山東部分地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒分離鑒定及HA和NA基因的遺傳進(jìn)化分析

王光鋒，李 舫，王洪利

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV ）引起的禽類的一種傳染?。?］，部分亞型禽流感病毒也可以感染人，自1871年首次在意大利報(bào)道以來，世界各地都有特定毒株引起的AI的暴發(fā)和流行，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。AIV亞型眾多，遺傳變異極為頻繁，抗原性變異主要是指流感病毒表面血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）這兩種蛋白的改變，它們的變異決定著病毒的宿主親嗜性（感染人或禽）、致病性（高致病性或低致病性）、免疫性和暴發(fā)流行等［2］。我國自1994年首次報(bào)道從雞群分離到H9N2亞型AIV以來［3］，目前絕大部分省市都有H9亞型AIV的流行，并且宿主譜擴(kuò)散至山雞、鵪鶉等禽類品種，且檢出陽性率不斷增高［4］。

近幾年來，對我國部分省、市、區(qū)活禽市場禽群及發(fā)生呼吸道感染的蛋雞、肉雞開展H9N2亞型AI的病原學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)H9亞型AIV的陽性率高達(dá)60%以上，說明H9亞型AI在我國廣泛存在［5-7］。山東是養(yǎng)禽大省，H9亞型AI同樣普遍流行［8］。H9亞型AIV感染家禽可導(dǎo)致產(chǎn)蛋下降、免疫抑制，與其他病原共感染或繼發(fā)感染時導(dǎo)致高病死率，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時，H9亞型AIV可以感染人、豬等哺乳動物，在公共衛(wèi)生上具有重要意義［9］。

AIV基因組為8節(jié)段的負(fù)鏈RNA，很容易發(fā)生基因突變和重排現(xiàn)象，因此有必要對H9亞型AIV進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和遺傳進(jìn)化分析。本課題組于2013年從山東省濰坊、淄博、青島、臨沂、濟(jì)南、濱州和煙臺等地區(qū)疑似禽流感發(fā)病雞群中分離到14株病毒，經(jīng)鑒定為H9N2亞型AIV，并對其HA、NA基因保守區(qū)片段進(jìn)行了擴(kuò)增和序列比對分析，以期了解山東地區(qū)近年來H9N2亞型AIV的遺傳變異情況，為H9亞型禽流感的防控策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和雞胚 病料采自2013年山東不同地區(qū)疑似禽流感病死雞的肝、脾、肺和腦等組織。10日齡SPF雞胚購自山東農(nóng)科院家禽所。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)抗原和陽性血清 禽流感H9亞型滅活疫苗（A／chicken／Shandong／6／96株）、禽流感病毒H5、H7、H9亞型陽性血清、新城疫病毒（NDV）陽性血清購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.3 主要試劑 Trizol reagent、DEPC購于Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒、凝膠回收試劑盒購自北京天恩澤基因有限公司；無水乙醇、異丙醇、氯仿等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上公布的H9N2亞型AIV全基因組序列，應(yīng)用Primer 5軟件分別設(shè)計(jì)了2對擴(kuò)增引物，各引物的序列、用途及擴(kuò)增長度見表1。所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用滅菌1×TE緩沖液稀釋至20μmol／L，分裝，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR所用引物Table 1 The primers of PCR

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離培養(yǎng)

1.2.1.1 病料處理 將采集的疑似禽流感病雞的肝、脾、肺和腦等組織病料剪碎研磨后，按1∶5比例加入pH7.2的PBS（內(nèi)含1 000單位／mL青霉素、1 000μg／mL的鏈霉素），制成勻漿。在-20℃反復(fù)凍融3次，8 000r／min離心15min，取上清并以0.22μm的濾膜過濾除菌。

觀察比較兩種檢查方式半月板損傷診斷結(jié)果與手術(shù)后診斷結(jié)果比較。半月板損傷程度分級[2]：0度：半月板正常無損傷；I度：輕度退行性變，出現(xiàn)團(tuán)片狀信號；Ⅱ度：較重度退行性變，出現(xiàn)線狀信號，未至關(guān)節(jié)面；Ⅲ度：半月板撕裂傷，線性信號至關(guān)節(jié)面。

1.2.1.2 雞胚接種 將上述濾液經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚接種0.2mL。棄去24h內(nèi)死亡雞胚，記錄接種死亡時間，收獲24h之后死亡雞胚的尿囊液。

1.2.1.3 雞胚的半數(shù)致死量（ELD50） 將分離毒株的第二代尿囊液做104、105、106、107、108、109、1010倍稀釋，分別接種10日齡SPF雞胚，0.1mL／枚，每一稀釋度接種6枚，記錄雞胚死亡情況，據(jù)Karber法計(jì)算其ELD50。

1.2.2 血凝與血凝抑制試驗(yàn) 根據(jù) GB／T 18936-2003《高致病性禽流感診斷技術(shù)》［10］進(jìn)行病毒的血凝與血凝抑制試驗(yàn)。根據(jù)病毒的血凝效價(jià)，配制4個血凝單位的抗原，分別與AIV（H5、H7、H9）及NDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。

1.2.3 RT-PCR檢測

1.2.3.1 病毒 RNA 的提取 參照 Trizol reagent說明書進(jìn)行。所用試劑均為RNase-free，器皿均用DEPC水處理并經(jīng)過高壓滅菌。取250μL病毒尿囊液，加入750μL Trizol reagent試劑，混勻后室溫孵育5min；加入200μL氯仿，劇烈振搖15s，室溫孵育2min～3min，4℃、12 000r／min離心15min，取上清液500μL；加入500μL異丙醇，混勻后室溫靜置10min，4℃、12 000r／min離心10min，棄上清液；加入1 000μL 750mL／L乙醇（DEPC處理水配制），4℃、12 000r／min離心5min，棄上清；沉淀干燥后懸于適量的DEPC處理水中備用。

1.2.3.2 RT-PCR擴(kuò)增 RT-PCR反應(yīng)根據(jù)北京天恩澤公司兩管式RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行。

反轉(zhuǎn)錄采用20μL體系，在PCR反應(yīng)管中分別加入3μL已制備的RNA，加入1μL隨機(jī)引物（0.2 μg／μL），補(bǔ)水到12μL，70℃保溫5min變性模板后立即冰浴，按順序加入4μL RT-buffer（含dNTP）和2μL反轉(zhuǎn)錄酶，瞬時離心混勻。反應(yīng)程序：42℃60min，70℃保溫10min以終止反應(yīng)，然后放置冰上待用。

取5μL～10μL擴(kuò)增產(chǎn)物通過12g／L瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.3.3 HA、NA基因的遺傳進(jìn)化分析 HA基因、NA基因保守片段PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳鑒定大小正確后，利用凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物送寶生物工程（大連）有限公司測序，測序結(jié)果提交到GenBank進(jìn)行比對，并用DNAstar 5.0與GenBank中下載的H9N2亞型禽流感病毒典型代表株和地方流行株的HA和NA基因序列進(jìn)行核苷酸序列同源性比較，用 MEGA 4.0軟件繪制基因進(jìn)化樹（表2）。

表2 分離毒株和參考毒株信息Table 2 The information about isolates and reference strains

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離鑒定

雞胚接種分離到14株病毒（濰坊3株、淄博2株、青島2株、臨沂2株、濟(jì)南2株、濱州2株、煙臺1株），分離株病毒的雞胚平均死亡時間差異不大，在90.0h～120.5h之間。其中 CK／SD／WF3毒株的雞胚平均死亡時間最短為90.0h，而其他病毒的雞胚平均死亡時間都在90h以上，說明它們的致病力較弱。分離毒株對雞胚的ELD50為10-6.33／0.1mL～10-8.17／0.1mL，其中 CK／SD／WF3毒株的 ELD50為10-8.17／0.1mL，表現(xiàn)出較其他13株病毒強(qiáng)的致病力。血凝試驗(yàn)表明，所有毒株尿囊液均可凝集10mL／L雞紅細(xì)胞，其血凝價(jià)為26～211。血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，分離病毒只被禽流感病毒H9亞型陽性血清特異性抑制，血凝抑制效價(jià)均為28，不被禽流感病毒H5、H7亞型陽性血清、新城疫病毒陽性血清抑制，初步判定分離毒株是H9亞型禽流感病毒。

2.2 RT-PCR檢測

RT-PCR產(chǎn)物在12g／L的瓊脂糖凝膠電泳分析表明，HA基因片段長度為548bp（圖1A），NA基因片段長度為375bp（圖1B），且分離株與陽性對照株 A／chicken／Shandong／6／96 株擴(kuò)增的產(chǎn)物大小一致，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 HA和NA基因測序與分析

設(shè)計(jì)的HA引物預(yù)期能擴(kuò)增出548bp的堿基，測序結(jié)果為548bp；NA引物預(yù)期能擴(kuò)增出375bp，測序結(jié)果為375bp。14株病毒HA基因裂解位點(diǎn)氨基酸序列除分離株CK／SD／WF12為-PSRYSRGL-，CK／SD／JN2為-PARSSR-GL-，其余12株病毒裂解位點(diǎn)均為-PSRSSR／GL-，為2個非連續(xù)的堿性氨基酸R，符合低致病性AIV毒株HA基因裂解位點(diǎn)的序列特點(diǎn)。

圖1 分離毒株RT-PCR鑒定Fig.1 RT-PCR identification of the isolated stiains

將HA和NA基因的序列分別與GenBank中已發(fā)表的國內(nèi)參考毒株HA和NA基因的核苷酸序列進(jìn)行對比分析。分離到的14株H9N2亞型AIV的HA基因，彼此間核苷酸序列同源性為88.5%～100.0%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為87.4%～100.0%；與GenBank已發(fā)表的H9N2亞型AIV國內(nèi)參考毒株的核苷酸序列同源性介于80.5%～99.8%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為80.1%～100.0%。14株病毒NA基因彼此間核苷酸序列同源性為93.9%～100%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為96.0%～100.0%，親緣關(guān)系密切；與參考毒株的核苷酸序列同源性介于86.6%～100.0%；推導(dǎo)的氨基酸同源性為89.5%～100.0%。

2.4 HA和NA基因的遺傳進(jìn)化分析

應(yīng)用MEGA4軟件分別繪制了14株病毒HA、NA基因的遺傳進(jìn)化樹。14株病毒的HA基因?qū)贇W亞系CK／BJ／94這一大分支，其中13株病毒與代表株 CK／F／98及 CK／BJ／94有一定遺傳距離，與DK／Y280／97同源性最高，核苷酸同源性達(dá)90.3%以上，屬于Y280分支，而CK／SD／JN2獨(dú)立于其他13株病毒之外，與代表株CK／F／98遺傳距離最近，核苷酸同源性為96.9%，屬于F／98分支，說明不同地域間H9N2亞型AIV存在一定差異。NA基因同樣均來自CK／BJ／94這一大分支，與DK／Y280／97遺傳距離最近，同源性達(dá)93.6%以上，屬于Y280分支（圖2）。

3 討論

禽流感病毒低致病力毒株HA基因的裂解位點(diǎn)特征為-PARSSR／G-，而高致病性毒株的分子特征為-R-X-R／K-R／G-（X 為非堿性氨基酸）［11］。本研究分離毒株的裂解位點(diǎn)氨基酸序列為P-S-R-S-SR或P-S-R-Y-S-R，從分子水平上證實(shí)為低致病力毒株。從核苷酸組成分析，S與R僅有1個堿基的差異，即AGU （AGC）-AGA （AGG），因此，H9亞型AIV在其裂解位點(diǎn)附近的氨基酸有突變成堿性氨基酸即成為高致病力毒株的可能。但不同于參考毒株Y280（P-A-R-S-S-R），分離毒株第2位氨基酸殘基由非極性氨基酸（A）突變?yōu)闃O性氨基酸（S），是否會影響病毒的部分生物學(xué)特性，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

目前H9N2亞型AIV的HA和NA基因的進(jìn)化均分為歐亞和北美2大分支，其中歐亞分支進(jìn)一步又分為3個亞分支，代表株分別為A／chicken／Beijing／1／1994（CK／BJ／94 亞 系）、A／Quail／Hong Kong／G1／97（QA／G1／97 亞系）和 A／duck／Hong Kong／Y439／1997（DK／Y439／97 亞 系）［12-13］，而 內(nèi)部基因形成更多分支，組成不同的基因型［14］。

從進(jìn)化樹可以看出，本研究分離的14株病毒，除濟(jì)南分離株CK／SD／JN2外，其余13株病毒的HA和NA基因均屬于歐亞分支CK／BJ／94分支中的Y280亞系，與其他報(bào)道一致［15-16］。這13株病毒和山東省2006年分離株CK／SD／LY／06、2010年分離株 CK／SD／BD／10、2013年分離株 CK／RZ／853／13親緣關(guān)系較近，而與1996年分離株CK／SD／6／96、2000年分離株 CK／SD／1／00及代表株 CK／BJ／94（北京分離株）、CK／F／98（上海分離株）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，提示2006年-2013年分離株和1994年-2000年分離株在遺傳進(jìn)化上有了一定差異。但從發(fā)育樹上可知，所有分離的H9N2亞型AIV都屬于BJ／94分支，提示山東省 H9N2亞型AIV HA基因、NA基因可能處在一個比較穩(wěn)定的遺傳演化過程。

將山東分離株與不同地域分離株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析顯示，AIV H9N2亞型山東分離毒株與國內(nèi)不同地域分離的H9N2亞型毒株遺傳進(jìn)化并沒有表現(xiàn)出特殊的地域偏好性，與地理位置相距較遠(yuǎn)的廣東、浙江、上海、湖南等地方分離毒株同源性亦較高。病毒是通過候鳥還是運(yùn)輸發(fā)生傳播是值得研究的一個方面，明確病毒的傳播途徑和方式對山東地區(qū)禽流感的控制和預(yù)防具有重要意義。

20世紀(jì)90年代以來，我國大陸各地相繼發(fā)生了H9N2亞型禽流感疫情，使用疫苗后該病得到了較好的控制，臨床上該病毒的分離率明顯下降。但近幾年來，該病毒在國內(nèi)養(yǎng)殖場廣泛流行。有學(xué)者對當(dāng)前疫苗的免疫效力產(chǎn)生了懷疑，因?yàn)楝F(xiàn)有疫苗株基本上分離自20世紀(jì)90年代，隨著HA蛋白抗原漂移，現(xiàn)有疫苗株已不能有效保護(hù)流行株的感染［17］。從本研究14株病毒的HA基因、NA基因序列的遺傳進(jìn)化分析可以看出，2010年之后分離株的遺傳距離較近，而與目前中國廣泛使用的H9N2亞型禽流感滅活苗的種毒株 CK／SH／F／98 、Ck／SD／6／96雖同位于BJ／94分支，但具有較遠(yuǎn)的遺傳距離（圖2）。因此，疫苗株與流行株之間的抗原差異可能是導(dǎo)致近年來H9亞型禽流感免疫保護(hù)效果不好的重要原因之一。這提示制備疫苗時，要采用流行毒株作為種毒才能產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)。

圖2 H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA基因的遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees of HA and NA genes of H9N2AIV

HA和NA基因相對頻繁的變異，使得低致病力流感病毒基因重組后可能成為毒力較強(qiáng)的毒株，多數(shù)H9亞型AIV的受體結(jié)合位點(diǎn)226位均為L，具有人受體結(jié)合特異性，對公共健康具有潛在的重大威脅［18-19］。所以在今后的工作中，加強(qiáng)對H9N2亞型AI的流行病學(xué)監(jiān)測是非常必要的。

本研究通過對山東省2013年不同地方分離的H9N2亞型AIV的HA和NA基因遺傳進(jìn)化分析，豐富了山東省雞源禽流感流行病學(xué)信息，為了解山東省流行的H9N2亞型AIV的變異情況，指導(dǎo)禽流感疫情防控以及篩選疫苗病毒株提供了依據(jù)。

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