雞腺胃型傳染性支氣管炎病毒山東分離株S基因的克隆及序列分析

王玉東，劉俊輝，鄭增忍，王君瑋，王永玲，王曉燕，王樹(shù)雙，牛鐘相

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)際合作與交流處，北京100083；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安271018）

傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）粒子主要包括3種主要結(jié)構(gòu)蛋白，分別為纖突蛋白（S）、膜糖蛋白（M）、內(nèi)部核衣殼蛋白（N），此外還有少量的第4種蛋白（小膜蛋白，E）［1－2］。病毒的纖突蛋白S蛋白由S1和S2兩種糖蛋白組成，血凝抑制抗體和大部分病毒的中和抗體都是由S1誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有免疫保護(hù)作用；據(jù)謝景偉等［3］報(bào)道，S1基因變異最大，是該病毒主要的抗原基因。因此本研究設(shè)計(jì)了一對(duì)S1和S2引物，對(duì)S蛋白基因核苷酸進(jìn)行克隆及序列分析。1998 年王玉東等［4］首次報(bào)道了中國(guó)發(fā)生了腺胃型IB，并將青島分離株命名為QXIBV。潘杰彥等［5］報(bào)道中國(guó)青島腺胃型IBV 株（QXIBV 株又稱SD／97／02株）的S1基因全序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列被病毒基因庫(kù)（Gen－Bank）所收錄，收錄號(hào)為AF193423。張小榮等［6］分離的2株河北分離IBV 株屬于QXIBV 基因型。

Geerligs H J等［7］研制了 一 種QX 樣IBV 活 疫苗，其病毒毒株與QXIBV 的同源性高達(dá)98.1%。近年來(lái)亞洲、歐洲和非洲都有大量IBV－QX 樣病毒感染和發(fā)病的報(bào)道。Toffan A 等［8］報(bào)道非洲發(fā)生QX 樣IBV。Abro S H 等［9］對(duì)IBV－QX 病毒 血清型按全基因序列分型，除了中國(guó)QXIBV 血清型外，歐洲多個(gè)國(guó)家分離到IBV－QX 樣血清型，包括法國(guó)、德國(guó)、意大利、荷蘭、波蘭、俄羅斯、西班牙、瑞典和英國(guó)等都有相關(guān)報(bào)道，其分離毒株的S1 基因序列都與QXIBV 接近。Sigrist B 等［10］報(bào)道在瑞士發(fā)現(xiàn)了冠狀病毒IBV－QX 型感染的病例。Ganapathy K 等［11］報(bào)道英國(guó)從商品肉雞腺胃炎病例中分離到QX 樣IBV。Zhang X R 等［12］報(bào) 道 了 來(lái) 源 于SPF 雞IBV纖突蛋白在重組馬立克病病毒的表達(dá)；Amin O G M等［13］報(bào)道了QX 樣IBV 毒株在中東的傳播，并對(duì)許多國(guó)家的病毒分離株進(jìn)行了基因進(jìn)化分析。Mork A K 等［14］報(bào)道了冠狀 病毒IBV－QX 株和B1648病毒纖突蛋白特性的比較。QX 樣IBV 感染病例呈現(xiàn)世界范圍蔓延的趨勢(shì)。

為研究腺胃型IBV 山東分離株QX 和DY 及FC的病毒S蛋白的核苷酸特征，確認(rèn)其與腎型IBV和呼吸型IBV 的同源性。采用分子生物學(xué)技術(shù)（RT－PCR 試驗(yàn)方法），對(duì)多株IBV 毒株進(jìn)行了纖突蛋白S基因的擴(kuò)增，并對(duì)QX 和DY 株的S基因擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列進(jìn)行分析，表明腺胃型IBV 是不同于呼吸型IBV 和腎型IBV 的一種具有明顯腺胃嗜性的IBV 變異株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒毒株 山東省腺胃型IBV 典型分離株青 島 株（QXIBV）、東 營(yíng) 株（DYIBV）、肥 城 株（FCIBV）、腎型IB分離株（HD），均由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心分離鑒定、保存。IBV H52標(biāo)準(zhǔn)株、H120株、M41標(biāo)準(zhǔn)株、腎型IBV－T 株，均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 主要儀器及試劑 臺(tái)式高速（12 000r／min）離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；DNA 擴(kuò)增儀為美國(guó)MJ Research 公司產(chǎn)品；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽和凝膠成像分析系統(tǒng)為美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品；振蕩器購(gòu)自江蘇常州國(guó)華公司；恒溫水浴鍋為天津泰斯特儀器公司產(chǎn)品；冰箱為青島海爾公司產(chǎn)品。

NaCl，MgCl2，NaH2PO4，Na2HPO4，KH2PO4，K2HPO4，KCl，NaOH，HCl，三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷（Tris），EDTA，異丙醇，無(wú)水乙醇，氯仿，總RNA 抽提劑（Trizol），瓊脂糖，溴化乙錠，硼酸，分別為山東賽恩斯科技公司和青島愛(ài)普科生物工程公司產(chǎn)品。

Taq DNA 聚合酶為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；M－MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑、脫氧核苷三磷酸（dNTP）、DEPC（焦碳酸二乙酯）為Promega公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 引物 參照GenBank注冊(cè)的IBV S通用基因序列，自行設(shè)計(jì)了一對(duì)跨幅約0.9kb的引物，該區(qū)段包含了S1基因C 末端的400bp和S2基因N末端的500bp。該基因片段具有良好的保守性和遺傳特異性，是IBV S基因研究者選擇較多的合成引物。引物預(yù)期擴(kuò)增片段大小為750bp～950bp，引物的使用濃度為10pmol／μL。

引物序列如下：S1：5′CAAGGTTTTATTACTAATGT 3′；S2：5′AGCAAACCATTATATTCACGA 3′。以上引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA 的提取 分別取典型腺胃型IBV 分離株（QX 株、DY 株、FC 株）的 病 毒 尿 囊 液 各100 μL，放入1.5mL的離心管中，加500μL Trizol，上下顛倒5次，混勻，室溫放置15 min。加入100μL氯仿，渦旋混勻，室溫放置8 min，期間混勻2 次。12 000r／min離心15min，取上清200μL加200μL異丙醇混勻，在－20℃放置過(guò)夜。12 000r／min離心15min，緩慢倒掉上清，沿管壁緩慢加750mL／L乙醇0.5mL進(jìn)行洗滌一次，緩慢倒掉750mL／L乙醇，倒扣于吸水紙上，置超凈工作臺(tái)晾干，加入20 μL DEPC處理的無(wú)菌雙蒸水溶解核酸，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄（RT） 在干凈的1.5mL 的離心管中依次加入以下試劑：5×M－MLV RT buffer 4μL，40 U RNA 酶 抑 制 劑1 μL，2.5 mmol／L dNTP 3μL，10pmol／μL 混合引物（S1＋S2）1μL，RNA 提取樣品5μL，200 U M－MLV 反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，雙蒸水5μL，總體積為20μL。混勻后置42℃30min，37℃30min，95℃3min，冷卻至4℃。

1.2.3 目的基因的PCR 擴(kuò)增 在0.2mL 的反應(yīng)管中依次加入以下試劑：10×PCR buffer 3μL，25 mmol／L MgCl22μL，2.5 mmol／L dNTP 3μL，10 pmol／μL的混合引物（S1＋S2）1μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μL，5UTaq DNA 聚合酶0.5μL，雙蒸水15.5 μL，總體積30μL。PCR 反應(yīng)條件為：94℃5min；35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃1 min，55℃1 min，72℃2min；最后72℃延伸10min。

1.2.4 PCR 產(chǎn) 物 檢 測(cè) 獲 得 的PCR 產(chǎn) 物 于10 g／L瓊脂糖凝膠（已含有0.5μg／mL 的溴化乙錠），在電壓100 V～120 V 條件下，電泳30 min～60 min。當(dāng)電泳結(jié)束后，取出凝膠反應(yīng)板，放置于凝膠成像分析系統(tǒng)中進(jìn)行觀察，并照相記錄。

1.2.5 S基因序列測(cè)定及分析 將PCR 產(chǎn)物純化后，用引物S1 進(jìn)行測(cè)序。使用DNAstar序列分析軟件，對(duì)克隆的S基因核苷酸同源性進(jìn)行比較。為探討不同分析方法的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，消除因不同方法產(chǎn)生的誤差，保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和科學(xué)性，選擇國(guó)際通用的Clustal V method、Jotun Hein method和Clustal W method三種方法，分別對(duì)2株腺胃型QX 株、DY 株、1株 腎 型IB HD 株 和 標(biāo) 準(zhǔn)M41株 的S基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)其同源性進(jìn)行分析。由上海博亞生物技術(shù)有限公司協(xié)助完成。

1.2.6 S基因序列進(jìn)化關(guān)系分析 使用DNAStar對(duì)腺胃型IBV（QX 株、DY 株）與標(biāo)準(zhǔn)株（M41株）和腎型IBV（HD 株）同源性進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析。由上海博亞生物技術(shù)有限公司協(xié)助完成。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

用自行設(shè)計(jì)的一對(duì)S基因引物，通過(guò)RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)（圖1、圖2）。山東分離腺胃型QX 株、DY 株、腎型HD 株均與標(biāo)準(zhǔn)株（H52、H120、M41）產(chǎn)物的電泳條帶相似，大小約為900bp（在789bp～857bp之間，標(biāo)準(zhǔn)株M41株為857bp），表明設(shè)計(jì)引物對(duì)IBV 具有良好的特異性。其中QX 株和DY 株與標(biāo)準(zhǔn)呼吸型IB M41、H52、H120、腎型HD 株出現(xiàn)的條帶明顯；FC 株產(chǎn)物有較大差異（僅為500bp），未對(duì)其第2次基因擴(kuò)增，也未分析比對(duì)；腎型IB－T 株未形成明顯的產(chǎn)物條帶。對(duì)M41標(biāo)準(zhǔn)株、QX 株、DY 株、腎 型IB 分 離 株HD 株 四 株 病 毒進(jìn)行第2次RT－PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶與第一次的結(jié)果相同（約為900pb）。

2.2 S基因序列測(cè)定結(jié)果

將M41株、HD 株、QX 株、DY 株4 株IBV 病毒的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3～圖6。4株病毒S 基因均為IBV 的部分S 基因，其中M41株病毒S基因產(chǎn)物為857bp，S基因序列為多數(shù)基因序列；腺胃型QX 株為837bp，DY 株為852 bp，腎型HD 株為789bp。各病毒被擴(kuò)增出的基因片段均含有編碼部分S蛋白的閱讀框架（ORF）。

2.3 S基因核苷酸同源性分析

2.3.1 Clustal V method、Jotun Hein method 和Clustal W method三種方法分析圖 對(duì)2株腺胃型分 離株（QX 株、DY 株），1株 腎 型IB HD 株 和 標(biāo) 準(zhǔn)株M41株的S基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)其同源性進(jìn)行了分析（圖7～圖9）。對(duì)QX 株、DY 株、HD株和M41標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行S基因核苷酸序列分析及其同源性比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種方法之間略有差異，核苷酸分析同源性數(shù)值Jotun Hein 法較高，Clustal W法次之，Clustal V 法最低。

圖1 9種IBV 的S基因擴(kuò)增產(chǎn)物條帶Fig.1 The amplification products of S genes of 9IBV strains

圖2 4種IBV 的S基因擴(kuò)增產(chǎn)物條帶Fig.2 The amplification products of S genes of 4IBV strains

圖3 病毒標(biāo)準(zhǔn)株（M41株）的S基因測(cè)序結(jié)果Fig.3 S gene sequencing of reference IBV M41strain

圖4 腎型IB分離株（HD 株）的S基因測(cè)序結(jié)果Fig.4 S gene sequencing of nephric type IBV HD strain

圖5 腺胃型IB病毒青島株（QX 株）的S基因測(cè)序結(jié)果Fig.5 S gene sequencing of proventriculus type IBV Qingdao QX strain

圖6 腺胃型IBV 東營(yíng)株（DY 株）的S基因測(cè)序結(jié)果Fig.6 S gene sequencing of proventriculus type IBV DY strain

圖7 用Clustal V 方法分析結(jié)果Fig.7 Analysis result by clustal V method

圖8 用Jotun Hein 方法分析結(jié)果Fig.8 Analysis result by Jotun Hein method

圖9 用Clustal W 方法分析結(jié)果Fig.9 Analysis result by Clustal W method

2.3.2 S基因核酸的同源性分析 按Clustal V 法QX 株和標(biāo)準(zhǔn)M41株的同源性達(dá)到64.6%；DY 株與標(biāo)準(zhǔn)M41株的同源性為73.8%；腎型IB HD 株與M41株的同源性為70.9%；QX 株與HD 株的同源性為65.7%；DY 株與HD 株的同源性為70.4%；QX 株與DY 株的同源性為79.7%。QX 株與DY株的差異性為4.3%。QX 株和DY 株與M41株的差異性分別為24.7%和22.4%。QX 株和DY 株與HD 株的差異性為22.7%和23.4%。HD 株與M41株的差異性為19.8%。

按Jotun Hein法 同源性比較的數(shù)值均略高于Clustal V 法。QX 株和標(biāo)準(zhǔn)M41株的同源性為79.3%；DY 株與標(biāo)準(zhǔn)M41株的同源性為79.2%；HD 株與M41株的同源性為80.8%；QX 株與HD株的同源性為78.4%；DY 株與HD 株的同源性為78.9%；QX 株 與DY 株 之 間 的 同 源 性 為95.8%，QX株與DY 株的差異性為3.8%；QX 株和DY 株與M41株的差異性分別為24.5%和24.6%；QX 株和DY 株與HD 株的差異性分別為25.8%和25.2%；HD 株與M41株的差異性為22.3%。QX株和DY 株同源性極高，為95.8%。

按Clustal W method 法 QX 株和標(biāo)準(zhǔn)M41株的同源性為75.7%；DY 株與標(biāo)準(zhǔn)M41株的同源性為77.2%；HD 株與M41株的同源性為79.6%；QX 株與HD 株的 同源性為74.8%；DY 株與HD株的同源性為76.5%；QX 株與DY 株的同源性為90.5%，QX 株與DY 株的差異性為4.2%；QX 株和DY 株與M41 株的差異性分別為24.5%和22.3%。QX 株和DY 株與HD 株的差異性均為22.7%，HD 株與M41株的差異性為20.5%。

歸納三種分析方法結(jié)果，QX 株和DY 株的S基因的核苷酸同源性最高達(dá)到95.8%，最小差異性為3.8%（張小榮［4］分離的QXIBV 基因型2分離株的同源性僅為77.7%）。QX 株和DY 株病毒與標(biāo)準(zhǔn)病毒M41株的同源性最高達(dá)79.3%和79.2%，最小差異性為24.5%和22.3%。QX 株和DY 株與HD 株的同源性最高達(dá)78.4%和78.9%，最小差異性均為22.7%。腎型HD 株與M41株的同源性最高達(dá)到80.8%。腺胃型QX 株和DY 株分別與呼吸型M41株及腎型HD 株的同源性差異不明顯。結(jié)果表明，腺胃型IBV 與呼吸型IBV 和腎型IBV 是不同組織嗜性的傳染性支氣管炎病毒變異株，與呼吸型和腎型IBV 具有同等重要地位的進(jìn)化階段。

2.4 S基因系列進(jìn)化關(guān)系分析

對(duì)腺胃型QX 株、DY 株和腎型HD 株與標(biāo)準(zhǔn)株M41株進(jìn)化關(guān)系分析見(jiàn)圖10。QX和DY 株、M41和腎型HD株各為一個(gè)分支；4株病毒分成2個(gè)群，Ⅰ群包含M41 株和腎型HD 株兩株病毒，遺傳距離為19.8%～22.3%，同源性在70.9%～80.8%之間。Ⅱ群包含了QX 株和DY 株，遺傳距離在3.8%～4.3%之間，同源性在79.7%以上，QX 株和DY 株之間同源性最高達(dá)95.8%。腺胃型QX 和DY 株的遺傳距離很小，按Jotun Hein 法分析僅為3.8%。通過(guò)進(jìn)化分析說(shuō)明，腺胃型IBV 與腎型IBV 和呼吸型IBV 是不同的IBV 病毒的變異株。

圖10 4株病毒S基因系列進(jìn)化關(guān)系分析圖Fig.10 The phylogenetic analysis of S genes of 4viral strains

3 討論

3.1 引物設(shè)計(jì)和基因序列分析

由于IBV 變異性強(qiáng)，引物的設(shè)計(jì)必須在基因的高度保守區(qū)內(nèi)進(jìn)行，以便能獲得一對(duì)能廣泛應(yīng)用于所有IBV 的通用引物。但為了能對(duì)分離的病毒進(jìn)行分類，又必須選擇能代表病毒基因變異的區(qū)域進(jìn)行研究，S纖突蛋白基因被當(dāng)作IBV 分型的主要研究對(duì)象。

在S纖突蛋白中S2蛋白相對(duì)保守，但同樣含有兩個(gè)抗原決定簇。S1 基因的3／4 處屬于多變區(qū)［15］。參考基因庫(kù)IBV S基因序列，自行設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，對(duì)9株IBV 進(jìn)行了RT－PCR，其中7株均形成了特異的目的基因片段，獲得了理想的擴(kuò)增產(chǎn)物。QX 株、DY 株、腎 型HD 株 及M41 株 四 株 病 毒 的RT－PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小范圍為787bp～857bp，對(duì)其進(jìn)行基因序列測(cè)定及同源性分析，表明腺胃型IBV 分離株QX 株和DY 株是一種不同于呼吸型和腎型IBV 的組織嗜性的新的病毒變異株。QX 和DY 株兩株病毒的同源性高達(dá)95.8%。QX 和DY株與M41標(biāo)準(zhǔn)株及腎型HD 株的同源性較低。因FC株的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)株有較大差異，未進(jìn)行DNA 序列分析和同源性比較。

3.2 腺胃型IBV 分子流行病學(xué)分析

從臨床上表現(xiàn)典型癥狀的病雞分離到2株病毒QX 株和DY 株均有嗜腺胃特性，說(shuō)明我國(guó)流行的IBV 與疫苗毒株和國(guó)際上許多IBV 毒株發(fā)生了明顯的變異。按進(jìn)化關(guān)系分析QX 株和DY 株為一群，這兩株腺胃型IBV S 基因序列有高度的同源性。

腺胃型IBV 分離株QX 株和DY 株都與國(guó)內(nèi)流行的腎型IB HD 株和標(biāo)準(zhǔn)毒株M41株具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。近年來(lái)嗜腺胃型IBV 的研究也不斷有所發(fā)展。王玉東等［16］報(bào)道，腺胃型IBV 是與呼吸型和腎型IBV 不同血清型的變異株。王玉東等［17］進(jìn)行的山東分離株（QX 株、DY 株、FC株）SPF雞致病回歸試驗(yàn)獲得了成功，外源病毒的檢測(cè)均為陰性。對(duì)山東3個(gè)分離株進(jìn)行了病毒病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的研究，表明本病的病原為冠狀病毒屬的嗜腺胃型IBV 病毒［18］。

Beato M S等［19］報(bào)道了IBV 中國(guó)分離株QXIBV 在意大利傳播流行的證據(jù)。Pohuang T 等［20］報(bào)道中將泰國(guó)分離的IBV 進(jìn)行S1基因的序列分析。近年來(lái)該病呈世界性流行，Abro S H 等［9］的報(bào)道表明歐洲發(fā)病病例最多。

3.3 對(duì)引起腺胃炎病變的腺胃型IBV 病原學(xué)研究和防疫的思考

1995年－1996年發(fā)生于江蘇省和山東省的腺胃型IB，國(guó)外最初未見(jiàn)此類疾病的報(bào)道，是一種新的IBV 變異株。Saif Y M 主編的禽病學(xué)第11版和第12版均引用了王玉東的報(bào)道［1－2］。10余年來(lái)，中國(guó)各地呈現(xiàn)蔓延趨勢(shì)，使用中國(guó)青島分離株（QXIBV 株）和山東分離株病毒制備的油乳劑滅活苗，在中國(guó)大面積范圍內(nèi)使用表明，免疫效果好，保護(hù)率高［4，16］。國(guó)外近年來(lái)也陸續(xù)有疫苗研制的報(bào)道，Terregino C 等［21］報(bào) 道，意 大 利 分 離 株IBV－QX 株對(duì)SPF雞和商品肉雞的致病性，在蛋雞和肉雞場(chǎng)1日齡和14日齡時(shí)免疫M(jìn)a5和4／91變異株疫苗，對(duì)降低發(fā)生IBV－QX 感染時(shí)引起的經(jīng)濟(jì)損失具有幫助作用。Geerligs H J等［7］報(bào)道的一種與QXIBV 基因同源性高達(dá)98.1%的IB－QX 類病毒疫苗，主要用于雞腎型IB的免疫，目前未進(jìn)行大面積推廣，免疫效果如何，尚未可知。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)對(duì)本病的病原學(xué)研究一直爭(zhēng)論不休，包括傳染性支氣管炎病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒、新城疫病毒、細(xì)小病毒、呼腸病毒等病原在有關(guān)腺胃炎的研究中都有分離到。我們認(rèn)為該病的病原為一種IBV 變異株－即腺胃型IBV 變異株。IBV的多變異特性對(duì)IBV 引起的傳染病的診斷和防疫帶來(lái)了嚴(yán)重的困難，所以如何快速、及時(shí)地對(duì)所分離的IBV 進(jìn)行分析和研究，對(duì)IBV 的防控十分重要。對(duì)該病病原的分子流行病學(xué)分析研究，仍然是未來(lái)一段時(shí)間研究的重要內(nèi)容。

［1］ Saif Y M.禽病學(xué)［M］.11版.蘇敬良，高 福，索 勛，主譯.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005：108－130.

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