牦牛Toll樣受體10基因的克隆與分析

黃 偲，蘭道亮，林寶山，陳亞冰，黃 勇，李 鍵，＊

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都610041）

Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）是一類模式識別受體，廣泛表達(dá)于免疫系統(tǒng)，在機(jī)體先天免疫和適應(yīng)性免疫中起著重要的作用［1-2］。哺乳動物TLRs為Ⅰ型跨膜蛋白，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。因其胞外區(qū)與一種早期發(fā)現(xiàn)的果蠅蛋白Toll同源而得名［3］。Toll樣受體通過識別保守的病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMPs）來識別大量的異己抗原，從而啟動針對病原體的早期應(yīng)答，激活獲得性免疫反應(yīng)。TLR10分子作為TLRs家族重要成員，與TLR1和TLR6擁有近50%的表達(dá)相似性，證明了TLR基因在進(jìn)化中的保守性。但基因RACE產(chǎn)物測序和基因組序列比對結(jié)果顯示TLR1、TLR6分別包含6個、3個外顯子，而TLR10僅有1個外顯子。TLR10顯示出更強(qiáng)的功能分化能力，這與基因進(jìn)化是一致的。TLR10相對TLR1、TLR6基因更早從祖先基因里分離出來。TLR10的mRNA高度表達(dá)于脾、淋巴結(jié)、胸腺和扁桃體上，表明TLR10會優(yōu)先表達(dá)在與免疫應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞和組織［4］。目前，TLR10的配體及其功能機(jī)制尚不完全清楚，但已有研究顯示，TLR10與諸多疾病存在密切關(guān)聯(lián)，如哮喘病、結(jié)節(jié)病等，同時作為TLRs家族重要成員，其在抗感染中的重要作用亦不可忽視［5］。

牦牛（Bosgrunniens，Yak）作為生活在高原環(huán)境下的特有物種，其機(jī)體早已適應(yīng)了高原低氧、嚴(yán)寒等惡劣環(huán)境，可能存在特殊的抗病和免疫機(jī)制，因此對其免疫機(jī)制的研究具有重要意義。此外，近年來牦牛疫病有逐年上升的趨勢，嚴(yán)重阻礙了牦牛業(yè)的健康發(fā)展［6］。同時，牦牛作為高原特色物種，有其獨(dú)特的半野生放養(yǎng)模式，通常情況下藥物注射不適用于牧區(qū)操作，加之牦牛作為反芻動物，不宜口服抗生素，為保證牦牛產(chǎn)品天然綠色無污染的品質(zhì)，更應(yīng)主張以非給藥防治為主。因此，對牦?？共》肿訖C(jī)制進(jìn)行研究顯得尤為重要，一方面可以深入理解高原動物特有的免疫機(jī)制，另一方面也可為牦牛的抗病育種提供理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)通過RT-PCR技術(shù)首次克隆并得到牦牛TLR10基因的全長編碼區(qū)，并對獲得的目的基因進(jìn)行了序列分析，對進(jìn)一步研究天然免疫的調(diào)節(jié)機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動物 試驗(yàn)所用材料為牦牛心、肝脾、腎、胃、肌肉、乳腺、睪丸、卵巢、大腸和小腸組織，采自四川省廣漢市向陽屠宰場，牦牛來源地為四川省阿壩州紅原縣，屬于麥洼牦牛。

1.1.2 主要儀器和試劑 普通PCR儀、電泳儀、瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；LATaqDNA聚合酶、大腸埃希菌DH5α為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；pMD19-T克隆載體為TaKaRa公司產(chǎn)品；Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒為Axygen（北京）公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的牛Bostauruscytoglobin（TLR10）基因序列（登錄號為 NM-001206720.1），用 Premier 5.0軟件設(shè)計一對引物，引物序列與預(yù)期擴(kuò)增片段長度如表1，引物由上海Invitrogen公司合成。

表1 TLR10基因的引物序列Table 1 Primer sequences of TLR10genes

1.2.2 RNA的提取和cDNA合成 取牦牛心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、乳腺、睪丸、卵巢、大腸和小腸組織各0.1g，分別加入1mL Trizol液氮研磨提取總RNA，按照 Fermentas公司的 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄酶說明書，采用20μL體系：Oligo（dT）18 1μL，5×Reaction buffer 4μL，RibolockTMRnase Inhibitor（20μ／μL）1μL，10mmol／L dNTP Mix 2 μL，RevertAidTMMMuLV Reverse Transcriptase（200μ／μL）1μL，模板1μL，最后用RNase Free dH2O補(bǔ)足20μL，按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42℃60min、70℃5min，合成cDNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 目的基因的克隆 以獲得牦牛脾臟組織cDNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：cDNA 1μL，2×TaqMasteMix 12.5μL，上、下游引物各1μL，雙蒸水10μL。反應(yīng)條件：95℃5min；94℃45s，55 ℃ 45s，72 ℃ 3min，30個 循 環(huán)；72 ℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳查看擴(kuò)增結(jié)果，Axygen凝膠回收試劑盒回收純化目的產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并在Amp＋瓊脂平板上涂板，37℃培養(yǎng)后挑選單菌落，菌液PCR鑒定后，將陽性重組質(zhì)粒送往Invitrogen（上海）公司進(jìn)行測序。

1.2.4 TRL10基因組織表達(dá)檢測 利用Primer 5軟件，根據(jù)牦牛管家基因GAPDH序列設(shè)計參照引物；根據(jù)獲得的牦牛脾臟組織TRL10基因序列設(shè)計特異引物：采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測TRL10基因在不同組織的表達(dá)情況。反應(yīng)體系：95℃5min；94℃30s，58 ℃ 30s，72 ℃ 1min，35個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳查看擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 測序結(jié)果利用DNA Star、DNA Man、PBIL、Interpro等軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 牦牛TLR10基因克隆

牦牛TLR10基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1。由圖1可知，擴(kuò)增片段大小約為2 450bp，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符。將獲得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析，結(jié)果表明，該序列與其他物種的TLR10基因存在高度同源性，推測該序列為牦牛TLR10基因的編碼區(qū)。

圖1 牦牛TLR10基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplication result of yak TLR10gene

2.2 基本理化性質(zhì)分析

擴(kuò)增得到牦牛TLR10基因編碼區(qū)為2 328bp，通過expasy等生物信息學(xué)在線軟件對其基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，TLR10基因開放閱讀框全長2 328bp，編碼氨基酸776個，分子質(zhì)量196.3ku，理論等電點(diǎn)為4.94。氨基酸組成中，正電荷殘基為68個，負(fù)電荷殘基為83個，整個蛋白帶負(fù)電荷。

2.3 牦牛TLR10基因的組織表達(dá)譜

通過半定量RT-PCR技術(shù)對牦牛各組織中TLR10基因的表達(dá)進(jìn)行分析，如圖2，結(jié)果顯示，TLR10基因在牦牛心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、乳腺、睪丸、卵巢、大腸和小腸組織均有表達(dá)，這一結(jié)果與TLR家族其他基因在哺乳動物各主要組織中均有表達(dá)的現(xiàn)象一致，反映出TLR10基因在組織細(xì)胞中的重要性，推測TLR10基因可能同樣具備家族基因特征，在先天免疫和適應(yīng)性免疫中起著重要的作用［7］。

2.4 TLR10基因編碼產(chǎn)物親／疏水性，柔韌性／抗原性預(yù)測

用DNA Star軟件子程序Edit Seq和Pro stean對TLR10基因編碼產(chǎn)物的親／疏水性，柔韌性／抗原性進(jìn)行分析，由圖3可知，TLR10基因編碼產(chǎn)物含有293個親水性殘基和231個疏水殘基，因此推測其整體表現(xiàn)為親水性。柔韌性區(qū)域分布相對均勻?？乖砦粎^(qū)域較大，與柔韌性區(qū)域和表面可能性區(qū)域出現(xiàn)了較多的重疊區(qū)，這些區(qū)域相對易于變形，便于抗原、抗體的自由結(jié)合，可能是抗原位點(diǎn)的富集區(qū)［8］。

圖2 牦牛TLR10基因在各組織中的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 RT-PCR results of TLR10gene in yak tissues

圖3 牦牛應(yīng)激型TLR10基因親水性、柔韌性及抗原性的預(yù)測結(jié)果Fig.3 Predictive results of hydrophilicity，flexibility，surface probability and antigenicity of TLR10gene in yak

2.5 信號肽預(yù)測和分析

通常分泌蛋白及細(xì)胞膜蛋白都以前體物質(zhì)多肽的形式合成，其N末端含有作為通過膜時指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的氨基酸序列，即為信號肽。利用丹麥科技大學(xué)（DTU）的CBS服務(wù)器對蛋白質(zhì)序列的信號肽（signal peptide）進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示TLR10基因編碼的蛋白沒有信號肽，屬于非分泌型蛋白。

2.6 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

應(yīng)用在線軟件PBIL預(yù)測組成TLR10多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的3種類型，即α螺旋（Alpha helix）、延伸鏈（extended strand）和自由卷曲（random coil）的比例是33.12∶20.62∶46.26，表明蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋及自由卷曲兩種結(jié)構(gòu)元件組成，延伸鏈相對較少，β螺旋（Beta helix）則散布于整個蛋白質(zhì)中。利用SwissModeling對TLR10的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的同源建模（圖4），可見結(jié)構(gòu)中含有較多的α螺旋和自由卷曲，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本相同。

2.7 TLR10蛋白結(jié)構(gòu)域和蛋白功能位點(diǎn)預(yù)測

利用Interpro在線工具對牦牛TLR10蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果見圖5。該蛋白質(zhì)在N端有多個亮氨酸富集區(qū)域 LRRs（leucine rich repeat），LRRs是受體識別存在于病原體細(xì)胞表面的分子標(biāo)志，即與配體結(jié)合的特異部位其間有非LRR序列分隔；C端487-540氨基酸處有一個半胱氨酸富集區(qū)域，結(jié)合已知的TLRs基因產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測此結(jié)構(gòu)域?yàn)樵摰鞍卓缒^(qū)；C端596-743氨基酸處有一個Toll／IL-1R（Toll／IL-1receptor homologous region，TIR）功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)合已知的TLRs基因產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析，這一區(qū)域氨基酸結(jié)構(gòu)應(yīng)當(dāng)高度保守，是TLR10傳導(dǎo)信號的核心區(qū)域在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳遞，與天然免疫和獲得性免疫作用的發(fā)揮密切相關(guān)。

圖4 TLR10蛋白三級級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.4 The predictive results of tertiary structure of TLR10protein

圖5 TLR10蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 The structure domain analysis of TLR10protein

2.8 同源性分析

利用DNA Star軟件子程序 MegAlign的Clustal W 方法與GenBank中公布的部分物種TLR10基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果如圖6所示。牦牛TLR10基因序列與其他10個物種相比，同源性最高的是牛，高達(dá)94%，最低的是鴨嘴獸，為62.6%；與水牛、綿羊、山羊、梅花鹿的同源性都高于90%；與野豬、家犬、大猩猩、人、獼猴、狐蝠的同源性均高于85%；與家鼠的同源性為76.9%。該結(jié)果說明TLR10基因在哺乳動物間具有較高的保守性。

圖6 TLR10基因核苷酸序列同源性比較Fig.6 Homological alignment of TLR10gene nucleotide sequences

2.9 遺傳進(jìn)化樹

運(yùn)用MEGA 5.0軟件的Neighbor-Joining法，重復(fù)1 000次，將獲得的11個TLR10基因序列構(gòu)建Bootstrap驗(yàn)證的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖7所示。由圖7可見，牦牛與黃牛TLR10基因的親緣關(guān)系最近，并與山羊、綿羊、水牛、梅花鹿、野豬形成偶蹄目哺乳動物的一個分支，人、大猩猩、獼猴形成的跟牦牛較近的靈長目分支，而鴨嘴獸代表的原獸亞綱動物與牦牛的遺傳距離最遠(yuǎn)。

圖7 TLR10基因的核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of TLR10gene nucleotide sequences

3 討論

隨著對TLRs的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)從低等到高等不同進(jìn)化層次的動物體內(nèi)都可查到TLRs的存在，提示這是一個生命體古老的防御機(jī)制。雖然仍有部分TLRs的功能及機(jī)制還未被人所認(rèn)識，但從已知的TLRs功能來看，TLRs在介導(dǎo)機(jī)體固有性免疫應(yīng)答、促使機(jī)體免疫系統(tǒng)在抵御病原體入侵的早期就開始啟動，并且在誘生多種促炎癥細(xì)胞因子的同時，也使免疫細(xì)胞表達(dá)出多種膜表面分子［9-11］。TLR10分子作為TLRs家族重要成員，顯示出較其他相似成員更強(qiáng)的功能分化能力，同時鑒于TLR10在不同組織均有表達(dá)，其對于機(jī)體免疫重要性不言而喻。已有研究證明TLR10在炎癥識別過程中的介導(dǎo)作用，證實(shí)了TLR10基因優(yōu)先表達(dá)在和免疫應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞和組織上［12］。而關(guān)于其相關(guān)配體組成及詳細(xì)作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)相信亦只是時間問題。

牦牛作為我國青藏高原特色物種，在高原人民生活中扮演著重要角色。但是近年來牦牛疫病發(fā)生率逐年上升，嚴(yán)重影響牦牛存活率和單重，直接威脅牧民的經(jīng)濟(jì)命脈。此外，牦牛乳作為牧民群眾主要的生活飲食品，其對提高飲食檔次，改善膳食結(jié)構(gòu)，提供營養(yǎng)成分等方面起著重要作用。泌乳期牦牛易患乳房炎，不僅降低產(chǎn)奶量，造成經(jīng)濟(jì)損失，而且影響奶品質(zhì)量，危害牧民健康。TLRs作為一種模式識別受體，不僅在天然免疫中起重要作用，同時也被視為天然免疫與獲得性免疫的“橋梁"。目前已有多個TLRs家族基因被證明對牛多種疾病有重要意義。牦牛TLR10基因組織表達(dá)譜結(jié)果顯示，TLR10在組織中普遍表達(dá)，而相關(guān)研究對牦牛雄性生殖器官中TLR10的相對高表達(dá)也提示該基因可能對牦牛生殖疾病有著特殊意義［13］。因此，對TLR10基因的研究，在獸醫(yī)相關(guān)研究方面可望明確病原體被其識別的本質(zhì)，闡明其天然免疫機(jī)制，為尋找由于免疫系統(tǒng)失調(diào)所致疾病的治療新途徑及靶點(diǎn)提供新的思路，為解決牦牛疾病問題提供綠色解決方案。

目前已有研究顯示在牛、豬等哺乳動物中TLR10基因均存在一定的多態(tài)性［14-15］，在人類身上已發(fā)現(xiàn)TLR10基因的多態(tài)性與某些疾病發(fā)病密切相關(guān)［16］。本試驗(yàn)限于樣品來源地及數(shù)量限制，并未發(fā)現(xiàn)TLR10編碼區(qū)的多態(tài)性，但牦牛不同品種存在明顯地域限制，故而牦牛TLR10基因多態(tài)性亦值得進(jìn)一步研究。牦牛與其他物種TLR10基因編碼區(qū)序列具有較高的同源性，TLR10基因進(jìn)化上高度保守。參考TLRs家族其他基因相關(guān)研究，推測牦牛TLR10基因與其他物種的差異性可能存在于表觀遺傳學(xué)方面［17］。此外，堿基的差異是否對TLR10基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生功能影響亦值得進(jìn)一步研究。TLR10基因編碼區(qū)的克隆及生物信息學(xué)分析將為后續(xù)研究牦牛的免疫機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

［1］Akira S，Uematsu S，Takeuehi O.Pathogen recognition and innate immunity［J］.Cell，2006，124（4）：783-801.

［2］張立春，王全凱，陳尚武.梅花鹿TLR10基因克隆與序列分析［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，41（1）：116-120.

［3］李 拓，儲明星，王金玉.荷斯坦母牛TLR10基因PCR-SSCP分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（12）：81-84.

［4］王 軍，趙迎飛，方正鋒，等.飼糧中添加蘇氨酸和色氨酸對接種豬繁殖與呼吸綜合征弱毒苗生長豬免疫反應(yīng)的影響［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2013，25（6）：1189-1198.

［5］Govindaraj R GManavalan BLee G.Molecular modelingbased evaluation of hTLR10and identification of potential ligands in toll-like receptor signaling［J］.PLoS One，2010，5（9）：1-13.

［6］孫西峰，沈延銀.牦牛隱性乳房炎發(fā)病情況的調(diào)查［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志，2003，39（3）：27-28.

［7］王樹茂，蘭道亮，陳亞冰，等.牦牛HSPA1A和HSPA2基因組織表達(dá)分布的檢測［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（12）：139-144.

［8］林寶山，蘭道亮，王樹茂，等.牦牛神經(jīng)珠蛋白基因的克隆及序列分析［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（1）：64-68.

［9］Abad C，Gonzdlez-Escribano M F，Diaz-Gallo L M，et al.Association of Toll-like receptor 10and susceptibility to Crohn＇s disease independent of NOD2［J］.Genes Immun，2011，12（8）：635-642.

［10］韓正強(qiáng)，王楠楠.Toll樣受體的研究進(jìn)展［J］.畜牧與獸醫(yī)，2011，43（12）：93-96.

［11］Lee S M，Kok K H，Jaume M.et al.Toll-like receptor 10is involved in induction of innate immune responses to influenza virus infection［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（10）：3793-3798.

［12］Regan T，Nally K.Identification of TLR10as a key mediator of the inflammatory response toListeriamonocytogenesin intestinal epithelial cells and macrophages［J］.J Immunol，2013；191（12）：6084-6092.

［13］曹隨忠，李計尚，張 于，等.TLRs基因在牦牛雄性生殖器官中表達(dá)情況的檢測［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2014，44（2）；193-198.

［14］翠 霞，王洪梅，李建斌.荷斯坦牛TLR2基因遺傳多態(tài)性與乳腺炎抗性關(guān)系［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2008，23（5）：35-39.

［15］Opsal M A，Vage D l，Haves B，et al.Genomic organization and transcript profiling of the bovine toll-like receptor gene cluster TLR6-TLRl-TLRl0［J］.Gene，2006，384：45-50.

［16］Kim S K，Kim Y O，Lee B C，et al.Toll-like receptor 10-1-6 gene cluster polymorphisms are not associated with benign prostatic hyperplasia in korean population［J］.Int Neurourol J，2014，18（1）：10-15.

［17］Mikacenic C，Reiner Alexander P，Holden Tarah D.Variation in the TLR10／TLR1／TLR6locus is the major genetic determinant of inter-individual difference in TLR1／2-mediated responses［J］.Genes Immun，2013，14（1）：52-57.