一株扭角羚弗格森埃希菌的分離鑒定及藥敏試驗

葉 泥，權(quán)自芳，王 彬，諶利民，楊 艷，顏其貴＊

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川雅安625014；2.四川省廣元市青川縣青溪鎮(zhèn)唐家河管理處，四川廣元628019）

扭角羚又稱羚牛，是我國一級保護動物，并被列入瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約附錄Ⅱ，一共有4個亞種，其中秦嶺亞種和四川亞種為中國所特有。它屬于?？蒲騺喛疲踩壕?，常年棲息于高海拔的高山懸崖地帶。弗格森埃希菌（Escherichiafergusonii）屬于腸桿菌科埃希菌屬，存在于自然環(huán)境及人和動物腸道內(nèi)，是人和動物少見的條件致病菌［1］，能引起人和動物菌血癥、創(chuàng)傷感染、胸膜感染和腹瀉等疾病。目前，國內(nèi)關(guān)于此菌的報道不多。2013年，陶元勇等［1］從一名惡性腫瘤患者術(shù)后感染傷口中分離出弗格森埃希菌。此外，有報道指出在患者的痰液［2］、中段尿［3］、肺膿腫液［4］中都分離到該菌，由此提示當(dāng)機體的抵抗能力下降時，此菌能使人患病或繼發(fā)感染而加重其他疾病。2005年，Herrez P等［5］從一只死亡鴕鳥的壞死組織中只分離到弗格森埃希菌，并證實該菌使鴕鳥患上壞死性盲腸炎，并致其死亡。2007年，Hariharan H 等［6］從腹瀉山羊的糞便中分離出弗格森埃希菌，并從肝、腎、腸、肺中也分離出相同菌株。進一步說明了該菌的致病性。有研究顯示，近年來弗格森埃希菌對用于治療腸道細菌感染的抗菌藥物有耐受性，并且其耐藥表型與大腸埃希菌十分相似［7-8］。本研究從野生扭角羚肝臟中分離鑒定出了弗格森埃希菌，并進一步做了生化和藥敏分析，以期為弗格森埃希菌的研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 采自2014年四川省某自然保護區(qū)1只死亡的青壯年扭角羚的心、肝、脾、肺、腎，送到本實驗室做自然生存過程中致病性細菌的檢測，以期尋找扭角羚死亡原因。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清為Invitrogen公司產(chǎn)品；MH固體培養(yǎng)基、山梨醇麥康凱培養(yǎng)基、抗菌藥物紙片及生化反應(yīng)微量管為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Master-Mix、DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000為OMEGA公司產(chǎn)品；引物合成和測序均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng)與純化 將組織塊無菌條件下，取心、肝、脾、肺、腎深部組織小塊。接觸于加有100mL／L胎牛血清的LB固體培養(yǎng)基中并用波爾劃線進行初步分離，培養(yǎng)24h后，只有肝臟樣品接種的培養(yǎng)基上長出了細菌，對該菌進一步分離培養(yǎng)。無菌挑取由肝臟初步分離得到的單個菌落接種于含100mL／L胎牛血清的LB固體培養(yǎng)基中進一步分離純化，37℃培養(yǎng)24h后，挑選單個菌落，取單個菌落的一半進行革蘭染色，另一半再次接入含100mL／L胎牛血清的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，選取菌落，將單個菌落的一半接種于含100mL／L胎牛血清的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24h，菌液用于涂布MH培養(yǎng)基，另一半用于菌落PCR擴增16SrDNA。

1.2.2 16Sr DNA的PCR 擴增 試驗中共選取了3個獨立菌落進行菌落PCR，引物為16SrDNA的通用引物，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，上、下游引物各1.5μL，2×TaqPCR Master Mix 20μL，ddH2O 27μL，最后用槍頭挑入單個菌落，輕輕吹打混勻，最終反應(yīng)體系為50μL。PCR擴增程序為：95 ℃ 10min；95 ℃ 30s；53 ℃ 30s；72 ℃90s，30個循環(huán)；72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。取10μL進行瓊脂糖凝膠電泳，余下的PCR產(chǎn)物送出測序，測序后將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析。

1.2.3 生化試驗 將純培養(yǎng)的單個菌落接種于腸桿菌科細菌生化微量鑒定管和山梨醇麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后觀察試驗結(jié)果。

1.2.4 藥敏試驗 藥敏試驗采取紙片擴散法，使用臨床常用于動物疾病治療的藥物紙片，在無菌條件下，用棉簽沾取菌液均勻涂布于MH培養(yǎng)基，貼上藥敏紙片，將培養(yǎng)皿放于培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24h后，測量各抑菌環(huán)直徑。結(jié)果判定參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 細菌形態(tài)

初步分離所得的細菌，在含100mL／L胎牛血清的LB固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后，呈白色、濕潤、光滑菌落。革蘭染色鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體為長短不一的陰性桿菌，呈細絲、彎曲狀（圖1）。培養(yǎng)48h后，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體細長，多成彎曲狀。在山梨醇麥康凱培養(yǎng)基上能生長，并有膽鹽析出，形成較小的紅色、渾濁菌落。

圖1 培養(yǎng)后的分離菌株形態(tài)（革蘭染色，10×100）Fig.1 Escherichia fergusonii＇s morphology after culture（Gram staining，10×100）

2.2 16SrDNA的序列分析

菌株16Sr DNA PCR擴增條帶大小為1 410bp，Blast比對結(jié)果表明其與弗格森埃希菌的同源性超過99%，初步判定該菌株為弗格森埃希菌，菌落PCR電泳圖見圖2。

圖2 弗格森埃希菌16SrDNA的菌落PCR擴增結(jié)果Fig.2 Colony PCR amplification of Escherichia fergusonii 16SrDNA

2.3 生化特性

乳糖、甘露糖、麥芽糖、氨對、靛基質(zhì)、甲基紅、吲哚、動力、硝酸鹽還原和枸櫞酸鹽生化反應(yīng)呈陽性。賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、硫化氫、衛(wèi)矛醇、苯丙氨酸、尿素、蔗糖及VP反應(yīng)呈陰性，葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣（表1）。結(jié)合16SrDNA序列分析結(jié)果，確定分離菌為弗格森埃希菌。

表1 分離株生化反應(yīng)結(jié)果Table 1 The results of biochemical reactions of strain

2.4 藥敏試驗結(jié)果

本次所得的弗格森埃希菌分離株對環(huán)丙沙星、氟苯尼考、頭孢他啶、丁胺卡那等敏感，對氨芐西林耐藥（表2）。

表2 藥敏試驗結(jié)果Table 2 The results of drug sensitivity test

3 討論

目前，對弗格森埃希菌的了解較少，只有少量報告稱該菌能使人和動物致病或死亡［5-6］，本研究中的菌株是從死亡的扭角羚肝臟中分離所得，可能為致死此扭角羚的病源菌。細菌16Sr DNA序列長度適宜且保守區(qū)域在細菌進化過程中高度保守，這為鑒定不同種屬的細菌提供了科學(xué)依據(jù)。通過對分離株16Sr DNA序列的測序和與數(shù)據(jù)庫中已有的序列比對，就可確定出分離株的種屬地位，從而彌補了僅依靠細菌形態(tài)、生化特性等傳統(tǒng)方法判定的不足，本研究中獲得的分離菌經(jīng)細菌16SrDNA測序分析和生化特性鑒定，確定該分離株為弗格森埃希菌。

本次從肝臟中獲得的分離菌株與陶元勇等［1］對弗格森埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC35469的生化反應(yīng)結(jié)果存在一定差異，分離株的賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶生化反應(yīng)為陰性而標(biāo)準(zhǔn)株為陽性。此結(jié)果可能是由地域生態(tài)環(huán)境的差異和細菌生化反應(yīng)的不確定性造成［9］。

根據(jù)已有文獻認為弗格森埃希菌逐漸對用于治療腸道細菌感染的抗菌藥物有耐受性［7-8，10］。本研究中使用了14種常見抗菌藥物對此分離株進行藥物敏感試驗，發(fā)現(xiàn)其只對氨芐西林有強耐藥性，而陸彥等［11］在雛雞中發(fā)現(xiàn)的弗格森埃希菌的藥物敏感試驗結(jié)果顯示，雛雞中分離的弗格森埃希菌對氨芐西林、恩諾沙星、四環(huán)素等高度耐藥，相比之下本研究中的弗格森埃希菌分離株的耐藥性要低很多，此結(jié)果可能是因野生動物很少接觸抗菌藥物所致。此次從扭角羚中分離到弗格森埃希菌不僅增加了該菌感染野生動物的資料，而且增加了弗格森埃希菌的致病性資料，為弗格森埃希菌研究積累了數(shù)據(jù)資料。

［1］陶元勇，孫銘艷，李建花，等.弗格森埃希菌的生物學(xué)特征研究與16SRrna檢測［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2013，8（3）：229-232.

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［5］Herrez P，Rodrquez A F.Espinosafergusoniiin ostriches（Struthiocamelus）［J］.Avian Dis，2005，49（1）：167-169.

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［11］陸 彥，趙紅玉，齊曉麗，等.弗格森埃希菌的鑒定及藥敏試驗［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2013，34（5）：48-51.