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    山東部分地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒分離鑒定及HA和NA基因的遺傳進(jìn)化分析

    2015-06-18 11:27:58王光鋒王洪利
    動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2015年6期
    關(guān)鍵詞:血凝核苷酸毒株

    王光鋒,李 舫,王洪利

    (山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院,山東濰坊 261061)

    禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV )引起的禽類的一種傳染?。?],部分亞型禽流感病毒也可以感染人,自1871年首次在意大利報(bào)道以來,世界各地都有特定毒株引起的AI的暴發(fā)和流行,給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。AIV亞型眾多,遺傳變異極為頻繁,抗原性變異主要是指流感病毒表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)這兩種蛋白的改變,它們的變異決定著病毒的宿主親嗜性(感染人或禽)、致病性(高致病性或低致病性)、免疫性和暴發(fā)流行等[2]。我國自1994年首次報(bào)道從雞群分離到H9N2亞型AIV以來[3],目前絕大部分省市都有H9亞型AIV的流行,并且宿主譜擴(kuò)散至山雞、鵪鶉等禽類品種,且檢出陽性率不斷增高[4]。

    近幾年來,對我國部分省、市、區(qū)活禽市場禽群及發(fā)生呼吸道感染的蛋雞、肉雞開展H9N2亞型AI的病原學(xué)檢測,發(fā)現(xiàn)H9亞型AIV的陽性率高達(dá)60%以上,說明H9亞型AI在我國廣泛存在[5-7]。山東是養(yǎng)禽大省,H9亞型AI同樣普遍流行[8]。H9亞型AIV感染家禽可導(dǎo)致產(chǎn)蛋下降、免疫抑制,與其他病原共感染或繼發(fā)感染時導(dǎo)致高病死率,給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時,H9亞型AIV可以感染人、豬等哺乳動物,在公共衛(wèi)生上具有重要意義[9]。

    AIV基因組為8節(jié)段的負(fù)鏈RNA,很容易發(fā)生基因突變和重排現(xiàn)象,因此有必要對H9亞型AIV進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和遺傳進(jìn)化分析。本課題組于2013年從山東省濰坊、淄博、青島、臨沂、濟(jì)南、濱州和煙臺等地區(qū)疑似禽流感發(fā)病雞群中分離到14株病毒,經(jīng)鑒定為H9N2亞型AIV,并對其HA、NA基因保守區(qū)片段進(jìn)行了擴(kuò)增和序列比對分析,以期了解山東地區(qū)近年來H9N2亞型AIV的遺傳變異情況,為H9亞型禽流感的防控策略提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 病料和雞胚 病料采自2013年山東不同地區(qū)疑似禽流感病死雞的肝、脾、肺和腦等組織。10日齡SPF雞胚購自山東農(nóng)科院家禽所。

    1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)抗原和陽性血清 禽流感H9亞型滅活疫苗(A/chicken/Shandong/6/96株)、禽流感病毒H5、H7、H9亞型陽性血清、新城疫病毒(NDV)陽性血清購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

    1.1.3 主要試劑 Trizol reagent、DEPC購于Invitrogen公司;RT-PCR試劑盒、凝膠回收試劑盒購自北京天恩澤基因有限公司;無水乙醇、異丙醇、氯仿等均為國產(chǎn)分析純。

    1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上公布的H9N2亞型AIV全基因組序列,應(yīng)用Primer 5軟件分別設(shè)計(jì)了2對擴(kuò)增引物,各引物的序列、用途及擴(kuò)增長度見表1。所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,用滅菌1×TE緩沖液稀釋至20μmol/L,分裝,置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    表1 PCR所用引物Table 1 The primers of PCR

    1.2 方法

    1.2.1 病毒的分離培養(yǎng)

    1.2.1.1 病料處理 將采集的疑似禽流感病雞的肝、脾、肺和腦等組織病料剪碎研磨后,按1∶5比例加入pH7.2的PBS(內(nèi)含1 000單位/mL青霉素、1 000μg/mL的鏈霉素),制成勻漿。在-20℃反復(fù)凍融3次,8 000r/min離心15min,取上清并以0.22μm的濾膜過濾除菌。

    觀察比較兩種檢查方式半月板損傷診斷結(jié)果與手術(shù)后診斷結(jié)果比較。半月板損傷程度分級[2]:0度:半月板正常無損傷;I度:輕度退行性變,出現(xiàn)團(tuán)片狀信號;Ⅱ度:較重度退行性變,出現(xiàn)線狀信號,未至關(guān)節(jié)面;Ⅲ度:半月板撕裂傷,線性信號至關(guān)節(jié)面。

    1.2.1.2 雞胚接種 將上述濾液經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚,每胚接種0.2mL。棄去24h內(nèi)死亡雞胚,記錄接種死亡時間,收獲24h之后死亡雞胚的尿囊液。

    1.2.1.3 雞胚的半數(shù)致死量(ELD50) 將分離毒株的第二代尿囊液做104、105、106、107、108、109、1010倍稀釋,分別接種10日齡SPF雞胚,0.1mL/枚,每一稀釋度接種6枚,記錄雞胚死亡情況,據(jù)Karber法計(jì)算其ELD50。

    1.2.2 血凝與血凝抑制試驗(yàn) 根據(jù) GB/T 18936-2003《高致病性禽流感診斷技術(shù)》[10]進(jìn)行病毒的血凝與血凝抑制試驗(yàn)。根據(jù)病毒的血凝效價(jià),配制4個血凝單位的抗原,分別與AIV(H5、H7、H9)及NDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。

    1.2.3 RT-PCR檢測

    1.2.3.1 病毒 RNA 的提取 參照 Trizol reagent說明書進(jìn)行。所用試劑均為RNase-free,器皿均用DEPC水處理并經(jīng)過高壓滅菌。取250μL病毒尿囊液,加入750μL Trizol reagent試劑,混勻后室溫孵育5min;加入200μL氯仿,劇烈振搖15s,室溫孵育2min~3min,4℃、12 000r/min離心15min,取上清液500μL;加入500μL異丙醇,混勻后室溫靜置10min,4℃、12 000r/min離心10min,棄上清液;加入1 000μL 750mL/L乙醇(DEPC處理水配制),4℃、12 000r/min離心5min,棄上清;沉淀干燥后懸于適量的DEPC處理水中備用。

    1.2.3.2 RT-PCR擴(kuò)增 RT-PCR反應(yīng)根據(jù)北京天恩澤公司兩管式RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行。

    反轉(zhuǎn)錄采用20μL體系,在PCR反應(yīng)管中分別加入3μL已制備的RNA,加入1μL隨機(jī)引物(0.2 μg/μL),補(bǔ)水到12μL,70℃保溫5min變性模板后立即冰浴,按順序加入4μL RT-buffer(含dNTP)和2μL反轉(zhuǎn)錄酶,瞬時離心混勻。反應(yīng)程序:42℃60min,70℃保溫10min以終止反應(yīng),然后放置冰上待用。

    取5μL~10μL擴(kuò)增產(chǎn)物通過12g/L瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。

    1.2.3.3 HA、NA基因的遺傳進(jìn)化分析 HA基因、NA基因保守片段PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳鑒定大小正確后,利用凝膠回收試劑盒回收,回收產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司測序,測序結(jié)果提交到GenBank進(jìn)行比對,并用DNAstar 5.0與GenBank中下載的H9N2亞型禽流感病毒典型代表株和地方流行株的HA和NA基因序列進(jìn)行核苷酸序列同源性比較,用 MEGA 4.0軟件繪制基因進(jìn)化樹(表2)。

    表2 分離毒株和參考毒株信息Table 2 The information about isolates and reference strains

    2 結(jié)果

    2.1 病毒的分離鑒定

    雞胚接種分離到14株病毒(濰坊3株、淄博2株、青島2株、臨沂2株、濟(jì)南2株、濱州2株、煙臺1株),分離株病毒的雞胚平均死亡時間差異不大,在90.0h~120.5h之間。其中 CK/SD/WF3毒株的雞胚平均死亡時間最短為90.0h,而其他病毒的雞胚平均死亡時間都在90h以上,說明它們的致病力較弱。分離毒株對雞胚的ELD50為10-6.33/0.1mL~10-8.17/0.1mL,其中 CK/SD/WF3毒株的 ELD50為10-8.17/0.1mL,表現(xiàn)出較其他13株病毒強(qiáng)的致病力。血凝試驗(yàn)表明,所有毒株尿囊液均可凝集10mL/L雞紅細(xì)胞,其血凝價(jià)為26~211。血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果表明,分離病毒只被禽流感病毒H9亞型陽性血清特異性抑制,血凝抑制效價(jià)均為28,不被禽流感病毒H5、H7亞型陽性血清、新城疫病毒陽性血清抑制,初步判定分離毒株是H9亞型禽流感病毒。

    2.2 RT-PCR檢測

    RT-PCR產(chǎn)物在12g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析表明,HA基因片段長度為548bp(圖1A),NA基因片段長度為375bp(圖1B),且分離株與陽性對照株 A/chicken/Shandong/6/96 株擴(kuò)增的產(chǎn)物大小一致,與預(yù)期結(jié)果相符。

    2.3 HA和NA基因測序與分析

    設(shè)計(jì)的HA引物預(yù)期能擴(kuò)增出548bp的堿基,測序結(jié)果為548bp;NA引物預(yù)期能擴(kuò)增出375bp,測序結(jié)果為375bp。14株病毒HA基因裂解位點(diǎn)氨基酸序列除分離株CK/SD/WF12為-PSRYSRGL-,CK/SD/JN2為-PARSSR-GL-,其余12株病毒裂解位點(diǎn)均為-PSRSSR/GL-,為2個非連續(xù)的堿性氨基酸R,符合低致病性AIV毒株HA基因裂解位點(diǎn)的序列特點(diǎn)。

    圖1 分離毒株RT-PCR鑒定Fig.1 RT-PCR identification of the isolated stiains

    將HA和NA基因的序列分別與GenBank中已發(fā)表的國內(nèi)參考毒株HA和NA基因的核苷酸序列進(jìn)行對比分析。分離到的14株H9N2亞型AIV的HA基因,彼此間核苷酸序列同源性為88.5%~100.0%,推導(dǎo)的氨基酸同源性為87.4%~100.0%;與GenBank已發(fā)表的H9N2亞型AIV國內(nèi)參考毒株的核苷酸序列同源性介于80.5%~99.8%,推導(dǎo)的氨基酸同源性為80.1%~100.0%。14株病毒NA基因彼此間核苷酸序列同源性為93.9%~100%,推導(dǎo)的氨基酸同源性為96.0%~100.0%,親緣關(guān)系密切;與參考毒株的核苷酸序列同源性介于86.6%~100.0%;推導(dǎo)的氨基酸同源性為89.5%~100.0%。

    2.4 HA和NA基因的遺傳進(jìn)化分析

    應(yīng)用MEGA4軟件分別繪制了14株病毒HA、NA基因的遺傳進(jìn)化樹。14株病毒的HA基因?qū)贇W亞系CK/BJ/94這一大分支,其中13株病毒與代表株 CK/F/98及 CK/BJ/94有一定遺傳距離,與DK/Y280/97同源性最高,核苷酸同源性達(dá)90.3%以上,屬于Y280分支,而CK/SD/JN2獨(dú)立于其他13株病毒之外,與代表株CK/F/98遺傳距離最近,核苷酸同源性為96.9%,屬于F/98分支,說明不同地域間H9N2亞型AIV存在一定差異。NA基因同樣均來自CK/BJ/94這一大分支,與DK/Y280/97遺傳距離最近,同源性達(dá)93.6%以上,屬于Y280分支(圖2)。

    3 討論

    禽流感病毒低致病力毒株HA基因的裂解位點(diǎn)特征為-PARSSR/G-,而高致病性毒株的分子特征為-R-X-R/K-R/G-(X 為非堿性氨基酸)[11]。本研究分離毒株的裂解位點(diǎn)氨基酸序列為P-S-R-S-SR或P-S-R-Y-S-R,從分子水平上證實(shí)為低致病力毒株。從核苷酸組成分析,S與R僅有1個堿基的差異,即AGU (AGC)-AGA (AGG),因此,H9亞型AIV在其裂解位點(diǎn)附近的氨基酸有突變成堿性氨基酸即成為高致病力毒株的可能。但不同于參考毒株Y280(P-A-R-S-S-R),分離毒株第2位氨基酸殘基由非極性氨基酸(A)突變?yōu)闃O性氨基酸(S),是否會影響病毒的部分生物學(xué)特性,需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

    目前H9N2亞型AIV的HA和NA基因的進(jìn)化均分為歐亞和北美2大分支,其中歐亞分支進(jìn)一步又分為3個亞分支,代表株分別為A/chicken/Beijing/1/1994(CK/BJ/94 亞 系)、A/Quail/Hong Kong/G1/97(QA/G1/97 亞系)和 A/duck/Hong Kong/Y439/1997(DK/Y439/97 亞 系)[12-13],而 內(nèi)部基因形成更多分支,組成不同的基因型[14]。

    從進(jìn)化樹可以看出,本研究分離的14株病毒,除濟(jì)南分離株CK/SD/JN2外,其余13株病毒的HA和NA基因均屬于歐亞分支CK/BJ/94分支中的Y280亞系,與其他報(bào)道一致[15-16]。這13株病毒和山東省2006年分離株CK/SD/LY/06、2010年分離株 CK/SD/BD/10、2013年分離株 CK/RZ/853/13親緣關(guān)系較近,而與1996年分離株CK/SD/6/96、2000年分離株 CK/SD/1/00及代表株 CK/BJ/94(北京分離株)、CK/F/98(上海分離株)親緣關(guān)系較遠(yuǎn),提示2006年-2013年分離株和1994年-2000年分離株在遺傳進(jìn)化上有了一定差異。但從發(fā)育樹上可知,所有分離的H9N2亞型AIV都屬于BJ/94分支,提示山東省 H9N2亞型AIV HA基因、NA基因可能處在一個比較穩(wěn)定的遺傳演化過程。

    將山東分離株與不同地域分離株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析顯示,AIV H9N2亞型山東分離毒株與國內(nèi)不同地域分離的H9N2亞型毒株遺傳進(jìn)化并沒有表現(xiàn)出特殊的地域偏好性,與地理位置相距較遠(yuǎn)的廣東、浙江、上海、湖南等地方分離毒株同源性亦較高。病毒是通過候鳥還是運(yùn)輸發(fā)生傳播是值得研究的一個方面,明確病毒的傳播途徑和方式對山東地區(qū)禽流感的控制和預(yù)防具有重要意義。

    20世紀(jì)90年代以來,我國大陸各地相繼發(fā)生了H9N2亞型禽流感疫情,使用疫苗后該病得到了較好的控制,臨床上該病毒的分離率明顯下降。但近幾年來,該病毒在國內(nèi)養(yǎng)殖場廣泛流行。有學(xué)者對當(dāng)前疫苗的免疫效力產(chǎn)生了懷疑,因?yàn)楝F(xiàn)有疫苗株基本上分離自20世紀(jì)90年代,隨著HA蛋白抗原漂移,現(xiàn)有疫苗株已不能有效保護(hù)流行株的感染[17]。從本研究14株病毒的HA基因、NA基因序列的遺傳進(jìn)化分析可以看出,2010年之后分離株的遺傳距離較近,而與目前中國廣泛使用的H9N2亞型禽流感滅活苗的種毒株 CK/SH/F/98 、Ck/SD/6/96雖同位于BJ/94分支,但具有較遠(yuǎn)的遺傳距離(圖2)。因此,疫苗株與流行株之間的抗原差異可能是導(dǎo)致近年來H9亞型禽流感免疫保護(hù)效果不好的重要原因之一。這提示制備疫苗時,要采用流行毒株作為種毒才能產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)。

    圖2 H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA基因的遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees of HA and NA genes of H9N2AIV

    HA和NA基因相對頻繁的變異,使得低致病力流感病毒基因重組后可能成為毒力較強(qiáng)的毒株,多數(shù)H9亞型AIV的受體結(jié)合位點(diǎn)226位均為L,具有人受體結(jié)合特異性,對公共健康具有潛在的重大威脅[18-19]。所以在今后的工作中,加強(qiáng)對H9N2亞型AI的流行病學(xué)監(jiān)測是非常必要的。

    本研究通過對山東省2013年不同地方分離的H9N2亞型AIV的HA和NA基因遺傳進(jìn)化分析,豐富了山東省雞源禽流感流行病學(xué)信息,為了解山東省流行的H9N2亞型AIV的變異情況,指導(dǎo)禽流感疫情防控以及篩選疫苗病毒株提供了依據(jù)。

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