小鼠RSP3基因序列分析及其亞細(xì)胞定位

成欣然，顏潤川，胡新德，宋玲珍，張 偉，張亞妹，陳樹林，趙善廷

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

RSP3（radial spoke protein 3）是一個(gè)與鞭毛微管組裝相關(guān)的基因，于1989年首次在衣藻中被克隆出來，衣藻pf14突變體由于缺少RSP3而發(fā)生鞭毛組裝缺陷［1］。衣藻鞭毛外周微管與中心微管之間以放射輻相連，衣藻pf14突變體由于缺少RSP3蛋白而導(dǎo)致整個(gè)放射輻不能組裝，因此推測RSP3可能直接與微管相結(jié)合，起到錨定整個(gè)放射輻的作用［2］。衣藻鞭毛放射輻起著從中心微管向外周微管傳遞信號的作用，放射輻缺陷突變體對外界環(huán)境更為敏感，如Ca2＋濃度和cAMP 濃度等［3］。人們以衣藻為材料，通過RⅡblot overlays試驗(yàn)證明RSP3是一個(gè)A 型 激 酶 錨 定 蛋 白（A－kinase anchoring protein，AKAP），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)RSP3 就是AKAP97［4］。AKAPs是功能上相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白家族，具有結(jié)合PKA 的保守區(qū)和引導(dǎo)AKAP－PKA 復(fù)合體到亞細(xì)胞位點(diǎn)的靶向區(qū)，AKAP不僅與PKA 相互作用，也與其他信號分子作用。

衣藻RSP3在小鼠中的同源基因于2004 年首次被克隆出來，其在小鼠基因組中的總跨度為230kb，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，通過原位雜交技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠RSP3大量表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)中，然而其在細(xì)胞內(nèi)的分布特點(diǎn)和功能尚不清楚［5］。酵 母 雙 雜 交 試 驗(yàn) 表 明，RSP3 作 為 一 個(gè)AKAP，能 與ERK1／2 結(jié) 合，從 而 有 可 能 整 合ERK1／2與PKA 信號通路［6］。AKAP－PKA 復(fù)合體可匯集和整合來自各種通路的信號，該復(fù)合體不僅可局部增強(qiáng)cAMP 和其他信號，還可以通過降低PKA 的基礎(chǔ)活性，發(fā)揮遠(yuǎn)程效應(yīng)。

哺乳動物的纖毛和真核生物的鞭毛在結(jié)構(gòu)上是一致的，哺乳動物纖毛結(jié)構(gòu)缺陷可導(dǎo)致多種疾病，如生殖能力降低，視覺、嗅覺、聽覺的減退，呼吸系統(tǒng)易感染，肝腎的多囊性增生等［7－8］。RSP3作為纖毛結(jié)構(gòu)的重要組成部分，對維持纖毛結(jié)構(gòu)的完整性至關(guān)重要，提示RSP3可能參與多種信號通路，與多種疾病密切相關(guān)。然而，目前有關(guān)哺乳動物中RSP3的研究甚少。本研究通過對多個(gè)物種RSP3蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對分析，并對其功能域進(jìn)行預(yù)測，初步推測其功能及定位。為了進(jìn)一步研究其可能的功能，構(gòu)建了小鼠RSP3 的GFP 融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞，對RSP3與微管進(jìn)行共定位研究。同時(shí)將RSP3－GFP 轉(zhuǎn) 染CHO 細(xì) 胞 后 用 KEDL 和GM130分別標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。我們發(fā)現(xiàn)RSP3－GFP并不定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體，而是聚集于胞質(zhì)中。以上結(jié)果表明在哺乳動物細(xì)胞中RSP3并不能直接與微管結(jié)合，也不分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體等細(xì)胞器，而是聚集在細(xì)胞核周圍的胞質(zhì)中，這為進(jìn)一步深入研究RSP3在哺乳動物中的功能奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 C57BL／6J小鼠購自西安交通大學(xué)，飼養(yǎng)于西北農(nóng)林科技大學(xué)超凈鼠房，3月齡開始交配，以可見陰道栓開始記為E0.5（embryo day 0.5），到E18.5時(shí)取胚胎腦組織用于提取RNA。中國 倉 鼠 卵 巢 細(xì) 胞 系 （Chinese hamster ovary，CHO）、pCAG－MCS－GFP空載體（由pCAG－MCS載體經(jīng)BglⅡ單酶切后加入GFP 編碼序列改造而成）和Escherichia coli DH5α菌種由西北農(nóng)林科技大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、HindⅢ、BglⅡ及T4DNA 連接酶、pGEM－T Easy載體、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品；X－tremeGENE HP 轉(zhuǎn) 染 試 劑 為Roche 公 司 產(chǎn)品；TRIzol及總RNA 提取相關(guān)試劑、胎牛血清、F－12K Nutrient Mixture、DMEM、Opti－MEM、胰蛋白酶、HEPES、青霉素、鏈霉素為Life Technology 公司產(chǎn) 品；mouse anti－GM130、mouse anti－GAPDH、donkey anti－mouse－HRP為Sigma公司產(chǎn)品；mouse anti－KDEL 為Santa cruz公 司 產(chǎn) 品；DAPI、mouse anti－α－tubulin、donkey anti－mouse－568 為Millipore公司產(chǎn)品；引物合成及DNA 測序由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 按照Life Technology公司RNA 提取試劑盒上的說明書操作步驟提取組織樣品總RNA，經(jīng)超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度后，保存于－80 ℃冰箱備用。取總RNA 各2.5μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為：總RNA 2.5μg，5×Reaction buffer 4 μL，Oligo（dT）2 μL，10mmol／L dNTPs 1 μL，RNase Inhibitor 1 μL，RT－Enzmye 1μL，用DEPC水補(bǔ)足20μL。42 ℃反應(yīng)1h，70 ℃5min滅活，保存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠RSP3 基因克隆 根據(jù)NCBI公布的RSP3 基 因 序 列 號（GenBank Accession Number NM 025789.5）及pCAG－MCS表達(dá)載體酶切圖譜設(shè)計(jì)RSP3特異性引物，在上、下游分別加入BamHⅠ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，并加入保護(hù)性堿基（下劃線部分），在上游引物中加入GCCACC 基序。上游引 物 RSP3－F：5′－GGATCCGCCACCATGGCCGCCACCAACATTTG－3′；下游引物RSP3－R：5′－AAGCTTGGCTCTGCCATAAGGTGTCCC－3′。以E18.5小鼠腦組織提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進(jìn)行PCR，得到RSP3基因片段。

1.2.3 RSP3 真核表達(dá)載體構(gòu)建 PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳后用DNA 凝膠回收試劑盒回收純化，將回收產(chǎn)物與pGEM－T Easy載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，取100μL 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于預(yù)先涂有5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D 半乳糖苷（5－bromo－4－chloro－3－indolylβ－D－galactopyranoside，X－gal）和 異 丙 基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ－D－1－thiogalactopyranoside，IPTG）的含有100 mg／L 氨芐青霉素的LB 瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)菌落，180r／min，37 ℃搖床上振蕩培養(yǎng)過夜進(jìn)行擴(kuò)增，菌液PCR 和酶切鑒定后挑選陽性克隆送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測序。將測序結(jié)果與NCBI上公布的序列比對分析，將完全正確的克隆命名為pGEM－T－RSP3。將pGEM－T－RSP3 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)后 提 取 質(zhì) 粒，對pGEM－T－RSP3 和pCAG－MCSGFP質(zhì)粒用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，回收產(chǎn)物在T4DNA 連接酶作用下于16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)菌，轉(zhuǎn)化的菌液涂布于含100 mg／L 卡那霉素的LB 平板上培養(yǎng)，次日挑取單克隆，菌液PCR 和酶切鑒定后挑選陽性克隆送至金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，將獲得的正確克隆命名為pCAG－RSP3－GFP。

1.2.4 RSP3序列分析與蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測 根據(jù)NCBI上發(fā)布的多物種RSP3核苷酸和氨基酸序列（表1），通過DNA Man軟件分析RSP3 核苷酸和氨基酸序列，分析RSP3在進(jìn)化中的保守序列，同時(shí)通過Smart軟件預(yù)測RSP3可能存在的結(jié)構(gòu)域。

表1 GenBank中不同物種RSP3核酸和蛋白序列號Table 1 Nucleotide and protein numbers of RSP3in different organisms from GenBank

1.2.5 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入適量的F12－K 細(xì)胞培養(yǎng)液并接種CHO 細(xì)胞，混勻后置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前將CHO 細(xì)胞傳代至提前放有細(xì)胞爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其匯合度達(dá)70%左右用X－tremeGENE HP轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作按照XtremeGENE HP轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光染色 將轉(zhuǎn)染后24h的細(xì)胞取出，用40mL／L的多聚甲醛溶液固定30 min，經(jīng)1mL／L Triton X－100 透化、10 mL／L 的羊血清 封閉后，用0.1mol／L PB 洗滌3次，每次10min。在不同樣品中分別加入mouse anti－α－tubulin、mouse anti－KDEL、mouse anti－GM130，4 ℃過 夜 孵 育，0.1mol／L PB沖洗3次，每次15min，然后加入Alexa Fluor 568donkey anti－mouse IgG 熒 光 標(biāo) 記 二抗，室溫孵育3h。加入1μg／mL DAPI對胞核進(jìn)行染色，室溫下孵育3min，0.1 mol／L PB 沖洗3 次，每次15min，染色結(jié)束后用抗熒光淬滅劑（Dako）封片，置于蔡氏倒置熒光顯微鏡下拍照觀察分析。

2 結(jié)果

2.1 RSP3 基 因 擴(kuò) 增 及pCAG－RSP3－GFP 表 達(dá) 載體構(gòu)建

以小鼠胚胎18.5d（E18.5）腦組織提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 模板，PCR 擴(kuò)增RSP3基因，產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳，在約1 500bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，陰性對照組（以水為模板）未見擴(kuò)增條帶（圖1）。將目的片段回收后連接pGEM－T Easy載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌中擴(kuò)增，提取pGEM－TRSP3質(zhì)粒用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，得到預(yù)期的2個(gè)條帶，3 100bp左右的為pGEM－T Easy載體片段，1 500bp 左右的為RSP3 基因片段（圖2），回收RSP3 基因片段與同樣雙酶切的pCAGMCS－GFP載體連接。重組質(zhì)粒載體pCAG－RSP3－GFP經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，電泳檢測得到2個(gè)條帶，5 800bp左右的條帶為pCAG－MCS－GFP載體，1 500bp左右的條帶為RSP3基因片段（圖3）。

2.2 RSP3序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

用DNA Man軟件將小鼠的RSP3氨基酸序列與NCBI上公布的其他物種的RSP3氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明小鼠RSP3氨基酸序列與大鼠、獼猴、人類、斑馬魚和非洲爪蟾的RSP3氨基酸序列同源性 分 別 為86.9%、76.1%、66.1%、61.7%和61.1%（圖4A）。這些物種的RSP3氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)有一段進(jìn)化過程中高度保守序列，這段序列有可能與RSP3的功能密切相關(guān)（圖4B）。用SMART軟件對小鼠的RSP3蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果表明在RSP3的N－端有一個(gè)Coil－coil結(jié)構(gòu)域，中間部分為RSP3結(jié)構(gòu)域，其余部分無明顯結(jié)構(gòu)域（圖4C）。

圖1 RSP3基因PCR 擴(kuò)增電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme digestion of recombinant plasmid pGEM－T－RSP3

圖3 重組質(zhì)粒pCAG－RSP3－GFP酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme digestion analysis of pCAG－RSP3－GFP

圖4 RSP3序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Sequence analysis and domain prediction of mouse RSP3

2.3 RSP3在CHO 細(xì)胞中表達(dá)

小鼠RSP3是衣藻RSP3的同源基因，在衣藻中RSP3可與鞭毛微管結(jié)合，通過SMART 軟件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)小鼠RSP3有一個(gè)RSP3結(jié)構(gòu)域。為了研究哺乳動物RSP3 是否直接與微管結(jié)合，通過培養(yǎng)CHO 細(xì)胞，制作細(xì)胞爬片并轉(zhuǎn)染pCAG－RSP3－GFP重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24h用PFA 固定，用tubulin單克隆抗體標(biāo)記微管，在熒光顯微鏡下可見在CHO 細(xì)胞中微管作為骨架分布于整個(gè)細(xì)胞，但RSP3－GFP并不與微管相結(jié)合，而是呈聚集狀態(tài)分布于細(xì)胞內(nèi)（圖5F），GFP 對照組呈均勻彌散的分布狀態(tài)（圖5C）。進(jìn)一步分析其分布特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，RSP3－GFP主要分布在細(xì)胞核的周圍，聚集成有一定體積的顆粒。

2.4 RSP3在CHO 細(xì)胞中的分布特點(diǎn)

在CHO 細(xì)胞中RSP3并未與微管相結(jié)合，而其分布形態(tài)與細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)相似，為了進(jìn)一步研究RSP3在細(xì)胞中的亞定位，本試驗(yàn)通過不同的細(xì)胞器特異性標(biāo)記抗體對RSP3進(jìn)行亞細(xì)胞定位。pCAGRSP3－GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞后，用KDEL抗體對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行標(biāo)記，用GM130抗體對高爾基體進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)合RSP3－GFP綠色熒光，在熒光顯微鏡下觀察RSP3在CHO 細(xì)胞中的亞定位。在熒光顯微鏡下可觀察到RSP3－GFP 綠色熒光信號并不與KDEL紅色熒光信號重合，而是比KDEL 分布更集中更靠近細(xì)胞核（圖6）。高爾基體特異性標(biāo)記GM130與RSP3－GFP也不重合，而是呈現(xiàn)出一定的交錯(cuò)狀態(tài)，即RSP3－GFP空隙處正好有GM130標(biāo)記信號，而且GM130 信號分布在細(xì)胞核的一端，而RSP3－GFP環(huán)繞細(xì)胞核的周圍都有分布（圖7）。以上結(jié)果表明RSP3聚集分布于胞質(zhì)中，而且不與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體結(jié)合。

圖5 小鼠RSP3重組蛋白在CHO 細(xì)胞中表達(dá)Fig.5 The expression of RSP3in CHO cells

圖6 熒光雙標(biāo)RSP3和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Fig.6 Co－label of RSP3－GFP and endoplasmic reticulum

圖7 RSP3與高爾基體共定位分析Fig.7 Co－label of RSP3－GFP and Golgi apparatus

3 討論

RSP3于1989年首次在衣藻中被克隆，并被證明是一個(gè)鞭毛相關(guān)蛋白，參與鞭毛的組裝，然而其在小鼠中的同源基因一直到2004年才被首次克隆出來［1，5］。在 衣 藻 中，RSP3 作 為 一 個(gè)AKAP 通 過 與PKA 全酶的RⅡ亞基的RⅡa區(qū)域結(jié)合而局域化調(diào)控PKA，調(diào)節(jié)纖毛和鞭毛的運(yùn)動［4］。在進(jìn)化過程中，高等植物基本上已經(jīng)失去了纖毛和鞭毛結(jié)構(gòu)，但哺乳動物卻保留了纖毛。哺乳動物的纖毛分為可動纖毛和原始纖毛?？蓜永w毛主要分布于肺上皮、輸卵管、室管膜及精子鞭毛，為“9＋2”結(jié)構(gòu)，主要與運(yùn)動相關(guān)，而原始纖毛幾乎存在于所有細(xì)胞，為“9＋0”結(jié)構(gòu)，主要與細(xì)胞感受外界環(huán)境及信號傳遞相關(guān)［9］。哺乳動物RSP3是否也是纖毛的結(jié)構(gòu)蛋白，是否也參與纖毛運(yùn)動的調(diào)控及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在進(jìn)化過程中其功能發(fā)生了哪些變化，目前尚無相關(guān)研究。

通過氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，小鼠RSP3 與衣藻RSP3在結(jié)構(gòu)上有些不同，這可能是在進(jìn)化過程中該基因的功能發(fā)生了改變。哺乳動物中RSP3的N－端比衣藻多出127個(gè)氨基酸，而其功能尚不清楚，也許是進(jìn)化過程中對其功能的補(bǔ)充。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，在RSP3的N－端有一個(gè)Coil－coil結(jié)構(gòu)域，中間部分為RSP3結(jié)構(gòu)域，其余部分無明顯結(jié)構(gòu)域。Coil－coil結(jié)構(gòu)功能多樣，在不同的蛋白中其功能往往不同，而RSP3結(jié)構(gòu)域是一個(gè)可能與微管結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，由此可推測RSP3有可能與微管相結(jié)合。衣藻RSP3通過其N－端的RSP3結(jié)構(gòu)域結(jié)合于放射輻上，這提示我們在哺乳動物細(xì)胞中RSP3 也可能與微管相結(jié)合。我們通過表達(dá)小鼠RSP3與微管共定位，發(fā)現(xiàn)其并不與微管結(jié)合，微管分布于整個(gè)細(xì)胞，構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的骨架，而RSP3聚集分布于細(xì)胞內(nèi)。其繞核分布的特點(diǎn)提示我們，RSP3可能錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或是高爾基體上。本研究通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性Maker KDEL和高爾基體特異性Maker GM130，將RSP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體共定位，結(jié)果表明RSP3并未錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或是高爾基體上，而是以聚集狀態(tài)分布于細(xì)胞質(zhì)中。

在衣藻中的研究表明，RSP3能與多種蛋白相結(jié)合組成放射輻，從中心鞘向外周二聯(lián)體微管傳遞信息調(diào)節(jié)鞭毛的運(yùn)動，在衣藻RSP3的PKA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域突變體中，由于RSP3不能與PKA 結(jié)合而導(dǎo)致運(yùn)動障礙［10－11］。在錐蟲中的研究表明，RSP3還參與調(diào)節(jié)動力蛋白的運(yùn)動從而調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂過程，有學(xué)者通過酵母雙雜交的方法證明RSP3能與ERK1／2結(jié)合，表明RSP3可能參與了細(xì)胞分裂的信號傳遞或是通過纖毛感覺外界環(huán)境的變化調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的過程［6，12］。纖毛或鞭毛運(yùn)動的調(diào)節(jié)是通過動力蛋白的磷酸化和去磷酸化來調(diào)節(jié)的，而RSP3 作為一個(gè)AKAP，在動力蛋白磷酸化調(diào)節(jié)及纖毛運(yùn)動過程中扮演者非常重要的角色［13］。衣藻RSP3有兩個(gè)兩親結(jié)構(gòu)域，形成一個(gè)同源二聚體，能與含有Dpy－30結(jié)構(gòu)域的蛋白互作［14］。這些結(jié)果提示我們RSP3可能不僅僅是一個(gè)纖毛的組成結(jié)構(gòu)，還可能參與了多種信號的傳遞和整合。

本研究首次通過在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)RSP3，研究其分布特點(diǎn)和可能的功能，結(jié)果表明，哺乳動物RSP3與衣藻相比存在著一些相同之處，也存在著很大的差異，這可能是在進(jìn)化過程中其功能發(fā)生了一定的改變。在CHO 細(xì)胞中表達(dá)RSP3 后發(fā)現(xiàn)其聚集程度很高，可能為蛋白多聚體，而衣藻中RSP3只是形成二聚體，聚集程度相對很低。哺乳動物細(xì)胞更為復(fù)雜，功能更多樣，哺乳動物RSP3 與衣藻RSP3蛋白結(jié)構(gòu)的差異性和保守性可能決定了其功能的差異性與相似性。衣藻中RSP3與多種蛋白互作，那么在哺乳動物中相對應(yīng)的同源基因間是否存在互作，哺乳動物大多數(shù)細(xì)胞保留了纖毛結(jié)構(gòu)，RSP3是否也構(gòu)成哺乳動物纖毛的結(jié)構(gòu)成分，這些都還有待進(jìn)一步研究。本研究通過構(gòu)建RSP3表達(dá)載體，并在CHO 細(xì)胞中表達(dá)，探討了哺乳動物RSP3的基本性質(zhì)和在細(xì)胞中的表達(dá)及定位情況，為研究RSP3在進(jìn)化過程中的功能演變提供了一定的線索，也為進(jìn)一步深入研究其在哺乳動物細(xì)胞和機(jī)體內(nèi)的功能奠定了基礎(chǔ)。

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