增殖及參與LAK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。Xuan x等[15]研究表明,經(jīng)gB蛋白免疫的小鼠能夠抵抗PRV的致死性攻擊。

    PRV gB蛋白的主要抗原表位存在于59-129aa、214-289aa、507-734aa處。包新奇等[16]通過對三段抗原表位區(qū)分段表達(dá)并與PRV陽性血清反應(yīng)發(fā)現(xiàn),在214-289aa、507-734aa處有較好的抗原性。本試驗應(yīng)用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)了gB基因主要抗原表位區(qū)59-289aa及507-734aa,通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)59-289aa抗原表位區(qū)與PRV陽性血清的反應(yīng)原性比507-734aa更好。因此本試驗選擇59-289aa抗原表位區(qū)作為診斷抗原建立間接ELISA診斷方法。

    本研究建立的gB768-ELISA檢測方法具有良好的特異性、敏感性及可重復(fù)性,且與IDEXX gBELISA試劑盒符合率可達(dá)到93.8%,應(yīng)用前景良好。通過gB768-ELISA方法可以對偽狂犬病疫苗的免疫效果進(jìn)行評估,以便豬場制定正確的免疫程序,增加對新一輪偽狂犬病暴發(fā)的抵抗力。目前,在PRV凈化時豬場普遍采用gE-ELISA試劑盒區(qū)分疫苗免疫豬和野毒感染豬,但gE抗體陰性豬可能為疫苗免疫合格豬,也可能為免疫失敗豬,必須同時檢測PRV gB抗體才能進(jìn)一步判定疫苗免疫是否合格。因此,通過PRV gE與gB抗體檢測試劑盒聯(lián)合使用更有利于豬場PRV的凈化。

    [1]Fonseca A J,Camargos M F,de Oliveira A M,et al.Molecular epidemiology of Brazilian pseudorabies viral isolates[J].Vet Microbiol,2010,141(3-4):238-245.

    [2]Muller T,Klupp B G,F(xiàn)reuling C,et al.Characterization of pseudorabies virus of wild boar origin from Europe[J].Epidemiol Infect,2010,138(11):1590-1600.

    [3]Dory D,Torche A M,Beven V,et al.Effective protection of pigs against lethal pseudorabies virus infection after a single injection of low-dose Sindbis-derived plasmids encoding PrV gB,gC and gD glycoproteins[J].Vaccine,2005,23(26):3483-3491.

    [4]Zaripov M M,Morenkov O S,Shmatchenko V V,et al.Immunological and functional characteristics of epitopes and regions of gB glycoprotein of Aujeszky's disease virus[J].Vopr Virusol,2001,46(2):41-45.

    [5]周慧英,程 藝,孫磊磊,等.偽狂犬病病毒EP0基因的克隆及原核表達(dá)[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,34(4):4-8.

    [6]Klupp B G,Lomniczi B,Visser N,et al.Mutations affecting the UL21gene contribute to avirulence of pseudorabies virus vaccine strain Bartha[J].Virology,1995,212(2):466-473.

    [7]王全杰,張智明,戴秀莉,等.豬偽狂犬病疫苗的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2013(15):40-42.

    [8]楊慶芳,寧官保,李俊達(dá).豬偽狂犬病病毒的分離鑒定[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(8):886-889.

    [9]彭金美,安同慶,趙鴻遠(yuǎn),等.豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2013,35(1):1-4.

    [10]童 武,張青占,鄭 浩,等.免疫后發(fā)病仔豬中偽狂犬病毒的分離和鑒定[J].中國動物傳染病學(xué)報,2013,21(3):1-7.

    [11]劉洪斌,張智明,丁國杰,等.豬偽狂犬病毒DQ株的分離鑒定與生物學(xué)特性研究[J].中國獸藥雜志,2013,47(9):14-17.

    [12]韓 偉,張 莉,鄢明華,等.偽狂犬病病毒TJ-1株生物學(xué)特性研究[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,33(1):37-40.

    [13]Peeters B,de Wind N,Hooisma M,et al.Pseudorabies virus envelope glycoproteins gp50and gII are essential for virus penetration,but only gII is involved in membrane fusion[J].J Virol,1992,66(2):894-905.

    [14]Rauh I,Mettenleiter T C.Pseudorabies virus glycoproteins gII and gp50are essential for virus penetration[J].J Virol,1991,65(10):5348-5356.

    [15]Xuan X,Nakamura T,Ihara T,et al.Characterization of pseudorabies virus glycoprotein gII expressed by recombinant baculovirus[J].Virus Res,1995,36(2-3):151-161.

    [16]包新奇,黃紹華,劉巧榮,等.豬偽狂犬病毒gB基因在大腸桿菌中的分段表達(dá)[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2012,22(3):12-16.

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