小反芻獸疫病毒與產氣莢膜梭菌雙重RT-PCR檢測方法的建立

唐 娜，孫翠平，王玉茂，劉吉山，張 倩，賈 銳，謝金文，李書光，苗立中，沈志強，＊

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600）

2014年春季，羊小反芻獸疫（Peste des petits ruminants，PPR）在我國呈現(xiàn)暴發(fā)、流行態(tài)勢［1］，迅速蔓延到全國多個省、市、自治區(qū)，引起全國廣泛關注。小反芻獸疫俗稱羊瘟，是由小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一種急性病毒性傳染病，主要感染山羊、綿羊等小反芻動物，以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征，發(fā)病率和病死率均高，與由產氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）引起的羊梭菌性疾病共同成為2014年影響國內養(yǎng)羊業(yè)的兩大主要傳染病［2］。

研究發(fā)現(xiàn)，春季接診病羊臨床診斷中，羊小反芻獸疫與產氣莢膜梭菌性疾病臨床癥狀相似，都可表現(xiàn)腹瀉、死亡，臨床剖檢可見出血性腸炎，胃黏膜出血壞死、腎臟變軟等病變［3-4］。這一方面提示存在小反芻獸疫與產氣莢膜梭菌共同感染或繼發(fā)感染的可能，另一方面也給兩種疫病的鑒別診斷提出了更高的要求。鑒于此，本實驗室根據(jù)2014年流行的小反芻獸疫病毒N蛋白和產氣莢膜梭菌α毒素編碼的兩段基因序列特點，綜合應用RNA／DNA提取技術和PCR／RT-PCR技術，建立了鑒別羊小反芻獸疫病毒與產氣莢膜梭菌的雙重PCR檢測方法，為進一步開展羊小反芻獸疫與產氣莢膜梭菌病的診斷與防控研究和診斷試劑開發(fā)應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和菌株 試驗所用的PPRV毒株來自天康畜牧生物技術股份有限公司生產的小反芻獸疫活疫苗，所用產氣莢膜梭菌株為購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心的CVCC C57-1菌株。肉毒梭菌C 型 （C62-4）、腐敗梭菌（C55-2）、大腸埃希菌（C83-1）、綿羊鏈球菌（C74-10）、羊痘病毒（CV41）均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，由山東綠都生物科技有限公司保存；羊口瘡病毒（SD1201）［5］、牛病毒性腹瀉病毒［6］為本實驗室分離毒株。

1.1.2 樣品 臨床樣本采自2014年1月～6月期間山東、河南、江蘇和河北地區(qū)送診的疑似患羊的肝臟、胃腸組織及血液樣品。

1.1.3 主要試劑 AxyPrep DNA／RNA小量提取試劑盒購自愛思進生物技術有限公司；pMD18-T載體、反轉錄試劑盒、rTaqDNA 聚合酶、DNA 凝膠回收試劑盒、大腸埃希菌DH5α菌株等其他試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 通過GenBank在線序列比對，應用MegAlign軟件分別對多株代表性產氣莢膜梭菌株的α毒素基因序列和PPRV代表性毒株的N基因序列進行比對分析，確定其保守區(qū)及非保守區(qū)序列，采用Prime 5.0軟件設計2對特異性引物（表1），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 PPRV、產氣莢膜梭菌引物序列Table 1 Primer sequences of PPRV and Clostridium perfringens

1.2.2 樣品中細菌DNA與病毒RNA的提取 以商品化RNA／DNA提取試劑盒為基礎，對樣品處理步驟進行了改進，同步提取細菌DNA。

在無菌條件下，將新鮮采集的1g組織樣品洗去血污，盡量剪碎，加入少量無菌水，振蕩后靜置5 min，吸取上層液體，12 000r／min離心3min，棄去上清，沉淀加入50μL溶菌酶（20mg／mL）懸浮混勻，37℃孵育20min。將剩余的剪碎組織碾磨勻漿并凍融3次，12 000r／min離心3min，吸取上清150 μL，與上述加入溶菌酶的懸浮液混合，然后按照試劑盒說明書步驟提取DNA／RNA。

從活疫苗和菌落中提取DNA／RNA，先以相應稀釋液或無菌水將樣品溶解或懸浮，混合均勻后取150μL樣品液加入50μL溶菌酶，37℃孵育20min后，按照試劑盒說明書步驟提取DNA／RNA。

1.2.3 雙重RT-PCR檢測方法的建立 按照反轉錄試劑盒說明書步驟，應用引物P2對提取的DNA／RNA進行反轉錄。設立基本反應條件和反應程序進行PCR 擴增，反應體系：premix rTaq10μL，P1-P4共1.5μL，反轉錄的 DNA 模板2μL，補足RNase free H2O 6.5μL，反應各組分混勻后，放入PCR儀進行擴增?；境绦驗椋?4℃4min；94℃30s，53℃ 30s，72℃ 35s，共30個循環(huán)；72℃ 7 min，4℃2min。PCR產物進行15g／L瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 RT-PCR擴增產物的鑒定 將含PPRV N蛋白基因和α毒素基因序列的凝膠切下，按膠純化回收試劑盒說明書回收PCR產物，按常規(guī)方法與pMD18-T載體連接；將連接產物轉化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，利用熱激法轉化，涂布Amp＋LB平板，于37℃培養(yǎng)12h～16h，挑取單個菌落培養(yǎng)過夜，按高純質粒小量制備試劑盒說明書提取質粒并PCR鑒定，將提取的陽性質粒送上海生工生物工程技術有限公司進行測序，并與GenBank登錄的序列比對分析。

1.2.5 雙重RT-PCR反應條件優(yōu)化 以1.2.3的反應體系為基礎，對溶菌酶、反轉錄酶作用時間，以及PCR擴增條件進行優(yōu)化：比較溶菌酶、反轉錄酶分別作用5、10、20、40、60min情況下的擴增效果；應用梯度PCR儀優(yōu)化退火溫度；分別梯度稀釋引物，優(yōu)化引物濃度（0.01μmol／L～50μmol／L）。

1.2.6 特異性試驗 應用上述方法提取肉毒梭菌C型（C62-4）、腐敗梭菌（C55-2）、大腸埃希菌（C83-1）、綿羊鏈球菌（C74-10）、羊痘病毒（CV41）、羊口瘡病毒（SD1201）、牛病毒性腹瀉病毒等菌種和毒種的DNA／RNA，并應用優(yōu)化的RT-PCR擴增體系進行擴增，同時設置陰性對照和陽性對照，瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶情況。

1.2.7 靈敏度試驗 設置8個檢測濃度，進行該方法的靈敏度檢測：測定PPRV疫苗液的TCID50濃度，根據(jù)濃度分別將疫苗倍比稀釋成終濃度為10-5～102TCID50／mL，將產氣莢膜梭菌C57-1菌液根據(jù)菌落計數(shù)情況分別將菌液倍比稀釋成終濃度為10-3～104CFU／mL，按照1.2.2、1.2.3、1.2.4方法進行RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶情況。

1.2.8 重復性試驗 選擇1.2.7中第3、5、7號濃度梯度共3個樣品各做3個重復，共9份，按照1.2.2、1.2.3、1.2.4方法進行 PCR擴增，分析該方法的批內差異。相隔1周后，由3人分別按相同方法步驟檢測一次，分析該方法的批間差異。

1.2.9 臨床樣品檢測 收集39份臨床送診的疑似患羊肝臟、胃腸組織及血液樣品，應用所建立的鑒別RT-PCR方法對樣品進行處理和檢測。

2 結果

2.1 雙重RT-PCR檢測方法的建立與擴增產物鑒定

從PPRV陽性肝臟、胃腸組織、產氣莢膜梭菌陽性肝臟組織，以及混合樣品中，應用所建立的雙重RT-PCR分別擴增出與預期大小一致的PPRV N基因部分序列和產氣莢膜梭菌α毒素部分基因序列，克隆測序分析證實所擴增序列與網上相應序列分別具有較高同源性。從電泳圖上可以明顯區(qū)分出PPRV和產氣莢膜梭菌（圖1），擴增出的目的片段大小分別為406bp和272bp左右。根據(jù)結果，確立采用溶菌酶處理-試劑盒提取法作為組織樣品的RNA／DNA提取方法，以兩步法RT-PCR作為基本雙重RT-PCR檢測方法。

2.2 RT-PCR反應條件優(yōu)化

通過對溶菌酶作用時間、反轉錄反應時間、引物濃度等優(yōu)化試驗證明，當引物濃度分別在1μmol／L～50μmol／L時（圖2），溶菌酶作用時間為10min～60min（圖3），RT-PCR均能擴增出特異性條帶。退火溫度變化對反應結果影響不明顯。最終選擇溶菌酶作用20min，引物濃度為1μmol／L～10μmol／L為最佳反應條件。

圖1 雙重RT-PCR擴增結果Fig.1 Duplex RT-PCR results

圖2 不同引物濃度配比時雙重RT-PCR擴增結果Fig.2 Duplex RT-PCR results with different primer concentrations

圖3 溶菌酶作用不同時間雙重RT-PCR擴增結果Fig.3 Duplex RT-PCR results with different lysozyme reaction time

2.3 特異性試驗

應用上述實驗方法對4種羊病料中常見菌的菌液樣品和3種易感染病毒的細胞培養(yǎng)物樣品進行擴增，結果均為陰性（圖4），表明該方法具有良好的特異性。

圖4 雙重RT-PCR特異性檢驗Fig.4 Specificity test results of duplex RT-PCR

2.4 靈敏度試驗

從擴增結果可見（圖5），本方法具有較高的靈敏度。當PPRV疫苗株稀釋到0.001TCID50／mL時，C57-1菌液稀釋到1個CFU／mL時，PCR擴增仍可為陽性。

圖5 梯度稀釋濃度時雙重RT-PCR的檢測靈敏度Fig.5 Sensitivity test results of duplex RT-PCR with different dilutions

2.5 重復性試驗

用建立的RT-PCR分別重復性地檢測1.2.7中3個濃度的樣品，其批間差異和批內差異分別為4.54%和1.65%，初步分析可能與保存一段時間后病毒和細菌的活力下降、以及半數(shù)致病變濃度和菌落計數(shù)的測定誤差相關。

2.6 臨床樣品檢測結果

用建立的RT-PCR方法檢驗來自江蘇、山東、河南、河北的39份疑似樣本，檢測出PPRV陽性5份（陽性率12.8%），產氣莢膜梭菌陽性11份（陽性率28.2%），其中2份樣品PPRV與產氣莢膜梭菌均為陽性，提示臨床上可能存在一定程度的共同感染。

3 討論

在動物疾病分子診斷技術的應用過程中，現(xiàn)有的商品化細菌提取方法與病毒提取方法存在較大差別，實際檢測時通常需要分開進行。本研究參考國內外多篇報道［7-8］，根據(jù)組織病料的生物化學特征和梭菌的菌體結構特點，結合商品化RNA／DNA試劑盒現(xiàn)有技術，改進了組織中病毒與細菌RNA／DNA提取方法，初步實現(xiàn)了組織樣品中細菌與病毒核酸的同步提取。

羊小反芻獸疫在國內大面積的暴發(fā)與流行，促使我們更加關注該病的分子流行病學和遺傳變異研究。根據(jù)國內外報道，以及基因庫登錄序列比對分析表明，2014年國內流行毒株具有一定的特點。以N蛋白為例，這些毒株之間的N基因序列具有較高的同源性（99.5%～100%）［9］，但與西藏流行毒株同源性相對低一些，與伊拉克等國家流行的毒株同源性相對較高［10］。因此，本研究選擇GenBank中與國內流行毒株N蛋白基因同源性較高的參考毒株Sungri／96株為模板，以N蛋白基因序列C末端高保守區(qū)域為靶基因［11］，設計了一對特異性引物，Blast分析表明，該引物能夠有效匹配多個亞群的PPRV N基因，且具有非常好的特異性。RT-PCR試驗也發(fā)現(xiàn)，應用該對引物能夠檢測到0.001TCID50／mL的病毒，與國內外報道的檢測方法相比，靈敏度較高［12-13］。

目前國內診斷羊細菌病的主要手段仍然以傳統(tǒng)的細菌分離、培養(yǎng)、鑒定為主［14］，耗時較長，操作復雜，生物安全風險大。在診斷羊感染產氣莢膜梭菌引起的羊猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥等疫病時，由于該類疫病有發(fā)病急、死亡快、治療困難等特點，采用傳統(tǒng)診斷方法更是難以及時有效地做出診斷［15］。近年來，人們陸續(xù)開發(fā)了多種PCR方法用于鑒定產氣莢膜梭菌，并取得了較好的效果［16］。本研究通過前期試驗探討了組織中梭菌DNA的提取技術，并設計了產氣莢膜梭菌A、B、C、D、E型通用的α毒素編碼基因擴增引物，依托PPRV RT-PCR建立的雙重RT-PCR方法既可以直接從患病羊組織體液樣品中快速檢測產氣莢膜梭菌（靈敏度達10CFU／mL），又能夠實現(xiàn)PPRV與產氣莢膜梭菌的快速鑒別診斷。

通過初步臨床應用，從組織樣品中檢出多例PPRV和產氣莢膜梭菌，說明本檢測方法對于羊小反芻獸疫和產氣莢膜梭菌病的快速鑒別診斷和致病機理研究具有實際應用價值。不過，由于目前關于羊小反芻獸疫與羊產氣莢膜梭菌性疾病的致病機理研究尚不透徹，兩種病混合感染作用機制、病原的體內分布情況等均不明確，本研究所建立的鑒別檢測方法仍然需要在實踐中進一步驗證與優(yōu)化。

［1］黃建龍，王昌建，陳桂華，等.湖南省對首例小反芻獸疫的診斷報告［J］.中國動物檢疫，2014（8）：52-54.

［2］劉永宏，曹勝波，趙 麗，等.中國小反芻獸疫疫情分析［J］.西北農業(yè)學報，2014（9）：19-26.

［3］次仁羅布.小反芻獸疫的綜合防控措施［J］.山東畜牧獸醫(yī)，2013（5）：40.

［4］王六合，徐 敏，李愛巧，等.羊梭菌性疾病的診治與體會［J］.草食家畜，2011（1）：87-88.

［5］唐 娜，劉吉山，王玉茂，等.一株羊口瘡病毒分離株的生物學特性研究［J］.動物醫(yī)學進展，2014，35（6）：49-53.

［6］祖立闖，王金良，李 嬌，等.牛病毒性腹瀉病毒套式RT-PCR檢測方法的建立及初步應用［J］.中國獸醫(yī)學報，2010，30（12）：1598-1601，1605.

［7］Mathieson W，Thomas G A.Simultaneously extracting DNA，RNA，and protein using kits：Is sample quantity or quality prejudiced［J］.Anal Biochem，2013，433（1）：10-18.

［8］Albina E，Kwiatek O，Minet C，et al.Peste des petits ruminants，the next eradicated animal disease［J］.Vet Microbiol，2013，165（1-2）：38-44.

［9］秦娟娟.DNA／RNA同步提取方法學的建立及其法醫(yī)學應用研究［D］.山西太原：山西醫(yī)科大學，2013：13.

［10］Muthuchelvan D，De A，Debnath B，et al.Molecular characterization of peste-des-petits ruminants virus（PPRV）isolated from an outbreak in the Indo-Bangladesh border of Tripura state of North-East India［J］.Vet Microbiol，2014，174（3-4）：591-595.

［11］Kumar K S，Babu A，Sundarapandian G，et al.Molecular characterisation of lineage IV peste des petits ruminants virus using multi gene sequence data［J］.Vet Microbiol，2014，7（1-2）：39-49.

［12］Mahajan S，Agrawal R，Kumar M，et al.Sandwich ELISA based evaluation of clinical samples for Peste des petits ruminants（PPR）virus detection［J］.Small Ruminant Res，2012，106（2-3）：206-209.

［13］張喜悅.小反芻獸疫ELISA及PCR診斷方法的建立［D］.吉林長春：吉林農業(yè)大學，2008：20-29.

［14］胡來根.羊梭菌性疾病的鑒別診斷［J］.畜牧與飼料科學，2009，30（5）：160-161.

［15］徐 瓊，何宇乾，吳海燕.小反芻獸疫研究進展［J］.動物醫(yī)學進展，2012，33（8）：93-96.

［16］王光華.產氣莢膜梭菌的分子診斷與免疫研究［D］.北京：中國農業(yè)科學院，2010：15-26.