紅景天提取物體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用機(jī)制研究

王媛媛，林 宏

(天津市兒童醫(yī)院，天津 300074)

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實(shí)驗(yàn)研究

紅景天提取物體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用機(jī)制研究

王媛媛，林 宏*

(天津市兒童醫(yī)院，天津 300074)

目的：研究紅景天提取物體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用機(jī)制。方法：采用MTT、劃痕實(shí)驗(yàn)、matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)、血管生成實(shí)驗(yàn)及Western blot蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)紅景天提取物不同濃度對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的細(xì)胞毒作用、侵襲能力、遷移能力和血管生成能力的影響。結(jié)果：紅景天提取物40 mg/ml對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及HUVEC均無毒性，在不同濃度下均能抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲、遷移能力及HUVEC血管生成能力，并能顯著性抑制PI3K/Akt信號(hào)通路Akt及PKCζ蛋白磷酸化水平。結(jié)論:紅景天提取物能夠從抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移及血管生成多方面發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用,并通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

紅景天提取物，乳腺癌細(xì)胞，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，血管生成

紅景天為景天科景天屬(RhodiolaroseaL)多年生草本或亞灌木珍稀野生植物，多生長(zhǎng)在海拔3 500～5 000 m的高山流石或灌木叢中[1,2]。研究結(jié)果顯示，紅景天中含有多種化合物，其中紅景天苷是迄今研究最多的有效活性成分，已被廣泛用于預(yù)防高原病、抗衰老、抗抑郁、抗腫瘤及消除疲勞等方面。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅景天苷可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[3]。但目前關(guān)于紅景天對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究較少。本文以人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)紅景天提取物體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；人臍靜脈上皮細(xì)胞(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)。

1.2 試劑與藥品 狹葉紅景天(四川艾麗碧絲制藥有限公司)；RPMI1640培養(yǎng)液 (HyClone)；胎牛血清(Bioind)；PBS(HyClone)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Sigma)；(含25%EDTA)胰蛋白酶(Bioind)；基底膠matrigel(Invitrogen)；HUVEC培養(yǎng)液(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)。

1.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heal Force公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)板分析儀(BIO-RAD公司)；倒置顯微鏡 (Olympus公司)；電泳儀(美國伯樂公司)；Transwell小室(Corning)；培養(yǎng)皿、96孔酶標(biāo)板、6孔板(Nest)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 紅景天提取物的制備 取20 g狹葉紅景天，用粉碎機(jī)粉碎后置于圓底燒瓶中，加入10倍體積的95%乙醇，80 ℃水浴加熱回流1 h，用紗布過濾提取液。殘?jiān)性偌尤?倍體積的75%乙醇，80 ℃水浴加熱回流1 h，用紗布過濾提取液。殘?jiān)性偌尤?倍體積的50%乙醇，80 ℃水浴加熱回流1 h，用紗布過濾提取液。殘?jiān)凶詈蠹尤?倍量水，80 ℃水浴加熱回流1 h，用紗布過濾提取液。將四次提取液混合，減壓濃縮，65 ℃真空干燥箱內(nèi)真空干燥過夜，得到6 g干粉樣提取物，經(jīng)檢測(cè)，每1 mg干粉含紅景天苷16.0 μg。使用時(shí)紅景天提取物用二甲基亞砜(DMSO)溶解成高濃度儲(chǔ)備液，再用培養(yǎng)液稀釋成相應(yīng)濃度作用于細(xì)胞，其DMSO含量小于0.1%。以此制得高、中、低三個(gè)濃度分別為10、20和40 mg/ml的紅景天提取物溶液。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞和HUVEC分別用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液和含10%血清的HUVEC專用培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，待其長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶消化液約2 ml，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，終止消化，小心去除消化液，加入6 ml培養(yǎng)液反復(fù)吹打，使細(xì)胞從皿底脫落后，形成細(xì)胞懸液，鏡下觀察細(xì)胞。等份分裝3～4皿，繼續(xù)放于37 ℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

2.3 MTT細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞用0.25%胰酶消化，吸出胰酶后，用含10%FBS的培養(yǎng)液終止消化，混勻細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml。將調(diào)好的細(xì)胞懸液加于96孔板，每孔180 μl，置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，24 h后加藥，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。之后每孔加5 mg/ml的MTT 15 μl，37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，4 h后取出96板，將上清液吸出，每孔加100 μl的DMSO，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。抑制率 (%) =[1-(加藥組OD值/空白組OD值)]×100%。

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，均勻接種于六孔板中；待細(xì)胞長(zhǎng)至完全融合后，用10 μl無菌槍頭在每孔單層細(xì)胞中央輕輕地劃一道傷痕，沿劃痕邊緣等距離間隔做上標(biāo)記，以便檢測(cè)；PBS沖洗，換液后分別用不同濃度的化合物處理24 h；然后用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合程度并拍照，利用IPPWIN60統(tǒng)計(jì)劃痕距離，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，抑制率 (%) =[1-(空白組0 h距離-加藥組24 h距離)/(空白組0 h距離-空白組24 h距離)]×100%。

2.5 Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)開始前6 h，將matrigel用PBS稀釋8倍后加入到Transwell小室的上室，50 μl/小室，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)6 h，讓matrigel凝固，6 h后將加藥處理24 h的細(xì)胞消化后離心棄去培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/ml；取細(xì)胞懸液100 μl加入Transwell小室的上室，下室一般加入650 μl含10% FBS的培養(yǎng)基，同時(shí)上下室各加入終濃度相同的待處理化合物；37 ℃、5%CO2培養(yǎng) 18 h后，棄去上室液體，用棉簽擦去膜上未遷移的細(xì)胞和matrigel；用PBS洗2遍，90%乙醇固定30 min，0.5%曙紅染色20 min后，倒置顯微鏡下直接觀察穿過膜的細(xì)胞；每張膜中央部分和周圍部分各隨機(jī)取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的穿過8 μm微孔的細(xì)胞數(shù)，抑制率 (%) =[1-(加藥組細(xì)胞數(shù)/空白組細(xì)胞數(shù))]×100%。

2.6 血管生成實(shí)驗(yàn) 血管生成實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[4]，稍有改進(jìn)。matrigel膠于4 ℃過夜融化，同時(shí)將槍頭和96孔板于-20 ℃預(yù)冷備用；實(shí)驗(yàn)時(shí)將預(yù)冷的96孔板置于冰上，用預(yù)冷的槍頭吸取matrigel膠50 μl/well加入到孔中并避免氣泡形成，然后將96孔板放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，放置1 h使膠凝固；已用不同濃度化合物共培養(yǎng)24 h的HUVEC細(xì)胞，用胰酶消化，計(jì)數(shù)并稀釋，將密度為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞100 μl/well接種于預(yù)先鋪好的matrigel上，繼續(xù)培養(yǎng)12 h；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的變化并拍照記錄小管形成情況,每孔隨機(jī)攝取3個(gè)視野，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn) 加藥處理24 h的細(xì)胞加裂解液裂解后，12 000 r/min離心20 min，取上清，加入5×蛋白上樣緩沖液95 ℃沸煮5 min后在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后用5%的脫脂牛奶封閉1 h，洗膜后分別加入Akt、PKCζ和β-actin的抗體，濃度為1∶1 000稀釋，4 ℃過夜。再次洗膜后加入第二抗體進(jìn)行反應(yīng)，室溫孵育1 h，洗膜后ECL熒光顯色和曝光。利用圖像分析系統(tǒng)確定X線光膠片上蛋白條帶的相對(duì)灰度。

3 結(jié)果

3.1 紅景天提取物對(duì)細(xì)胞的毒性作用 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了紅景天提取物低、中、高三個(gè)濃度(10、20和40 mg/ml)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和人HUVEC細(xì)胞的毒性，提取物與細(xì)胞共孵育24 h后采用MTT比色法檢測(cè)提取物各濃度下對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，用吸光度值(OD值)按照抑制率計(jì)算公式計(jì)算抑制率，結(jié)果見表1，紅景天提取物各濃度對(duì)兩種細(xì)胞系均未顯示出顯著的細(xì)胞毒性作用。

3.2 紅景天提取物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)(又稱傷口愈合實(shí)驗(yàn))是檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的一種方法。在沒有誘導(dǎo)因子的情況下，細(xì)胞可以感受到“傷口”，并通過重組微管組織中心沿垂直于傷口劃痕的方向運(yùn)動(dòng)。

本實(shí)驗(yàn)采用該方法為評(píng)價(jià)手段，測(cè)定紅景天提取物在非細(xì)胞毒劑量下對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響。待細(xì)胞單層貼壁后用槍頭均勻的劃出一道傷痕，同時(shí)給予各濃度紅景天提取物與細(xì)胞共培養(yǎng)，24 h后觀察傷痕愈合情況，用微鏡測(cè)微尺測(cè)量?jī)商巶蹖挾?，見圖1，各給藥組的傷痕寬度均比空白組寬，且具有顯著性差異(P<0.01)。此外，三個(gè)劑量組分別與空白組比較，計(jì)算紅景天提取物對(duì)MDA-MB-231遷移能力的抑制率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。紅景天提取物各濃度組劑量依賴性抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移，其40 mg/ml濃度下的抑制率為93.75%，顯示出極強(qiáng)的抑制作用。

表1 紅景天提取物對(duì)MDAMB231和HUVEC的細(xì)胞毒性

圖1 紅景天提取物對(duì)MDA-MB-231遷移能力的影響

圖2 紅景天提取物對(duì)MDA-MB-231遷移能力的抑制率

3.3 紅景天提取物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響 人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，是一種細(xì)胞外基質(zhì)，主要成分為層黏連蛋白和Ⅳ型膠原，能在培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似，當(dāng)Transwell小室上室濾膜被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運(yùn)動(dòng)才能穿過這種鋪有Martrigel的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似，見圖3。利用該實(shí)驗(yàn)觀察紅景天提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231侵襲能力的影響，計(jì)數(shù)給藥孵育24 h的細(xì)胞穿過Matrigel的數(shù)量，各給藥組的細(xì)胞數(shù)與空白組比較均有顯著性差異(P<0.01)。抑制率結(jié)果顯示紅景天提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力具有顯著的抑制作用，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，見圖4。

圖3 紅景天提取物對(duì)MDA-MB-231侵襲能力的影響

圖4 紅景天提取物對(duì)MDA-MB-231侵襲能力的抑制率

3.4 紅景天提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞血管生成能力的影響 腫瘤的血管生成是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，包括內(nèi)皮細(xì)胞釋放蛋白酶、基底膜降解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔。腫瘤的生長(zhǎng)是血管依賴性的，因而血管化的腫瘤生長(zhǎng)速度加快且易發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此通過抑制新生血管的形成來治療腫瘤，已經(jīng)成為腫瘤治療的新策略。本試驗(yàn)利用人HUVEC體外血管生成實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)的血管生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅景天提取物能夠有效地抑制HUVEC血管生成的能力，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，在高濃度作用下已經(jīng)完全抑制了HUVEC細(xì)胞小管的形成，見圖5。

圖5 紅景天提取物對(duì)HUVEC血管生成的抑制作用

3.5 紅景天提取物對(duì)相關(guān)蛋白磷酸化的影響 基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文進(jìn)一步就紅景天提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制作用機(jī)制進(jìn)行了研究，利用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了紅景天提取物對(duì)與腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白硫酸化水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅景天提取物能夠有效地抑制MDA-MB-231細(xì)胞的Akt及PKCζ的磷酸化水平，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，見圖6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次平行實(shí)驗(yàn)的均值。以誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差，低、中、高劑量組與空白組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為P<0.05、P<0.01和P<0.001。

圖6 紅景天提取物對(duì)Akt、PKCζ蛋白磷酸化水平的影響

4 討論

紅景天在民間被稱為“黃金根”，顯示出其重要的藥用價(jià)值。我國紅景天資源豐富，分布廣泛，作為藥用植物入藥應(yīng)用歷史悠久。近代藥理學(xué)研究顯示，其不僅在體外有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，如Hela細(xì)胞[5]、肝癌QGY-7703細(xì)胞[6]、肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1[7]，而且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也顯示出很好的抑瘤作用。實(shí)驗(yàn)研究顯示，不同劑量的紅景天苷能夠劑量依賴性抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的c-myc表達(dá)，降低肝癌的惡性程度[8]。體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，紅景天提取物能夠抑制裸鼠乳腺癌移植瘤的VEGF蛋白表達(dá)，提示其在體內(nèi)可能具有抑制腫瘤血管生成的作用[9]；此外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察紅景天提取物經(jīng)灌胃給藥處理對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用，結(jié)果顯示紅景天組的抑瘤率達(dá)到了70.9%，顯示出極好的腫瘤抑制作用[10]。

紅景天臨床應(yīng)用上主要集中在心腦血管疾病方面，其抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)報(bào)道較多，但其臨床應(yīng)用報(bào)道少見，目前仍處于輔助用藥的地位。雖然紅景天抗腫瘤作用的報(bào)道較多，但多為宏觀效果的報(bào)道，其具體的抗腫瘤作用機(jī)制研究較少，本實(shí)驗(yàn)著重對(duì)紅景天提取物對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面做了深入探討，就腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲及血管生成三個(gè)方面，從腫瘤轉(zhuǎn)移必經(jīng)的幾個(gè)階段對(duì)其進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅景天提取物在無細(xì)胞劑量下劑量依賴性抑制腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231的遷移、侵襲及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的血管生成，進(jìn)一步機(jī)制研究顯示，紅景天提取物能夠劑量依賴地抑制腫瘤轉(zhuǎn)移重要信號(hào)通路PI3K/Akt的蛋白磷酸化，顯示出顯著的抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。

腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征，是引起惡性腫瘤患者死亡的首要因素，如果能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，就能顯著地降低腫瘤的致死率。因此，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物的研究也成了近年研究熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)紅景天提取物抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制進(jìn)行了探討，將為其應(yīng)用與臨床治療腫瘤提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)，使其更好地應(yīng)用于臨床。

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Mechanism of anti-tumor metastasis forRhodiolaextraction in vitro

Wang Yuanyuan，Lin Hong

(Tianjin Children′s Hosptial, Tianjin 300074)

Objective：To study the mechanism of anti-tumor metastasis forRhodiolaextraction in vitro. Methods：The effects ofRhodiolaextraction on cytotoxicity, cell migration, invasion, tube formation and the phosphorylation of protein of human breast cancer cell(MDA-MB-231) and human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) were measured by MTT assay, wound healing assay, invasion assay, tube formation assay and western blot assay, respectively. Results：Rhodiolaextraction exhibited no cytotoxicity for MDA-MB-231 and HUVEC cells at 40 mg/ml, and inhibited cell migration, invasion and tube formation with various concentrations. Furthermore,Rhodiolaextraction also decreased phosphorylation of Akt and PKCζ on PI3K/Akt signaling pathway significantly. Conclusion：Rhodiolaextraction can suppress anti-tumor metastasis by inhibiting cancer cell migration, invasion, tube formation, and the PI3k/Akt signaling pathway.

Rhodiolaextraction， breast cancer cell，HUVEC，anti-tumor metastasis， tube formation

2015-09-17

R979.1

A

1006-5687(2015)06-0001-05

*通訊作者：林宏，E-mail：jane1523@163.com。